RPPA kan de eiwitexpressie van honderden monsters gedrukt op nitrocellulose dia gelijktijdig worden uitgelezen met behulp van fluorescent gelabelde antilichamen. Deze techniek is toegepast om het effect van medicamenteuze behandeling heterogeniteit studeren in clear cell niercarcinoom.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Het gebruik van omgekeerde fase eiwitseries (RPPA) naar Protein Expression Variatie Verkennen binnen Individuele Nier cel kankers
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Op dit moment is er geen curatieve behandeling voor gemetastaseerd clear cell niercelcarcinoom, de meest voorkomende variant van de ziekte. Een belangrijke factor in deze behandeling weerstand gedacht dat de moleculaire complexiteit van de ziekte 1 zijn. Gerichte therapie zoals tyrosine kinase inhibitor (TKI)-sunitinib zijn gebruikt, maar slechts 40% van de patiënten, reageren met de overgrote meerderheid van deze patiënten relapsing binnen 1 jaar 2. Als zodanig de vraag intrinsieke en verworven resistentie in niercelkanker patiënten is zeer relevant 3.
Met het oog op resistentie tegen studeren TKI's, met als uiteindelijk doel het ontwikkelen van efficiënte en gepersonaliseerde behandelingen, wordt sequentiële weefsel na een bepaalde periode van gerichte therapie nodig, een aanpak die succesvol was gebleken bij chronische myeloïde leukemie 4. Echter, de toepassing van een dergelijke strategie niercelcarcinoom wordt bemoeilijkt door de hoge both inter-en intratumorale heterogeniteit, wat een kenmerk is van niercelcarcinoom 5,6 en andere vaste tumoren 7. Intertumoral heterogeniteit als gevolg van transcriptoom-en genetische verschillen is goed ingeburgerd, zelfs bij patiënten met een soortgelijke presentatie, stadium en de graad van de tumor. Bovendien is het duidelijk dat er grote morfologische (intratumorale) heterogeniteit in RCC, die waarschijnlijk nog grotere moleculaire heterogeniteit vertegenwoordigen. Gedetailleerd in kaart brengen en categoriseren van RCC tumoren door gecombineerde morfologische analyse en Fuhrman indeling maakt het mogelijk de selectie van representatieve gebieden voor proteomische analyse.
Eiwit analyse van RCC 8 is aantrekkelijk vanwege de algemene beschikbaarheid in pathologische laboratoria, maar de toepassing ervan kan problematisch vanwege de beperkte beschikbaarheid van specifieke antilichamen 9. Als gevolg van de dot-blot aard van de omgekeerde fase eiwitseries (RPPA), antilichaam de specificiteit moeten be geprevalideerde en als zodanig strenge kwaliteitscontrole van de gebruikte antilichamen is van het grootste belang. Ondanks deze beperking de dot blot format, dat de mogelijkheid assay miniaturisatie, waardoor het drukken van honderden monsters op een nitrocellulose dia. Afgedrukte dia kan vervolgens worden geanalyseerd op soortgelijke wijze als Western-analyse met behulp van doelspecifieke primaire antilichamen en fluorescent gelabelde secundaire antilichamen, waardoor multiplexing. Differentiële eiwitexpressie in alle monsters op een dia kunnen dan tegelijkertijd worden geanalyseerd door het relatieve fluorescentie in een kosteneffectieve en high-throughput manier.
Protocol
1. Identificatie van morfologische en moleculaire Tumor Heterogeniteit
- Tumoren verwijderd van -80 ° C vriezer en op droog ijs bewaard.
- Verdeel tumoren in secties van ongeveer 1 cm 3. Kaart de oorspronkelijke positie van elke tumor sectie ten opzichte van elkaar en label met een unieke naam. Store monsters in afzonderlijke cryovials bij -80 ° C tot aan gebruik.
- Coat monsters in LGO en gesneden in een cryostaat bij -22 ° C.
- Monsters gekleurd met hematoxyline en eosine tegenkleuring methode.
- Microscopie analyse van vriescoupes te zorgen dat ze zijn CCRCC natuur, levensvatbare tumor en voor het sorteren (laaggradige, hooggradige of gemengde laag / hoog kwaliteit, een uitdaging om te differentiëren Fuhrman graad 1 tot 4 op vriescoupe). Figuur 1 a & b (H & E-kleuring van hoge lage en gemengde graad).
- Selecteer tot 4 monsters van elke morfologisch verschillende regio's binnen elk tumor voor eiwitextractie.
2. Eiwit Extractie uit tumormonsters
- Snijd tumormonster van oktober
- Place 50-75 mg weefsel in 2 ml buizen met 990 ul lysis buffer [50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM EGTA (pH 8,5), 150 mM NaCl] aangevuld met aprotinine (Sigma A6279) (10 mg / ml), fosfatase-inhibitor cocktail 2 (Sigma, P5716), fosfatase-inhibitor cocktail 3 (Sigma, P0044) en een protease inhibitor cocktail (Roche, 11836153001).
