Methodenartikel

Analyse van SNARE gemedieerde membraanfusie gebruiken enzymatische celfusie Assay

DOI:

10.3791/4378

⸱

19 oktober 2012

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Louisville School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben een celfusie test die SNARE-gemedieerde membraanfusie events kwantificeert door geactiveerde expressie van β-galactosidase.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De interacties van SNARE (s oluble N-ethylmaleimide-gevoelige factor een ttachment eiwit re Ceptor) eiwitten op blaasjes (v-snaren) en op doel membranen (t-snaren) katalyseren intracellulaire vesikels fusie 1-4. Reconstitutie testen zijn essentieel voor het ontleden van het mechanisme en de regeling van SNARE-gemedieerde membraanfusie 5. In een celfusie assay 6,7 worden SNARE eiwitten ectopisch tot expressie op het celoppervlak. Deze "omgedraaid" SNARE eiwitten schijf cel-cel fusie waaruit blijkt dat SNAREs volstaan ​​om celmembranen fuseren. Omdat de celfusie test is gebaseerd op microscopische analyse is minder efficiënt bij gebruik van meerdere v-en t-SNARE interacties kwantitatief te analyseren.

Hier beschrijven we een nieuwe assay 8 dat SNARE gemedieerde fusie events kwantificeert door geactiveerde expressie van β-galactosidase. Tweecomponenten van het Tet-Off genexpressiesysteem 9 gebruikt als uitleessysteem: de tetracycline-gecontroleerde transactivator (tTA) en een reporter plasmide dat het LacZ gen onder controle van de tetracycline-response element (TRE-LacZ) codeert. We transfecteren tTA in COS-7 cellen die v-SNARE eiwitten op het celoppervlak (v-cellen) en transfecteren TRE-LacZ gedraaid in COS-7 cellen die t-SNARE eiwitten omgedraaid op het celoppervlak (T-cellen) . SNARE-afhankelijke fusie van het v-en T-cellen resulteert in de binding van tTA met TRE de transcriptie-activering van LacZ en expressie van β-galactosidase. De activiteit van β-galactosidase wordt gekwantificeerd met een colorimetrische methode absorptie bij 420 nm.

De blaasjes-geassocieerde membraaneiwitten (vamps) zijn v-SNAREs die zich in verschillende post-Golgi vesiculaire compartimenten 10-15. Uitspreken vamps 1, 3, 4, 5, 7 en 8 op hetzelfde niveau vergelijken we de membraanfusieactiviteiten met de enzymatische assay celfusie. Op basis van spectrometrische meting, deze test biedt een kwantitatieve benadering voor het analyseren van SNARE-gemedieerde membraanfusie en voor high-throughput studies.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Celkweek en transfectie

  1. COS-7 cellen worden gekweekt in Dulbecco Modified Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 4,5 g / l glucose en 10% foetaal bovine serum (FBS).
  2. Plasmide transfectie wordt uitgevoerd met Lipofectamine volgens de fabrikant (Invitrogen).

2. Fluorescentie microscopische analyse van het celoppervlak SNARE Expression

  1. De dag voor transfectie, 3 x 10 4 COS-7 cellen worden gezaaid op steriele 12 mm dekglaasjes (Fisher Scientific) in 24-well platen.
  2. Voor v-cellen in elk putje, 0,25 ug van het plasmide dat codeert tTA (ptet-Off, CLONTECH) wordt gecotransfecteerd met 0,25 ug van de plasmiden die uitdrukking omgedraaid vamps.
  3. Voor T-cellen in elk putje wordt 0,25 ug van het plasmide dat codeert TRE-LacZ (pBI-G, CLONTECH) gecotransfecteerd met 0,25 ug elk van de plasmiden die uitdrukking omgedraaid SNAP-25 en syntaxins 1 of 4.
  4. 24 uur na transfection de cellen gefixeerd met 4% paraformaldehyde in PBS + + (PBS aangevuld met 0,1 g / l CaCl2 en 0,1 g / l MgCl2) gedurende 10 min, en vervolgens geblokkeerd in 10% FBS in PBS + + gedurende 30 minuten.
  5. De cellen worden geïncubeerd gedurende 1,5 uur met anti-myc monoklonaal antilichaam 9E10 (neat hybridoma supernatant).
  6. Na vier wasbehandelingen met PBS + + worden de cellen geïncubeerd gedurende 1 uur met FITC-geconjugeerde secundaire antilichamen (Jackson Immunoresearch Laboratories) bij een verdunning van 1:500.
  7. Na vier wasbehandelingen met PBS + +, de gelabelde cellen worden gemonteerd verlengen Gold antifade reagens (Invitrogen).
  8. Confocale beelden worden verzameld op een Olympus laser scanning confocale microscoop. De beelden worden verwerkt met de Adobe Photoshop-software.

