Monitoring Cell-autonome circadiane klok Rhythms of genexpressie met behulp van Luciferase Bioluminescentie Reporters

Samenvatting

Circadiane klokken functioneren binnen de individuele cellen, dat wil zeggen, ze zijn cel-autonoom. We beschrijven werkwijzen voor het genereren van cel-autonome klok modellen niet-invasieve, luciferase-gebaseerde real-time bioluminescentie technologie. Reporter cellen handelbaar, functionele modelsystemen voor het bestuderen van circadiane biologie.

Samenvatting

In zoogdieren, zijn veel aspecten van het gedrag en de fysiologie, zoals slaap-waak cyclus en de lever metabolisme gereguleerd door endogene circadiane klokken (beoordeeld ^1,2). De circadiane tijdwaarneming systeem is een hiërarchisch multi-oscillator-netwerk, met de centrale klok in de suprachiasmatische kern (SCN) synchroniseren en coördineren van extra-SCN en perifere klokken elders ^1,2. Individuele cellen de functionele eenheden voor het genereren en onderhouden van circadiane ritmes ^3,4, en deze oscillatoren van verschillende weefseltypen in het organisme hebben een opmerkelijk vergelijkbare biochemische mechanisme van negatieve feedback. Vanwege interacties op het neurale netwerk niveau in de SCN en door ritmische, systemische signalen op de organismaal niveau worden circadiane ritmes op organismaal niveau niet noodzakelijk cel-autonome ^5-7. Vergeleken met traditionele studies van bewegingsactiviteit in vivo en ex vivo SCN explantaten, cell-gebaseerd in vitro assays zorgen voor ontdekking van cel-autonome circadiane gebreken ^5,8. Strategisch, cel-gebaseerde modellen zijn meer experimenteel handelbaarder voor fenotypische karakterisering en snelle ontdekking van de fundamentele klokmechanismen ^5,8-13.

Omdat circadiaanse ritmes zijn dynamische, zijn longitudinale metingen met een hoge temporele resolutie die nodig is om klokfunctie te beoordelen. In de afgelopen jaren is real-time opname met bioluminescentie vuurvlieg luciferase reporter als een gebruikelijke techniek voor het bestuderen circadiane ritmes in zoogdieren ^14,15, omdat het zorgt voor het onderzoek van de persistentie en dynamica van moleculaire ritmes. Om cel-autonome circadiane ritmes van genexpressie controleren, kan luciferase reporters in cellen worden geïntroduceerd via transiënte transfectie ^13,16,17 of stabiele transductie ^5,10,18,19. Hier beschrijven we een stabiele transductie protocol met lentivirus gemedieerde genafgifte. Thij lentivirale vector systeem superieur aan traditionele methoden zoals voorbijgaande transfectie en kiemlijntransmissie vanwege de efficiëntie en de veelzijdigheid en maakt het mogelijk efficiënte levering en stabiele integratie in het gastheergenoom van zowel delende als niet-delende cellen ^20. Zodra een reporter cellijn wordt vastgesteld, kan de dynamiek van klokfunctie worden onderzocht door middel van bioluminescentie opname. We beschrijven eerst de generatie van P (Per2)-d Luc reporter lijnen, en vervolgens presenteren van gegevens uit deze en andere circadiane verslaggevers. In deze testen worden 3T3 muisfibroblasten en U2OS menselijke osteosarcoomcellen als cellulaire modellen. We bespreken ook de verschillende manieren van het gebruik van deze klok modellen in circadiane studies. Hier beschreven methoden kunnen worden toegepast op een grote verscheidenheid aan celtypen om de cellulaire en moleculaire basis van biologische klok bestuderen en kan nuttig zijn in de aanpak van problemen in andere biologische systemen.

