Gebruik makend van luciferase en in vivo imaging-systemen (IVIS) als een roman middel om ziekte-eindpunten identificeren voordat klinische ontwikkelingen voordoen. IVIS heeft ons toegestaan om te visualiseren in real time de invasie van encefalitisch virussen over meerdere dagen, met een meer accurate ziekte model voor toekomstige studie. Het is ook toegestaan om het potentieel beschermende kenmerken van antivirale middelen en vaccins sneller identificeren dan op dit moment gebruikte dierlijke modellen. De mogelijkheid om individuele dieren te gebruiken over meerdere tijdstippen zorgt voor minder dierenbenodigdheden, kosten en de overall morbiditeit voor de dieren gebruikt zorgen voor een meer humane en meer wetenschappelijke middelen van de ziekte studie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
In vivo Imaging Systems (IVIS) Detectie van een neuro-invasieve encefalitisch Virus
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Moderne ontwikkelingen in de imaging-technologie aan te moedigen verdere ontwikkeling en verfijning in de manier waarop virale onderzoek wordt uitgevoerd. In eerste instantie voorgesteld door Russel en Burch in Hume's 3 V's (vervanging, vermindering, verfijning), het gebruik van diermodellen in wetenschappelijk onderzoek is onder constante druk om nieuwe methoden te identificeren om het gebruik van dieren te verminderen, terwijl het verbeteren van de wetenschappelijke nauwkeurigheid en snelheid. Een belangrijke uitdaging om Hume's opdrachtgevers is echter hoe te zorgen voor de studies zijn statistisch nauwkeurige terwijl het verminderen van dierziekten morbiditeit en totale aantallen. Werkzaamheid studies vereisen momenteel een groot aantal dieren om te worden beschouwd als statistisch significant en leiden vaak tot hoge morbiditeit en mortaliteit eindpunten voor de identificatie van immuunbescherming. We gebruik in vivo imaging systemen (IVIS) in combinatie met een vuurvlieg bioluminescent enzym aan de invasie van het centraal zenuwstelsel (CNS) geleidelijk volgen door een lingenphalitic virus in een muizenmodel. Typisch, de ziekte relatief langzaam echter virusreplicatie is snel, vooral in de CNS en kan leiden tot een vaak fatale afloop. Na intranasale infectie van muizen met de TC83-Luc, een verzwakt Venezolaanse equine encephalitis virus stam aangepast voor expressie een luciferasegen, kunnen wij virusreplicatie visualiseren in de hersenen ten minste drie dagen vóór de ontwikkeling van klinische ziekteverschijnselen. Gebruik te maken van CNS invasie als een belangrijke encefalitisch ontwikkeling van de ziekte eindpunt zijn we in staat om snel therapeutische en vaccin bescherming te identificeren tegen TC83-Luc infectie voordat de klinische symptomen zich ontwikkelen. Met IVIS technologie zijn we in staat om de snelle en nauwkeurige testen van drugs therapeutica en vaccins te tonen terwijl het verminderen van het aantal dieren en morbiditeit.
Protocol
1. Animal Voorbereiding
- Animal aankomst: Bij aankomst in het dier bioveiligheid niveau 2 (ABSL2) faciliteiten, zodat de dieren een minimum van 2 dagen om te acclimatiseren aan hun nieuwe omgeving. Na deze rusttijd controleert de dieren voor hun gezondheid en algehele fysieke verschijning te evalueren.
- Bij het gebruik fluorescent reporters is het belangrijk om alle proefdieren op alfalfa dieet plaatsen om de hoeveelheid GI autofluorescentie en achtergrond signaal.
- Shave dieren: Om de bioluminescente signaal gedetecteerd van de schedel tijdens beeldvorming te verbeteren; scheren de hoofden van alle dieren. Verdoven dieren met een mengsel van zuurstof en isofluraan verdampt. Als de dieren zijn volledig verdoofd, gebruik maken van elektrische tondeuse om hun hoofd te scheren. Eenmaal klaar met scheren, de terugkeer van de dieren naar hun kooien en observeren volledig herstel van de gevolgen van de anesthesie.