3. FACS-analyse van het celoppervlak SNARE Expression

  1. De dag voor transfectie, 2 x 10 5 COS-7 cellen worden uitgezaaid in elk putje van 6-well platen.
  2. 24 uur na transfection met de gespiegelde SNARE, ptet-Off en pBI-G plasmiden worden cellen gefixeerd met 1% paraformaldehyde in PBS + + gedurende 15 min, en vervolgens geblokkeerd in 10% FBS in PBS + + gedurende 15 minuten.
  3. De cellen worden geïncubeerd met het anti-myc monoklonaal antilichaam 9E10 gedurende 60 minuten.
  4. Na drie wassingen met PBS + + de cellen gelabeld met FITC-geconjugeerde secundaire antilichamen (1:200 verdunning) gedurende 45 minuten.
  5. Na drie wassingen met PBS + +, worden de cellen van de platen geschraapt met een celschraper.
  6. 15.000 cellen worden geanalyseerd met een FACSCalibur flowcytometer (BD Biosciences). De gemiddelde fluorescentie-intensiteit van elk monster wordt verkregen met de CellQuest Pro software.

4. Enzymatische celfusie Assay

  1. De dag voor transfectie, 1,2 x 10 6 COS-7 cellen worden uitgezaaid in elke 100 mm weefselkweekplaat en 2 x 10 5 COS-7 cellen worden uitgezaaid in elk putje van 6-well platen.
  2. Voor v-cellen, 0,5 - 5 ug elk Flipped VAMP plasmide wordt gecotransfecteerd met 5 ug ptet-Off in de cellen in elke 100 mm kweekschaal. Controle cellen gecotransfecteerd met de lege vector pcDNA3.1 (+) en ptet-Off. De N-glycosylering van vamps 1, 4, 5, 7 en 8, tunicamycine voorkomen (10 ug / ml) opgenomen in celkweekmedium gedurende transfectie.
  3. Voor T-cellen in elk putje van de 6-well platen, 1 ug omgedraaid SNAP-25 plasmide en pBI-G worden gecotransfecteerd met 0,5 ug omgedraaid syntaxin1 plasmide of 0,05 ug plasmide syntaxin4 omgedraaid.
  4. 24 uur na transfectie worden de v-cellen losgemaakt van de kweekschalen enzymvrije Cell Dissociation Buffer (Invitrogen). Losgemaakte cellen worden geteld met een hemacytometer en geresuspendeerd in HEPES gebufferde DMEM aangevuld met 10% FBS, 6,7 ug / ml tunicamycine en 0,67 mM DTT.
  5. 4,8 x 10 5 geresuspendeerd v-cellen toegevoegd aan elk putje reeds de T-cellen.
  6. Na 6, 12 of 24 uur rat 37 ° C in 5% CO2 , de expressie van β-galactosidase wordt gemeten met de β-galactosidase enzym Assay System met Reporter Lysis Buffer volgens de fabrikant (Promega). In het kort worden de cellen tweemaal gewassen met PBS en gelyseerd in de Reporter Lysis Buffer. Cellysaten worden gemengd met een gelijk volume 2 x Assay Buffer. Als blanco controle wordt het Reporter Lysis Buffer gemengd met de Assay Buffer 2 ×.
  7. Na 90 min wordt de colorimetrische reactie gestopt door toevoeging van 1 M natriumcarbonaat.
  8. Absorptie bij 420 nm gemeten met een HITACHI 100-40 spectrofotometer.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om een ​​kwantitatieve celfusie test te ontwikkelen, wij profiteren van de sterke transcriptionele activering door de binding van tTA aan TRE. In afwezigheid van tTA, transcriptie van het lacZ gen in TRE-LacZ zwijgt. Wanneer tTA aanwezig is, bindt aan het TRE en activeert de transcriptie van LacZ. Figuur 1 toont een stroomdiagram van de enzymatische assay celfusie. tTA getransfecteerd in v-cellen die v-SNARE eiwitten op het celoppervlak en TRE-LacZ getransfecteerd in ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De oorspronkelijke celfusie assay 6 bepaalt SNARE gemedieerde fusie events met fluorescentiemicroscopie. Hier beschrijven we een innovatieve assay die SNARE gemedieerde fusie events kwantificeert door geactiveerde expressie van β-galactosidase en spectrometrische metingen. Met deze assay, we routinematig analyseren 15-20 v-en t-SNARE combinaties in een experiment. Met behulp van flowcytometrie om SNARE expressie te meten op het celoppervlak, we titreren de expressie niveaus van vamps en vergelijken hun membra...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk wordt ondersteund door het opstarten fondsen van de Universiteit van Louisville en CA135123 van de National Institutes of Health (tot CH).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Naam van reagens en uitrusting Vennootschap Catalogusnummer
DMEM Invitrogen 12800-017
COS-7 cellen ATCC CRL-1651
tunicamycine Sigma-Aldrich T7765-5MG
ptet-Off Clontech K1620-A
pBI-G Clontech 6,150-1
lipofectamine Invitrogen 18324-012
Enzym-vrije cel dissociatie oplossing Invitrogen 13151-014
Konijn anti-Tet-repressor polyklonaal antilichaam Millipore AB3541
FITC-geconjugeerd ezel anti-muis IgG (H + L) Jackson ImmunoResearch 715-095-150
Laser scanning confocale microscoop Olympus FV1000
FACSCalibur flowcytometer BD Biosciences
β-galactosidase enzym Assay System met Reporter Lysis Buffer Promega E2000
Model 100-40 UV-VIS spectrofotometer Hitachi C740843