Protocol

1. Bouw van Lentivirale Luciferase Reporters

Een zoogdier circadiane reporter construct bevat gewoonlijk een expressie-cassette waarin een circadiane promoter gefuseerd met het luciferase gen. Zowel ligatie en recombinatie gebaseerde strategieën worden gebruikt voor DNA klonering. Als voorbeeld beschrijven we een recombinatie gebaseerde Gateway kloneringswerkwijze voor het genereren van P (Per2)-d Luc reporter lentivirale, waarin het gedestabiliseerd luciferase (Luc d) onder controle van de muis Per2 promoter.

1. Klonering van Per2 promoter. Gebruik PCR de Per2 promoter DNA-fragment van 526 bp amplificeren, stroomopwaarts van de transcriptie startplaats van een muis Per2 BAC kloon ^9-13, met een voorwaartse primer (5'-CTCGAGCGGATTACCGAGGCTGGTCACG TC-3 ') en een reverse primer (5' -CTCGAGTCCCTTGCTCGGCCCGTCAC TTGG-3 ') en kloon in pENTR5'-TOPO vector (Invitrogen) voor het genererenpENTR5'-P (Per2).
2. Klonering van Luc d. De d Luc bevat het vuurvlieg luciferase gen en een C-terminale PEST sequentie voor snelle eiwitafbraak zoals eerder ²¹ beschreven. Gebruik de PCR d Luc DNA fragment en kloon in pENTR / D-TOPO vector (Invitrogen) te versterken tot pENTR / Dd Luc genereren.
3. Bouw van de reporter vector. Meng de twee pENTR plasmiden, pENTR5'-P (Per2) en pENTR / Dd Luc, met de lentivirale vector bestemming pLV7-bsd (BSD, blasticidine resistentiegen), en voer de recombinatie reactie met behulp van Clonase een pLV7-bsd-P genereren (Per2)-Luc reporter d (Figuur 1). pLV7-Bsd is een gemodificeerde versie (in ons laboratorium) van pLenti6/R4R2/V5-DEST (Invitrogen) waarin de bosmarmot hepatitis virus post-transcriptionele regulatoire element (WPRE) sequenties werden ²² direct stroomafwaarts van de expressie ca ssette om genexpressie te versterken.

2. Productie van lentivirale deeltjes

1. Seed 293T cellen (dag 1)

1. Groeien humane embryonale nier (HEK) 293T cellen tot 90-100% confluentie regelmatig DMEM aangevuld met 10% FBS en 1x penicilline-streptomycine-glutamine (PSG) op 10 cm kweekschalen. (Snel groeiende cellen met een lage passage nummer zijn van cruciaal belang voor een efficiënte transfectie.)
2. Voorafgaand aan enten van de cellen voor transfectie coat 6-well kweekplaten door 1 ml van 0,001% poly-L-lysine in PBS aan elk putje en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Zuig de oplossing en spoel eenmaal met 1x PBS voor gebruik.
3. Dissociëren 293T cellen met trypsine en zaad 0,75 x 10 ⁶ cellen op elk putje van de pre-beklede platen met 2 ml DMEM regelmatige. Schud de platen zorgvuldig tot een gelijkmatige verdeling van cellen te verkrijgen in elk putje. Groeien de cellen in de incubator bij 37 ° C geroerd.

tap "> 2. Transiënte transfectie Via Capo ₄ / DNA precipitatie (dag 2)