- Bio Medic gegevensSystems (BMDS) transponder inbrengen (plaatsvinden na scheren van de muizen terwijl de dieren volledig verdoofd): Voor een minder invasieve middelen om de temperatuur implantaat subcutaan volgen een voorgeprogrammeerde BMDS draadloze transponder in de dorsale regio van elke muis. Deze transponders kunnen voor draadloze identificatie en temperatuurregistratie. Na implantatie van de transponder, toepassen veterinaire-grade weefselhechtmiddel op de wond.
- Baseline collection: voor infectie opnemen basislijn temperatuur en het gewicht voor alle dieren. Verzamel bloed voor plaquereductieneutralisatietest (PRNT) analyse door middel van retro-orbitale (RO) bloeden, terwijl de muizen onder narcose. Na bloedafname, van toepassing veterinaire antibiotica oogzalf om potentiële secundaire bacteriële infectie te verminderen. Dit basislijn collection moet worden aangevuld met aandacht voor het aantal keren dat de dieren onder narcose gebracht door stress op de muizen. Toekomst RO collecties should worden afgerond na de belichting, terwijl de muis is nog steeds onder narcose. De maximum bloed vanuit een RO moet ongeveer 200 pl.
- Infectie: Place muizen verdoofd zoals eerder beschreven. Inoculeer via intranasale route met een dosis van 5x10 tot 5x10 6 7 pfu TC83-Luciferase in een totaal volume van 40 pl verdund fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) door intranasale infectie. Na infectie, plaatst u de muizen in hun huisvesting kooi en observeer herstel.
2. Animal Imaging
Disclaimer: Houd muizen binnen hun wooneenheid, de bioveiligheid kast (BSC), of de XIC insluiting doos te allen tijde. De goedgekeurde BSC's voor dit protocol zijn een klasse II Type B1 of B2.
- Injecteer alle dieren met 10 ui per gram lichaamsgewicht van intraperitoneale (IP) luciferin in een concentratie van 15 mg / ml.
- Ampligen muizen die moeten worden injected IP in een dosis van 12,5 mg / kg lichaamsgewicht bij -4 uur na infectie of +48 uur na infectie op basis van hun groep.
- Vóór injectie met luciferine, scheiden de muizen in groepen van drie om een juiste maat in de XIC-3 containment box waarborgen.
- Voor imaging gebruik maken van oculaire zalf / smeermiddel om het drogen van de cornea te voorkomen gedurende de procedure.
- Open de LivingImage software en druk op Initialiseren van het grafisch venster te bereiden; set automatische besparing, belichtingstijd op auto (belichtingstijd op auto is een nieuwe functie van de LivingImage software 3.2 en nieuwer), veld te bekijken naar C, en het filter te openen; veld gezien is gebaseerd op het aantal muizen u imaging en filter kan worden geoptimaliseerd desgewenst voor andere beeldbewerkingsprojecten.
- Controleer of de lucht koolstoffilters niet zijn verstreken, de zuurstof tank vol is, en de isofluraan reservoir gevuld is. Plaats smalle stroken van elektrische tape in de XIC-3 isolation box die helpt bij het verminderen van de verplaatsing van dieren tijdens het belichten.
- Injecteer de muizen met luciferine IP zoals beschreven in paragraaf 2.1 en plaats binnen de Isofluraan inductie kamer (met deksel open) gedurende 3-5 minuten.
- Na 5 min, het deksel van de inductiekamer en start de stroom van isofluraan. De verdoving werkt bij ongeveer 3-5% van de zuurstoftoevoer ingesteld op ongeveer 2,0 L / min. Eenmaal volledig onbewust wacht dan nog 30 sec en breng de muizen om de XIC-3 isolatie box. Zorg ervoor dat de bioveiligheid kast wordt benut zorgt voor het veilig opruimen van isofluraan als deze procedure zal omvatten het verlies van isofluraan van de inductie kamer (de IVIS apparaat bevat zijn eigen Passief Fair canisters en de XIC-3 containment box direct aangesloten op de in / uit-aansluitingen tot ingeperkt verdoving stroom te verzekeren).
