Methodenartikel

Subretinale Injectie van gentherapievectoren en stamcellen in de Mouse Eye

DOI:

10.3791/4286

⸱

25 november 2012

 ,  ,  ,  , 
1Bernard and Shirlee Brown Glaucoma Laboratory, Department of Ophthalmology, Columbia University , 2Institute of Human Nutrition, College of Physicians & Surgeons, Columbia University , 3Omics Laboratory, University of Iowa , 4Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Iowa

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze chirurgische techniek illustreert de injectie van gentherapievectoren en stamcellen in de subretinale ruimte van de muis oog.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het verlies van het gezichtsvermogen treft ongeveer 3,4 miljoen mensen in de Verenigde Staten en zal naar verwachting toenemen in de komende jaren. 1 Onlangs, gentherapie en stamceltransplantaties zijn geworden belangrijke therapeutische instrumenten voor de behandeling van blindheid als gevolg van retinale degeneratieve ziekten. Verschillende vormen van autologe transplantatie voor leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD), zoals iris pigment epitheelcellen transplantatie hebben bemoedigende resultaten gegenereerd en klinische proeven begonnen voor andere vormen van gen en stamceltherapieën. Twee waaronder RPE65 genvervanging bij patiënten met congenitale amaurosis Leber en een RPE celtransplantatie met humane embryonale stamcellen (ES) cellen bij de ziekte van Stargardt. 3-4 Nu er gentherapievectoren en stamcellen voor behandeling van patiënten met retinale ziekten is het belangrijk te verifiëren deze potentiële therapieën in diermodellen voor toepassingden om in menselijke studies. De muis is een belangrijke wetenschappelijke model voor het testen van de therapeutische werkzaamheid van gentherapievectoren en stamceltransplantatie in het oog. 5-8 in dit video artikel zullen we een techniek om gentherapievectoren of stamcellen injecteren in de subretinale ruimte van de muis oog terwijl het minimaliseren van schade aan het omringende weefsel.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Monteer Inrichtingen voor de subretinale Injectie

  1. Koop of maak een 100 um diameter naald uit een glazen capillaire buis. Dit kan handmatig worden gedaan met behulp van een Sutter P-97 pipet trekker of ander soortgelijk materieel. Het einde van de capillaire buis wordt verwarmd en getrokken tot aan de gewenste diameter (100 pm). Een kleinere diameter naald kan worden gebruikt voor gentherapie vectoren, maar dit is de aanbevolen diameter celinjectie zonder schade aan de cellen of het oog. Vergeleken met stalen naalden, de glazen capillaire naald een zeer fijn maar stomp uiteinde, om voor visualisatie van de injectievloeistof en toegang tot de subretinale ruimte mogelijk zonder dat retinale breuk. Reinig deze getrokken naalden als dat nodig is met behulp van 70% ethanol, en op te slaan in een steriele container. Een 15 cm steriele weefselkweekplaat met tape om de naalden zijn plaats te houden is een manier waarop om de injectienaalden afgedekt en in een steriele omgeving. Op dit punt, complete de set-up in de chirurgische ruimte waar de procedure plaatsvindt. Het eenvoudigste is om alle apparatuur te houden in de operatiekamer te allen tijde in zodat het steriel blijven, vooral als deze procedure wordt gedaan binnen een barrière faciliteit.
  2. Zuig silicone in de injectienaald en verwijder de silicone een coating verlaten langs de binnenwanden van de naald. De siliconencoating maximaliseert de passage van cellen en virussen door de naald boring, die anders zich aan de binnenste glazen capillaire wanden.
  3. Zorg voor een ongeveer 8 cm lengte van steriele plastic buis door te snijden een 25 ¾-gauge bloedafname set met luer-lock op het punt direct na de naald (het verwijderen van de naald uit de slang).
  4. Vul een 1 ml Sub-Q 26 5/8-gauge slip-tip spuit met een steriele zoutoplossing en verwijder de naald van de spuit.
  5. Bevestig de injectienaald aan het afgesneden uiteinde van de plastic buis en bevestig de spuit met de luer-lock aan de andereend.
  6. Zuig steriele zoutoplossing om de dode ruimte in de buis en capillaire naald, het uitwerpen van een aantal fysiologische zoutoplossing door de naald om ervoor te zorgen dat het correct is aangesloten, zonder enige lekkage te vullen. Vervolgens zuigen kleine, ongeveer 1 ui hoeveelheid lucht in de punt van de injectienaald. Deze scheidt de zoutoplossing uit de injectievloeistof en een visueel signaal dat het einde van de injectievloeistof gedurende de chirurgische procedure. De injectie apparatuur moet worden bewaard op een schone ondergrond afgeveegd met 70% ethanol gedurende de chirurgische ingreep. Bovendien moeten alle apparatuur die bij de chirurgische procedure voor en na met 70% ethanol worden gereinigd, behalve de injectienaalden reeds moet blijven steriel en klaar voor gebruik. Deze naalden worden verwijderd na de operatie en niet hergebruikt.
  7. Tenslotte zuigen injectievloeistof die het gewenste verpakte gentherapie virale vector of stamcellen. Dit kan doortoegang tot de injectievloeistof in een steriele pipet, dan pipetteren de oplossing op het oppervlak van een steriele celkweekschaal. De oplossing kan nu gemakkelijk worden opgezogen in de injectienaald met de spuit. De benodigde hoeveelheid zal variëren afhankelijk van de leeftijd van de muis. Voor onze doeleinden gebruiken we postnatale dag 5 muizen, die worden geïnjecteerd met 0,5-0,8 pl injectievloeistof. Kleinere hoeveelheden, 0,5 pl of minder kunnen worden gebruikt voor jonge muizen en grotere hoeveelheden zoals 1 pl, kan worden gebruikt bij volwassen muizen. De virale titer of aantal cellen moet worden bepaald op basis van de virus / cellen worden geïnjecteerd en hun gewenste doelweefsel, kan als te veel virale deeltjes of cellen in een klein volume leidt tot toxiciteit voor de retinacellen. In de video voor visualisatie doeleinden hebben we 1,5 ul, een grotere hoeveelheid kleurstof dan nodig te injecteren in het oog.