1. Let op de gezaaide cellen vanaf dag 1. Cell moeten bereiken samenvloeiing van 80-90%.
2. Bereid plasmide transfectie mix in een 1,5 ml microcentrifugebuis door 2 pg van een lentivirale reporterplasmide DNA (bijvoorbeeld pLV7-P (Per2)-Luc d, Liu lab) en de 3 verpakking vectoren (1,3 ug Gag / Pol, 0,5 ug rev, en 0,7 ug VSVG, Invitrogen). Als controle voor zowel transfectie en de daaropvolgende infectie we gewoonlijk een extra goed in transfectie voor een lentivirale GFP expressie vector, pLV156-CMV-EGFP (Figuur 1A), herbergt versterkt groen fluorescent eiwit (EGFP) onder de controle van de CMV promoter zoals eerder ²⁰ beschreven.
3. Voeg 100 ul van 0,25 M _CaCl2 (verdund met DNase / RNase-vrij ddH ₂ O van 2,5 M voorraad) om het plasmide mix in stap 2 en meng. Voeg 100 ul 2x BBS oplossing (50 mM BES, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na ₂ HPO _4, pH 6,95) en meng voorzichtig maar grondig. Incubeer de DNA mix bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
4. Tijdens het wachten, aspireer medium van 293T-cellen en veranderen in 2 ml vers medium. De plaat terug in de incubator gedurende ten minste 10 min tot pH evenwicht medium voor transfectie.
5. Voeg transfectie mix van stap 3 tot en met 293T cellen druppelsgewijs. Swirl de plaat voorzichtig en let deeltjesvorming onder een microscoop. Incubeer bij _5% CO2, 37 ° C overnacht. (Schone deeltjesvorming van Capo ₄ / DNA precipitaat is cruciaal voor efficiënte transfectie.)

3. Oogst virale deeltjes (dagen 3-4)

1. Ongeveer 16 uur na transfectie (dag 3) tegen die tijd moeten cellen tot 100% confluentie zuigen medium van cellen en vervangen door 2 ml vers DMEM regelmatige. Incubeer bij 37 ° C geroerd.
2. Op dag 4, beoordelen transfectie-efficiëntie door het observeren van EGFP expressie in transfection controle cellen (transfectie-efficiëntie van 90-100% met een hoge EGFP expressie is een betrouwbare voorspeller van een goede virale prep.)
3. Verzamel het medium dat uitgescheiden, infectieuze virusdeeltjes. Centrifugeer bij> 2000 xg gedurende 5 minuten om resterende 293T cellen te verwijderen en de virus-bevattende supernatant verzameld. Alternatief kan het medium worden gewist met een 0,45 urn membraanfilter. De virale deeltjes zijn klaar voor gebruik in infectie.

3. Infectie van cellen 3T3

1. Seed 3T3 cellen (dag 3)

Split en zaad juiste nummer (~ 12.000) van de 3T3 cellen op een 12-well plaat tot 20-30% confluentie te krijgen door het volgende dag. Incubeer bij 37 ° C geroerd.

2. Infect 3T3 cellen (dag 4)

1. Let op de gezaaide cellen. Samenvloeiing van 20-30% (minder dan 50%) gewenst is voor infectie.
2. Voeg polybreen tot een eindconcentratie van 5 pg / ml om de verzamelde medium die viraledeeltjes. Meng goed door pipetteren.
3. Zuigen medium van 3T3-cellen en voeg 1 ml van de bovenstaande virale mengsel per well. Incubeer bij 37 ° C geroerd. (Polybreen wordt gebruikt om infectie-efficiëntie te verbeteren, maar is niet absoluut noodzakelijk. Aangezien het soms giftig zijn voor bepaalde cellen, voorafgaand testen aanbevolen.)

3. Selecteer geïnfecteerde cellen (dag 5 en hoger)

1. Vierentwintig uur na de infectie, te zuigen medium dat virus en polybreen uit de geïnfecteerde cellen eenmaal gewassen met 1x PBS en veranderen vers medium. Incubeer bij 37 ° C overnacht voor herstel en groei.
2. Wanneer confluent (gewoonlijk 1-2 dagen later), de cellen en incubeer gesplitst bij 37 ° C geïncubeerd.
3. De volgende dag opgezogen medium van cellen (<50% confluentie gewenst is) en vervangen door vers medium dat 10 ug / ml Blasticidine te selecteren op stabiel getransduceerde cellen. (Blasticidine kill-curve moet empirisch worden bepaald voor een bepaalde cellijn.)
4. Ga verder met vers medium met Blasticidine om de 2-3 dagen voor continue selectie van antibiotica-resistente cellen die klok verslaggevers (meestal 4-6 dagen in totaal).