- Breng de muizen op basis van chip / groepsnummer in de XIC-3 isolatie box met de isofluraan connector een aangeslotend te openen. Plaats de muizen, zodat ze zijn neergelegd in sternale decubitus met kop zachtjes rusten op de tape strips.
- Veeg de XIC insluiting doos met ethanol, spray handen en onderkant van de XIC-3 met CaviCide, en over te dragen aan de IVIS beeldvorming kamer. Sluit de anesthesie op de insluiting box eenmaal in de beeldeenheid.
- Na 10 min na de injectie van luciferine, het imago van de muizen door het levende beeld software.
- Na de eerste beeldvorming met een open filter, start een DLIT 3-dimensionale beeldvorming met behulp van de sequentie-analyse en Image Wizard setup voor bioluminescente vuurvlieg luciferase. Dit proces zal imaging 4-5 min en moet ten een gezichtsveld relevant voor het aantal gewenste muizen.
- Ex-vivo analyse mogelijk na autopsie en verzameling van de hersenen. Plaats de hersenen op een steriele petrischaal, druppelen 50 tot 100 ul van voorraad luciferine op de top, en de plaats binnen het imaGing doos.
- Finalize een tweede open filter beeld op 15 tot 17 minuten na infectie na voltooiing van DLIT beeldvorming. Zorg ervoor dat sequentie-analyse is uitgeschakeld en het gezichtsveld en filter instellingen worden teruggezet naar de vorige instellingen.
3. Terug Muizen en data-analyse
- Schakel de isofluraan vaporizer en terug over te dragen van de XIC insluiting in om de bioveiligheid kast.
- Plaats de muizen in hun wooneenheid, sluit de top, spuit de buitenkant met geschikt desinfectiemiddel, en plaats terug op de behuizing rek.
- Zorg ervoor dat muizen zijn volledig hersteld van anesthesie.
- Herhaal de bovenstaande procedure als het experiment vereist tot beeldvorming is voltooid.
- Desinfecteer de BSC, het afsluiten van de apparatuur, en de overdracht van alle data naar een extern laboratorium locatie voor verdere analyse.
- Analyseer de gegevens en het genereren van 3-dimensionale beelden op basis van IVIS resultaten utilizing de LivingImage software.
- Zorg ervoor dat het beeld in de juiste richting en verlichting / kleurbalans is ingesteld. Binnen de Tool Palette de opties omvatten Beeld aanpassen, Correcties, Image Information en ROI Tools.
- Maak gebruik van ROI vormen om specifieke signaalsterkte op basis van locatie te identificeren.
- Reconstructie van de oppervlakte topografie om de muis lichaam te markeren, te initialiseren 3D DLIT reconstructie, en het gebruik van lineaire fit aan het orgel kaart ingesteld op de topografische reconstructie.
- Verdere virale titratie analyse kan worden uitgevoerd door middel van inzameling van bloed en organen. Titratie in deze studie werd afgerond door middel van homogenisatie van hersenweefsel in gemodificeerde adelaars medium (MEM). Het homogenaat werd serieel verdund en we besmet een plaat met 6 putjes van Vero cellen gedurende 1 uur. De cellen werden bedekt met een overlay agarose/2xMEM 1,5% en gedurende 2 dagen bij 37 °. Cellen werden gefixeerd met 10% formaline gedurende 30 min en gekleurd metkristalviolet.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Van een genetisch gemodificeerde virus, TC83-Luciferase zagen we een toename bioluminescent signaalsterkte als de virus replicatie beweegt van de nasale regio in de centrale CNS (figuur 1). Door de hoge virale replicatie rate verwachten we hoge bioluminescent signaal (figuur 2A) afhankelijk van de vector en het dier immuunrespons op de vector zien. We verwachten dat dit signaal verhoging blijven een piek tussen dagen 5-7 na infectie in combinatie met virale replicatie piek in het CNS