2. Toegang tot de subretinale ruimte

  1. Binnen de steriele operatiekamer,stabiliseren of de muis verdoven volgens de lokaal goedgekeurde dier hanteren protocol, dat is afhankelijk van de leeftijd van de muis. Gemeenschappelijke anesthesie voor volwassen muizen omvat het gebruik van isofluraan gas of een intraperitoneale injectie van 0,1 ml/10g lichaamsgewicht van ketamine (100 mg / ml) en xylazine (20 mg / ml) in steriele zoutoplossing. Voor perinatale muizen, gemeenschappelijke anesthesie technieken omvatten het gebruik van isofluraan gas of cryoanesthesia (hypothermie). Alle anesthesie technieken moeten worden goedgekeurd door uw lokale IACUC commissie voor gebruik. We gebruiken meestal postnatale dag (P) 5 muizen, hoewel soortgelijke technieken kunnen worden toegepast op muizen zo jong als P0 of volwassen muizen. De chirurgische procedure kan pas beginnen wanneer de muis niet meer bewegen van de ledematen en niet meer reageert op teen knijpt. Voor perinatale muizen, zullen ze merkbaar lichter van kleur, omdat de bloedstroom zal vertragen, een andere sleutel om te weten dat ze volledig onder narcose.
  2. In perinatale muizen, gebruik Vannas rechte schaar om make een geschatte 1,5 mm incisie langs de gesloten deksel spleet. Voorzichtig te snijden bij de inkeping waar het oog zal uiteraard later weer openen. Dit zorgt ervoor dat de deksels genezen en goed open tijdens de ontwikkeling van de muis. Een chirurgisch mes kan worden gebruikt voor dit doel, hoewel wij er de voorkeur Vannas schaar aangezien zij het risico van doorprikken het oog tijdens de procedure te verminderen. In de video werden de schaar gebruikt om direct doorboren en snede langs de ooglidrand. Bij het leren deze techniek moet forceps worden gebruikt om het ooglid heffen voor het snijden en het risico op beschadiging van het oog te verlagen.
  3. Uit elkaar trekken van de oogleden met gebogen dressing pincet voor het oog proptose en de oogleden knijp lichtjes onder het oog te houden proptosed voor injectie. Of het deksel incisie die in stap twee te groot is, wordt het oog terug glijden onder de deksels en voorkomt adequate blootstelling tijdens de injectieprocedure. Voor volwassen muizen onder lichte druk rond de ogen met dressing tang kan houden in het oog proptosed voor injectie.
  4. Maak een kleine sclerale incisie op of posterieur aan de evenaar van de bol door krassen op het oppervlak met een 15-graden microchirurgie mes. Deze incisie moet alleen groot genoeg zijn om de punt van de injectienaald passeren, maar niet groter dan dat. Indien gewenst kan een kleine scherpe naald zoals een acupunctuurnaald worden gebruikt om deze incisie in de subretinale ruimte plaats van de microchirurgie blad. In donker gepigmenteerde dieren een donkerbruine gepigmenteerde weefsel (choroid-retinal pigment epithelium) zichtbaar op de plaats van incisie. In lichtere gepigmenteerde of albino muizen, kan een chirurgische markeerstift worden toegepast op de punt van het mes microchirurgie een inktvlek waarin de incisieplaats verlaten. Als duidelijk (glasvocht) vloeistof refluxes uit de incisie site, werd het blad geplaatst te diep en ging de glasvochtruimte en de therapeutische virus of cellen kan de intravitreale spatie in te voeren tijdens de injectie. Voor visualizatiaan doelen hebben we de incisie op dit punt in de video. Het is nog steeds mogelijk om te voltooien een subretinale injectie in dit geval echter het netvlies veroorzaakt door de aanwezigheid van de injectievloeistof niet volledig genezen in deze muis. Daarom moet erop worden gelet dat alleen het buitenoppervlak van het oog en niet door de retina snijden voor injectie.
  5. Steek de injectienaald in de incisie site en vooruit het evenwijdig aan de buitenste oog muur om de subretinale spatie in te voeren. Vooruit te dicht bij de buitenwand of te diep in het oog zal direct de injectie in de verkeerde richting. De beste methode om te begrijpen of de naald op de juiste plaats is om te oefenen de techniek. Oefenen op licht gepigmenteerde of albino muizen kan helpen om nauwkeurig en accuraat injecties te maken in de subretinale ruimte. Dit komt omdat de naald en injectievloeistof is zichtbaar in deze ogen.