4. Registratie van bioluminescentie Reporter Cells

1. Zaad reporter cellen

Propageren Blasticidine-resistente reporter cellen en splitsen op 35-mm cultuur gerechten. Incubeer bij 37 ° C tot confluent. We meestal voor te bereiden ≥ 3 gerechten voor elke reporter cellijn onder elke voorwaarde voor circadiane fenotypering.

2. Synchronisatie en wijziging opnamemedium

1. Zuigen medium van confluente reporter cellen eenmaal gewassen met PBS, en vervangen met DMEM dat 10 pM forskoline (of 200 nM dexamethason). Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur om de cellen te synchroniseren. (Als alternatief kunnen cellen worden gesynchroniseerd door de temperatuur cycli ²³ of serum shock ^24.)
2. Tijdens het wachten, voor te bereiden opnemening medium voor 3T3 cellen als volgt: 1x DMEM (HyClone) met 10% FBS, 1x Pen / Strep / Gln, 1 uM forskoline, 1 mM luciferine, 25 mM HEPES, pH 7,4. Serum en forskoline concentratie kan empirisch worden bepaald. Voor zeer zwak cellen kunnen fenolrood-vrij medium gebruikt.
3. Eind forskoline behandeling zuigen medium en vervangen met vers gemaakte opnamemedium.

3. Bioluminescentie opname van cellen reporter

1. Na medium verandering, bedek de cultuur gerechten met 40 mm steriele dekglaasjes en afdichting op zijn plaats met vacuüm vet om verdamping te voorkomen.
2. Plaats de gerechten op de LumiCycle luminometer, die binnen een set incubator bewaard bij 36 ° C zonder H ₂ O of CO _2.
3. Start real-time bioluminescentie opname. We nemen meestal ritmen voor 1 week, gevolgd door medium verandering en voortdurende opname van een tweede week (zie Savelyev et al.. Voor details) ^25. (Voor het opnemen van 96-wijll platen, Synergy SL2 werd gebruikt als de opname-inrichting, zie Discussion 1.1 voor details).

5. Data-analyse en presentatie

Reporter cellen vergemakkelijken hoge resolutie kwantitatieve luminescentie-opname, van cruciaal belang voor het bepalen van fenotypische effecten op de circadiane klok functie. Om circadiane parameters, inclusief fase, periode lengte, ritme amplitude en remcilinder te verkrijgen, gebruiken we de LumiCycle Analysis programma (Actimetrics) te analyseren bioluminescentie data ^5,14. Kort ruwe data zijn gemonteerd volgens basislijn eerste en basislijn-gecorrigeerde data worden gemonteerd op een sinusgolf waarvan de parameters worden bepaald. Voor monsters die hardnekkige ritmes, goodness-of-fit van> 90% wordt gewoonlijk bereikt te tonen. Vanwege de hoge voorbijgaande bioluminescentie op medium verandering, we meestal uitgesloten van de eerste cyclus van de gegevens van de analyse.

Voor de presentatie van gegevens, we meestal plotten ruwe data (bioluminescentie, tellingen / sec) tegen time (dagen). Noodzakelijk is, kan de basislijn-gecorrigeerde gegevens worden uitgezet om amplitude en fase te vergelijken.

6. Representatieve resultaten

1. Fase-specifieke circadiane verslaggevers

De circadiane klok is gebaseerd op een biochemisch mechanisme van negatieve feedback ^1. De kern bestaat uit terugkoppellus transcriptieactivatoren Bmal1 en CLOCK, en repressoren pers en Crys, die inwerken op de circadiane E / E'-box enhancer elementen ritmische genexpressie (met ochtend fase, bijvoorbeeld Rev-erb α) produceren. De kern loop regelt en integreert ten minste twee andere circadiane cis-elementen de DBP/E4BP4 inbindelement (D-box, voor dagen fase, bijvoorbeeld Per3) en de ROR / REV-ERB binding element (RRE, voor nacht fase, bijvoorbeeld Bmal1) ^17. Combinatoriële regulatie door meerdere circadiane elementen genereren nieuw tussenproduct fasen. Bijvoorbeeld Cry1 transcriptietie wordt gemedieerd door drie circadiane elementen (bijvoorbeeld E / E'-box en D-box elementen in de promoter en RREs in het eerste intron van het gen Cry1), die tot de afzonderlijke Cry1 avond-fase ^13.