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hoewel dit protocol omvat de aspecten imaging in vivo analyse is belangrijk om de bioluminescent vector herkennen als een sleutelfactor voor toekomstige studies. Onze gebruik van TC83, een verzwakte vaccinstam VEEV als vector voor expressie van luciferase zodat grote hoeveelheden van het enzym worden geproduceerd door de hoge replicatie van het virus in het CNS zoals eerder beschreven 1-4. Terwijl de toevoeging van een tweede subgenome promotor en het luciferase gen resulteert in verdere verzwakking ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Instituut voor Translational Sciences UTMB-NIH subsidie 1UL1RR029876-01 en Alisha Prather voor haar hulp bij videobewerking voor dit manuscript.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van het reagens | Vennootschap | Catalogusnummer | Opmerkingen (optioneel) |
| D-Luciferin | |||
| Isofluraan | |||
| Xenogen IVIS System (Spectrum) | Caliper Life Sciences | ||
| XGI-8-gas Anesthesie System | Caliper Life Sciences | ||
| XIC-3 Containment Box | Caliper Life Sciences | ||
| LivingImage 4.0 Software | Caliper Life Sciences | ||
| Telemetrie / identificatie-chips | Bio Medic Data Systems | IPTT-300 | Animal ID en TemperARD |
| BD Integra 1ml TB spuit met 26 gx 3/8 "naald | Fisher Scientific | 305279 | |
| Vet Bond weefsel lijm | Fisher Scientific | NC9259532 | |
| Vetropolycin oogzalf | Webster Veterinary Products | 78444656 | |
| Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing 1X | Invitrogen | 14190-144 | |
| BMDS Chip Reader | Bio Medic Data Systems | DAS-7007S | |
| DAS-host-software | Bio Medic Data Systems | Wordt gebruikt om probe informatie te downloaden |
Referenties
- Steele, K. E., et al. Comparative Neurovirulence and Tissue Tropism of Wild-type and Attenuated Strains of Venezuelan Equine Encephalitis Virus Administered by Aerosol in C3H/HeN and BALB/c Mice. Veterinary Pathology Online. 35, 386-397 (1998).
- Ludwig, G. V., et al. Comparative neurovirulence of attenuated and non-attenuated strains of Venezuelan equine encephalitis virus in mice. Am. J. Trop. Med. Hyg. 64, 49-55 (2001).
- Charles, P. C., Walters, E., Margolis, F., Johnston, R. E. Mechanism of Neuroinvasion of Venezuelan Equine Encephalitis Virus in the Mouse. Virology. , 208-662 (1995).
- Volkova, E., Gorchakov, R., Frolov, I. The efficient packaging of Venezuelan equine encephalitis virus-specific RNAs into viral particles is determined by nsP1-3 synthesis. Virology. 344, 315-327 (2006).
- Patterson, M., et al. Rapid, non-invasive imaging of alphaviral brain infection: Reducing animal numbers and morbidity to identify efficacy of potential vaccines and antivirals. Vaccine. 29, 9345-9351 (2011).
- Cook, S. H., Griffin, D. E. Luciferase Imaging of a Neurotropic Viral Infection in Intact Animals. J. Virol. 77, 5333-5338 (2003).
- Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. Bioluminescent indicators in living mammals. Nat. Med. 4, 245-247 (1998).
- Osorio, J. E., Iams, K. P., Meteyer, C. U., Rocke, T. E. Comparison of Monkeypox Viruses Pathogenesis in Mice by In Vivo Imaging. PLoS ONE. 4, e6592(2009).
- Luker, G. D., Prior, J. L., Song, J., Pica, C. M., Leib, D. A. Bioluminescence Imaging Reveals Systemic Dissemination of Herpes Simplex Virus Type 1 in the Absence of Interferon Receptors. J. Virol. 77, 11082-11093 (2003).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).
- Kuehne, R. W., Pannier, W. L., Stephen, E. L. Indirect mouse model for the evaluation of potential antiviral compounds: results with Venezuelan equine encephalomyelitis virus. Antimicrob. Agents Chemother. 11, (1977).
- Lukaszewski, R. A., Brooks, T. J. G. Pegylated Alpha Interferon Is an Effective Treatment for Virulent Venezuelan Equine Encephalitis Virus and Has Profound Effects on the Host Immune Response to Infection. J. Virol. 74, 5006-5015 (2000).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