- Voeg een 5 mm stalen kogel aan elke buis toegevoegd en gehomogeniseerd bij 50 Hz gedurende 5 minuten tweemaal telkens met TissueLyser, om de hoogte van homogenisering na elke periode van 5 minuten.
- Breng gehomogeniseerde monster op nieuwe 2 ml buis met behulp van pipet het verlaten van de stalen kogel achter.
- Voeg 10 ul van Triton X-100 aan elk monster voor centrifugeren bij 13.000 g gedurende 30 min bij 4 ° C.
- Overdracht supernatanten verse reactievaatjes.
- Bepaal eiwitconcentratie met BCA assay (figuur 2).
- Normaliseren eiwitconcentraties van 1 mg / ml.
3. Antilichaam Validatie
- Bereid eiwitmonsters (geëxtraheerd uit geschikte cellijnen of weefsel) voor western blot en draaien op een 10% SDS-PAGE gel.
- Doorvoermonsters op nitrocellulose membraan overnacht bij 4 ° C.
- Blokkeren membraan in Li-Cor Odyssey Blokkeringsbuffer (50:50 verdund in PBS) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Verdun de primaire antilichamen in Li-Cor Odyssey Blokkeringsbuffer (50:50 verdund in PBS) aan de fabrikant aanbevolen verdunning typisch 1 op 1.000.
- Incubeer membraan in primaire antilichamen gedurende de nacht bij 4 ° C.
- Make up 0,1% PBS-Tween 20 (PBS-T; 1 ml Tween20 / 1L PBS).
- Wassen membraan in PBS-T bij kamertemperatuur gedurende 5 min (x3).
- Verdun fluorescent gelabelde secundaire antilichamen in Odyssey Blokkeringsbuffer (50:50 verdund in PBS) 0,01% SDS bij 1:10.000 verdunning (1,5 μl/15 ml).
- Incubeer membraan in het voortgezetantilichamen bij kamertemperatuur gedurende 45 min onder zachtjes schudden - is het belangrijk om het membraan te beschermen tegen licht totdat zij definitief gescand.
- Wassen membraan in PBS-T bij kamertemperatuur gedurende 5 min (x3), waarbij het membraan in het donker.
- Wassen membraan in PBS bij kamertemperatuur gedurende 5 min (x3) om resterende Tween20 te verwijderen, opnieuw in, met het membraan in het donker.
- Lig membraan plat op een stuk filtreerpapier in het donker en laat aan de lucht drogen - waardoor het membraan te drogen kan het signaal te verbeteren en achtergrondgeluiden te verminderen, maar het nutteloos voor het strippen en opnieuw indringende.
- Scan de membraan op de Licor Odyssey scanner. Houd het membraan in het donker totdat het gescand.
- Geselecteerde antilichamen die een enkele overheersende band op het juiste molecuulgewicht genereren. Figuur 3 toont voorbeelden van aanvaardbare en onaanvaardbare antilichamen voor gebruik met RPPA.
4. RPPA Printing
- Eiwitlysaten werden gespot op nitrocellulose-gecoat glas dia's (Fastslides-Whatman) met een MicroGrid II robot spotter. De gebruikte dia's bevatte 2 pads waarop de monsters werden gespot. Elke pad werd gespot met identieke monsters, in dit geval 100 monsters. Andere beschikbare formaten zijn 1, 8 en 16 pad dia's. Hoe hoger het aantal pads hoe kleiner het aantal monsters dat kan worden gespot op elk.
- Een reeks van vijf 2-voudige verdunningen werden van elk monster en elk werd gespot in drievoud (resulterend in een totaal van 15 spots per monster).
5. RPPA eiwitdetectie
- Natte slides dan Licor Blokkeringsbuffer (50:50 verdund in PBS). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur op een schommelende platform.
- Bereid 800 pi van primaire antilichamen in Licor Blokkeringsbuffer (50:50 verdund in PBS) in de gewenste concentratie en op ijs bewaren.
- Monteer de dia's in ofwel (i) de single frame Chip Clipof (ii) de "FastFrame 'vier baai diahouder zodat een goede afdichting wordt gevormd tussen de dia en de incubatie kamer.
- Verwijder resterende buffer van putten en voeg 600 ul primaire antilichaam respectievelijk aan de putjes.
- Plaats de glijbaan en kamer in een verzegelde natte doos en incubeer op rocken platform overnacht bij 4 ° C.
- Maken 0,1% PBS-Tween20 (PBS-T, 100 ul Tween 20/100 ml PBS).
- Verwijder dia's uit koelruimte en zorgvuldig de primaire antilichamen te verwijderen uit elk putje.
- Voeg 600 ul van PBS-T en wassen dia's op rocken platform bij RT gedurende 5 minuten (X3).
- Bereid fluorescent gelabelde secundaire antilichamen door verdunning in Odyssey Blokkeringsbuffer (50:50 verdund in PBS) 0,01% SDS bij 1:2000 verdunning (1 pi / 2 ml) in eerste instantie.
- Verwijder buffer van putten en voeg 600 ul fluorescent gelabelde secundaire antilichamen respectievelijk aan de putjes. Incubeer secundaire antilichamen bij kamertemperatuur gedurende 45 min onder zachtjes schudden - itis belangrijk om het membraan te beschermen tegen het licht totdat definitief is gescand.