Op basis van deze mechanismen van genregulatie genereerden we vier verschillende reporter constructen: P (Per2)-d Luc en P (Cry1)-d Luc reporters die zowel E / E'-box en D-box elementen in het regulerende gebied ^{17, 26,27,} P (Cry1) - Intron-d Luc vertegenwoordigen combinatorische verordening door alle drie elementen (dwz, E / E'-box, D-box, en RRE) ^13,17, en P (Bmal1)-d Luc gereglementeerde uitsluitend RRE ^9,17,19,21. We deze rapporteurs ingebracht in 3T3-cellen de verwachte afzonderlijke fasen van reporterexpressie (figuur 2) te produceren.

2. Gene knockdown via RNAi en farmacologisch active verbindingen

Wanneer transfectie-efficiëntie hoog is, kunnen synthetische siRNA tijdelijk worden getransfecteerd in cellen af ​​te breken genexpressie. Bij transfectie is technisch moeilijk kan een shRNA expressievector stabiel getransduceerd in cellen via lentivirale infectie, zodat shRNA door de cel wordt verwerkt tot siRNA voor gen knockdown (KD). We presenteren KD effecten van Cry1 en Cry2 genen gebruik siRNA in U2OS cellen (Figuur 3A) en shRNA in 3T3 cellen met een expressievector pLL3.7 Gateway ⁹ (Fig. 3B). Naast 3T3 cellen, is de U2OS model wordt een prominente cellulaire klok model grotendeels omdat het de belangrijkste vereisten voor high-throughput screening van commercieel verkrijgbare humane siRNA bibliotheken (bijvoorbeeld menselijke oorsprong, kunnen genereren robuuste circadiaanse ritmes, gevalideerde functie voldoet alle bekende klokgenen, en vatbaar voor efficiënte transfectie enkwantitatieve luminescentie opname). In beide celtypen, RNAi-gemedieerde KD geleid klok fenotypes overeenstemming met eerdere muis knockout (KO) en cellulaire KD studies ^5,10,11,28. Bijvoorbeeld, Cry1 KD verkort periode lengte en vermindert ritme volharding nodig, terwijl Cry2 KD verlengt periode. Bovendien kunnen kleine moleculen geselecteerd worden om farmacologisch doel en verstoren eiwitfunctie (Figuur 3C).

Figuur 1. De lentivirus gemedieerde genafgiftesysteem. (A) Schematische weergave van twee lentivirale P (Per2)-d Luc reporter vectoren en een CMV-EGFP construeren. Alleen het gebied voor integratie in het gastheercelgenoom wordt. In beide reporter-constructen, de transcriptie van d Luc staat onder directe controle van de Per2 promotor. In de pLV7-BSD-P (Per2)-d Luc vector (recombinatie gebaseerde klonen), een co-expressie gebracht Blasticidine resistentiegen (BSD) faciliteert selectie van geïnfecteerde cellen. In de pLV156-P (Per2)-d Luc vector (ligatie gebaseerde klonen), wordt EGFP vertaling gemedieerd door een interne ribosoom ingangsplaats (IRES) stroomafwaarts van d Luc, waardoor visuele waarneming en FACS sortering van geïnfecteerde cellen. Daarnaast is een SV40 promoter / terminator (P / T) wordt gebruikt als een isolator (zie bespreking 1.3). In de CMV-EGFP controlevector, EGFP expressie onder controle van een sterke CMV promoter. (B) fluorescerende beelden van getransfecteerde en geïnfecteerde GFP tot expressie brengende cellen. Typisch bereiken wij een hoge efficiëntie, zowel in transiënte transfectie van 293T-cellen en lentivirale infectie van cellijnen van onze interesse, zoals door GFP-expressie in deze cellen. Klik hier om groter bedrag bekijken .