  6. Druk zachtjes op de zuiger en zijngin injectie van het gewenste fluïdum. Als de naald goed geplaatst binnen de subretinale ruimte, zal een matige tegendruk gevoeld worden. Als de naald in het glasvocht, zal er aanzienlijk minder tegendruk en mogelijk wat vocht reflux tijdens de injectie. Als er significante tegendruk, houdt de naald op zijn plaats gedurende ten minste nog eens 15 seconden voordat de naald langzaam. Hierdoor kan de hoge intraoculaire druk in plaats van gelijk refluxen de geïnjecteerde virus of cellen weer uit de incisieplaats. Sommige van de lucht en zoutoplossing worden geïnjecteerd in de subretinale ruimte door de verhoogde druk vereist tijdens de injectieprocedure. Erop moet worden gelet dat over-spuiten lucht of saline, aangezien het spoelen van de geïnjecteerde virus of cellen van het oog. Het is ook mogelijk om permanent netvliesloslating veroorzaken door de aanwezigheid van te veel vloeistof in de subretinale ruimte. Voor visualisatie doeleinden, werd overmaat kleurstof en lucht ingespoten into de subretinale ruimte in de video. Het is duidelijk te zien hoe een deel van de kleurstof terug worden gespoeld uit de subretinale ruimte als er teveel wordt geïnjecteerd, maar ook hoe de luchtbel blijft in de subretinale ruimte en niet verdwijnt in het glasachtig lichaam. Dit werd gebruikt om te benadrukken dat deze injecties waren allemaal op de juiste locatie van het oog, zodat men kan visualiseren hoe de naald moet de incisie site binnen te gaan. Alle injecties in de subretinale ruimte leiden tot een tijdelijke netvliesloslating door de aanwezigheid van de injectievloeistof. Als de injectie procedure correct voltooid, zal deze tijdelijke netvliesloslating genezen binnen 24 uur en muizen kunnen worden gebruikt voor verdere experimenten. Het oog kan zacht blijven gedurende ongeveer een week aan de chirurgische procedure, waardoor een tweede injectie vermeden worden gedurende deze periode.
  7. Voor neonatale muizen, gebruik maken van de gebogen dressing een tang om duw het oog achter de deksels en in de baan. Het kan nuttigwachten een minuut, zodat het virus te regelen in het subretinale ruimte en niet veroorzaken worden gespoeld de incisieplaats duwen wanneer het oog terug in zijn baan. Na de operatie, een druppel van 0,5% bupivacaïne (Marcaine) verdund tot 0,25% in steriele zoutoplossing van een 25-gauge naald kan worden geplaatst op de injectieplaats. Muizen vertonen geen duidelijke tekenen van nood na subretinale chirurgie en het gebruik van bupivacaïne als een langwerkende actuele pijnstillende is al ruim voldoende voor de drie voorgaande jaren. Muizen altijd worden gecontroleerd na de operatie om te zoeken naar tekenen van nood, zoals infectie, zwelling of een afname van de dagelijkse activiteiten van de muis. In deze gevallen moet de dierenarts worden meegedeeld en verder pijnstillers zoals buprenorfine (0,05 mg / kg) worden toegediend als intraperitoneale injectie.
  8. Wake de muis van anesthesie op basis van lokaal goedgekeurde dieren hanteren protocol. De muis moet worden bewaard op een verwarmings-padvertentie naar een normale lichaamstemperatuur te handhaven als het ontwaakt uit de narcose. De chirurgische procedure duurt minder dan vijf minuten in beslag, nog afgezien van de tijd voor de muis om anesthesie ondergaan. Daarom is een verwarmingselement is niet nodig tijdens de eigenlijke procedure, maar mogelijk nodig terwijl men leren van de techniek als de procedure zou een langere tijd. De muis niet worden teruggeplaatst in een schone kooi totdat het begonnen te bewegen op zichzelf. Voor pasgeborenen, zal zachte teen knijpt helpen voor hen om volledig te herstellen van de narcose, en ze moeten hun roze kleur en beweging te herwinnen voordat ze teruggeplaatst bij de moeder. Muizen moeten worden gecontroleerd na verloop van tijd op tekenen van nood, zoals eerder vermeld.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een tekening van de muis oog wordt met grote structuren gemerkte referentie met pijlen tonen de locaties voor zowel intravitreale injectie en subretinale chirurgische procedures (pijlen, Figuur 1). Gentherapievectoren, zoals lacZ lentivirale vector (Figuur 2), worden geïnjecteerd met deze locaties. Bovendien kunnen stamcellen, zoals muis embryonale stamcellen (figuur 3), worden getransplanteerd in situ in de muis oog.