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rothman, J. E. Mechanisms of intracellular protein transport. Nature. 372, 55-63 (1994).
  2. Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C. Membrane fusion. Cell. 112, 519-533 (2003).
  3. Bonifacino, J. S., Glick, B. S. The mechanisms of vesicle budding and fusion. Cell. 116, 153-166 (2004).
  4. Jahn, R., Scheller, R. H. SNAREs--engines for membrane fusion. Nature. 7, 631-643 (2006).
  5. Weber, T. SNAREpins: minimal machinery for membrane fusion. Cell. 92, 759-772 (1998).
  6. Hu, C. Fusion of cells by flipped SNAREs. Science (New York, N.Y). 300, 1745-1749 (2003).
  7. Hu, C., Hardee, D., Minnear, F. Membrane fusion by VAMP3 and plasma membrane t-SNAREs. Experimental cell research. 313, 3198-3209 (2007).
  8. Hasan, N., Corbin, D., Hu, C. Fusogenic Pairings of Vesicle-Associated Membrane Proteins (VAMPs) and Plasma Membrane t-SNAREs - VAMP5 as the Exception. PloS one. 5, e14238(2010).
  9. Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 5547-5551 (1992).
  10. Hanson, P. I., Heuser, J. E., Jahn, R. Neurotransmitter release - four years of SNARE complexes. Current opinion in neurobiology. 7, 310-315 (1997).
  11. McMahon, H. T. Cellubrevin is a ubiquitous tetanus-toxin substrate homologous to a putative synaptic vesicle fusion protein. [see comments. Nature. 364, 346-349 (1993).
  12. Steegmaier, M., Klumperman, J., Foletti, D. L., Yoo, J. S., Scheller, R. H. Vesicle-associated membrane protein 4 is implicated in trans-Golgi network vesicle trafficking. Molecular biology of the cell. 10, 1957-1972 (1999).
  13. Zeng, Q. A novel synaptobrevin/VAMP homologous protein (VAMP5) is increased during in vitro myogenesis and present in the plasma membrane. Molecular biology of the cell. 9, 2423-2437 (1998).
  14. Galli, T. A novel tetanus neurotoxin-insensitive vesicle-associated membrane protein in SNARE complexes of the apical plasma membrane of epithelial cells. Molecular biology of the cell. 9, 1437-1448 (1998).
  15. Wong, S. H. Endobrevin, a novel synaptobrevin/VAMP-like protein preferentially associated with the early endosome. Molecular biology of the cell. 9, 1549-1563 (1998).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Beta galactosidasekwantificeringTet Off genexpressiesysteemVAMP eiwittensyntaxine eiwittenCOS 7 cellenflowcytometriespectrophotometrische analyseceloppervlakexpressie

Gerelateerde artikelen