Figuur 2. Fase-specifieke expressie van bioluminescentie reporters in 3T3 cellen De lentivirale reporter vectoren die in dit experiment zijn pLV7-Bsd-P (Per2)-d Luc, P (Cry1)-d Luc, P (Cry1) -. Intron-d Luc, en P (Bmal1)-d Luc. Elke reporter er een duidelijke fase van oscillatie, zoals aangegeven door de pijlen. Terwijl de Per2 en Cry1 promotors rijden piek bioluminescentie 's morgens-dag fasen en de Bmal1 promotor' s nachts fase, combinatorische regulering door de P (Cry1) - Intron herbergen E-box, D-box, en RRE elementen verleent avond fase van piek bioluminescentie . Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 3. Genetische en farmacologisch verstoring van circadiane ritmen bij bioluminescentie reporter cellen. (A) Effecten van Cry1 en Cry2 knockdown door siRNA's op cellulair ritmes van U2OS reporter cellen. De LumiCycle luminometer werd gebruikt voor bioluminescentie opnemen van cellen in 35 mm schalen. Figuur is ingericht van Reference # 10, met toestemming van Elsevier (2009). (B) Effecten van Cry2 knockdown door shRNAs op cellulaire ritmes van 3T3 reporter cellen. Een pLL3.7 Gateway vector die een shRNA U6-cassette werd gebruikt voor Cry2 gen knockdown. shRNA2 een betere efficiëntie dan knockdown shRNA1 zoals bepaald door Western blot analyse (gegevens niet getoond). Een Synergy luminometer werd gebruikt voor bioluminescentie opname van cellen in een 96-well plaat. De instellingen voor opname zijn:. Incubator temperatuur 33 ° C, integratietijd, 15 sec; interval van 30 min (C) Effecten van kleine molecule inhibitoren op cellular ritmes van U2OS reporter cellen. Chir99021 en roscovitine remmers tegen GSK-3 en CDK respectievelijk. Het ViewLux systeem (Chir99021 assay) en een Tecan luminometer (roscovitine assay) werden gebruikt voor bioluminescentie opnamen van cellen in 384 putjes. Figuur is een bewerking van Reference # 19 (Copyright 2008 National Academy of Sciences, USA). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Discussie

1. Wijzigingen aan huidige protocol

1.1 Opname apparaten en doorvoer overwegingen

Vanwege de commerciële beschikbaarheid, heeft de LumiCycle (Actimetrics) uitgegroeid tot de meest gebruikte automatische luminometer apparaat voor real-time opname ^{4,5,9,19,29-31.} De LumiCycle werken fotomultiplicatorbuizen (PMTs) als lichtdetectoren, die zeer hoge gevoeligheid en weinig ruis ^{14 te} verschaffen, en is daarom bijzonder geschikt voor data-acquisitie va...

Materialen

Naam van het reagens	Vennootschap	Catalogusnummer	Reacties
DMEM	HyClone	SH30243FS	Voor reguliere celgroei
DMEM	Invitrogen	12100-046	Voor luminometry
FBS	HyClone	SH3091003
Pen / Strep / Gin (100x)	HyClone	SV3008201
B-27	Invitrogen	17504-044
D-Luciferin	Biosynth	L-8220
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Polybreen	Millipore	TR-1003-G
Forskoline	Sigma	F6886
Alle andere chemicaliën	Sigma
			Uitrusting
Weefselkweek incubator			5% CO2 bij 37 ° C
Weefselkweek kap			BSL-2 gecertificeerd
Light & fluorescentiemicroscoop			Fasecontrast optionele
LumiCycle	Actimetrics