1 ui van een l...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze video techniek bevat instructies voor het voltooien van de injectie subretinale chirurgische procedure succesvol, en ervoor zorgen dat de vector voor gentherapie of stamcellen worden in de locatie noodzakelijk zijn om doelmatig behandelen oogziektes. Deze techniek maakt de targeting van retinale cellen zoals RPE of de fotoreceptoren, omdat hierdoor de gentherapievectoren of stamcellen afgeleide weefsels in de nabijheid van deze cellen. Vorige methoden te intravitreale injecties, waar de vloeistof wordt geplaatst in...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onderzoek naar blindheid te voorkomen; Experimentele hulp van Takayuki Nagasaki; Dit onderzoek voldoet aan de Arvo verklaring voor het gebruik van dieren in Oogheelkundige en Visual Research. KJW wordt ondersteund door NIH subsidie ​​5T32EY013933 en 5T32DK007647-20. VBM wordt ondersteund door NIH subsidie ​​K08EY020530.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Naam Vennootschap Catalogus Reacties
0,8-1,10 x 100 mm Capillaire buis (glas) Kimble Glass, Inc 34502 99
Flaming / Brown Micropipet Puller Sutter Instrument P-97 Narishige microforge kan in plaats daarvan worden gebruikt. Catalogus # MF-900
Sigmacote Sigma Aldrich SL2-25ML Silicone
Dubecco's fosfaat gebufferde fysiologische zoutoplossing met calciumchloride en magnesiumchloride Gibco-Invitrogen 14040-133
Safety-Lok 25 3/4G x 12 "; bloedafname Set BD Vacutainer 367298
1 ml Sub-Q 265/8G Slip-Tip spuit Becton-Dickinson 309597
0,5-10 ul Finnpipette II Verstelbare-Volume Pipetten Fisherbrand 21-377-815
1 tot 200 ul Natuurlijke Schuine Tips USA Scientific, Inc 1111-1700
Discovery.V8 Stereo Microscope Zeiss MC1500
60 mm x 15 mm Style Behandeld Polystyreen celkweekschaal Corning Incorporated 430166
Vannas Rechte Schaar Storz Ophthalmics E3383 S
Gebogen Dressing Pincet met vertanding Delicate Storz Ophthalmics E1408
15 graden Microchirurgie Knife Wilsop Oogheelkundige Corp 091204
Ketamine Ketaset III NADA # 45 tot 290
Xylazine Lloyd Laboratories NADA # 139 tot 236
Bupivacaïne (Marcaine) AstraZeneca N / A
Buprenorfine Sigma Aldrich B9275

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Prevalence of Blindness Data Tables [NEI Statistics and Data]. , National Eye Insitute. Available from: http://www.nei.nih.gov/eyedata/pbd_tables.asp (2011).
  2. Abe, T. Regeneration of the retina using pigment epithelial cell transplantation. Nihon Ganka Gakkai Zasshi. 106, 778-803 (2002).
  3. Jacobson, S. G., Cideciyan, A. V., Ratnakaram, R., Heon, E., Schwartz, S. B., Roman, A. J., Peden, M. C., Aleman, T. S., Boye, S. L., Sumaroka, A., et al. Gene therapy for Leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations: safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years. Arch. Ophthalmol. 130, 9-24 (2011).
  4. Schwartz, S. D., Hubschman, J. P., Heilwell, G., Franco-Cardenas, V., Pan, C. K., Ostrick, R. M., Mickunas, E., Gay, R., Klimanskaya, I., Lanza, R. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379, 713-720 (2012).
  5. Wang, N. K., Tosi, J., Kasanuki, J. M., Chou, C. L., Kong, J., Parmalee, N., Wert, K. J., Allikmets, R. Transplantation of reprogrammed embryonic stem cells improves visual function in a mouse model for retinitis pigmentosa. Transplantation. 89, 911-919 (2010).
  6. Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. -S. Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy. Gene Ther. Mol. Biol. 11, 229-262 (2007).
  7. Tosi, J., Sancho-Pelluz, J., Davis, R. J., Hsu, C. W., Wolpert, K. V., Sengillo, J. D., Lin, C. S., Tsang, S. H. Lentivirus-mediated expression of cDNA and shRNA slows degeneration in retinitis pigmentosa. Exp. Biol. Med. 236, 1211-1217 (2011).
  8. Tucker, B. A., Park, I. H., Qi, S. D., Klassen, H. J., Jiang, C., Yao, J., Redenti, S., Daley, G. Q., Young, M. J. Transplantation of adult mouse iPS cell-derived photoreceptor precursors restores retinal structure and function in degenerative mice. PLoS One. 6, e189992(2011).
  9. Mahajan, V. B., Mondino, B. J., Tsang, S. H. A high-throughput Mouse Eye Phenomics System. , Cold Spring Harbor Laboratories. (2010).
  10. Chang, B., Hawes, N. L., Hurd, R. E., Davisson, M. T., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. Retinal degeneration mutants in the mouse. Vision Res. 42, 517-525 (2002).
  11. Hawes, N. L., Smith, R. S., Chang, B., Davisson, M., Heckenlively, J. R., John, S. W. Mouse fundus photography and angiography: a catalogue of normal and mutant phenotypes. Mol. Vis. 5, 22(1999).
  12. Won, J., Shi, L. Y., Hicks, W., Wang, J., Hurd, R., Naggert, J. K., Chang, B., Nishina, P. M. Mouse model resources for vision research. J. Ophthalmol. 2011, 391384(2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Sclerotomietechniekglazen capillaire naaldvloeistofinjectietegendruksubretinale ruimteretinaal pigmentepitheel

Gerelateerde artikelen