- Verwijderen secundaire antilichamen van goed en kort was (x3) in 600 ul PBS-T bij kamertemperatuur. Verwijder dia uit drager, over te brengen naar een geschikte container en was meer dan PBS-T gedurende 15 minuten, waardoor het membraan in het donker.
- Verwijderen PBS-T en verder wassen met PBS membraan bij kamertemperatuur gedurende 15 min om resterende Tween-20 verwijderen, opnieuw in, het membraan in het donker.
- Droog de Fastslide in 50 ° C oven gedurende 10 min en scan het Li-Cor Odyssey scanner. Houd de dia in het donker totdat het is gescand.
- Scannen van de dia bij 680 nm en / of 800 nm, afhankelijk van het secundaire antilichaam / gebruikte antilichamen. Voor twee-kleurdetectie altijd zeer cross-geadsorbeerde secundaire antilichamen tegen kruisreactiviteit te minimaliseren. Zorgvuldige selectie van primaire en secundaire antilichamen is nodig voor twee kleuren detectie. Van primair belang is de selectie vanverschillende gastheersoorten (bijvoorbeeld konijn en muis) van de twee primaire antilichamen. Dit maakt discriminatie door anti-konijn en anti-muis secundaire antilichamen die met kleurstof gelabeld met gemakkelijk te onderscheiden emissiespectra.
- Beeldbestanden worden opgeslagen als. Tiff-bestanden. Figuur 4 (beeld van gescande bestanden).
6. Data-analyse
- Start de MicroVigene Software (VigeneTech, Carlisle, MA, USA).
- Open. Tiff image-bestand met de scan van de RPPA dia.
- Selecteer een vooraf gedefinieerde sjabloon bestand dat een raster om te overlappen met het beeld van de RPPA slide zal hebben.
- Klik op het definiëren Regio's of Interest (ROI) knop, om het Grid.
- Plaats de Grid over de RPPA plekken. Figuur 6a (beeld van het net over de afbeelding).
- Klik op de knop Alles selecteren om alle ROI te markeren.
- Klik op Alles zoeken. MicroVigene zal Automatisch vinden de ROI, vinden de vlekken, trekt u de achtergrond, verwijder stof en kwantificeren vlekken.
- Klik op de View Verdunning Curve knop om de resultaten voor alle monsters op de RPPA dia.
- Klik op Opslaan Verdunning Data.
- Aangezien elk monster wordt afgedrukt over 5 verdunning punten elk in drievoud er 15 punten te analyseren, waardoor de kans op fouten vermindert en verbetert de kwaliteit van curve fitting. MicroVigene produceert een vier-parameter logistische log-model "Supercurve" algoritme (Figuur 6b), die alle spots een sigmoïde curve van antigeen-antilichaam bindingskinetiek produceren omvat. De aanname is dat hetzelfde antilichaam-antigen bindingskinetiek vindt plaats in elk monster plaats, zelfs in de verschillende monsters, waardoor door alle spots op een rij een gemeenschappelijke response curve past, kan het vertrouwen van de curve fitting 10,11
Y = a + ((ba) / (1 + e (c * d-ln (x)))
waarbij x het dilution factor en Y de signaalintensiteit.
Monsters kunnen relatief worden geanalyseerd met de y0 waarde, die in onze analyse de y-waarde overeenkwam in het midden van de waarden na x kaart brengen die op de supercurve. - Exporteer de gegevens in Microsoft Excel en plot y0 zoals in figuur 7.
- Intratumorale eiwit variantie werd apart berekend voor onbehandelde en behandelde behandelde patiënten in een ANOVA kader. Variantie distributies combineren van gegevens uit alle geanalyseerde eiwitten werden vergeleken door een Mann-Whitney test (MWT). Intratumorale afwijkingen voor de individuele eiwitten werden vergeleken door een F-test waarbij aannames van normaliteit en homoscedasticiteit gehouden, respectievelijk beoordeeld aan de hand van de Lillefours en Fligner tests; valse ontdekking tarief (FDR) correctie toegepast 12. Differentiële eiwitexpressie tussen onbehandelde en behandelde patiënt monsters getest voor elk eiwit met student t-test waar normaal en homoscedasticiteit veronderstellings voldaan, anders MWT werd uitgevoerd; FDR werd aangebracht boven gecombineerde t-test en MWT waarden 12. Belang van eiwitexpressie en variantie Pearson correlatie voor de eiwitten werden geschat met een standaardbenadering [R referentie] en FDR toegepast 12.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een voorbeeld van een gescande RPPA dia te zien in Figuur 4 (i) met zowel 680 en 800 nm kanalen getoond. Het scheiden van de beelden door golflengte, Figuur 4 (ii) in staat stelt elke pad op de RPPA slide te analyseren en individuele eiwit expressie bepaald figuur 4 (iii). Zoals te zien in figuur 4 (iii) de expressie van individuele eiwitten in de monsters is uniek met gelsoline met een hoog expressieniveau in vergelijking met de dia cMYC die een veel l...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De hier gepresenteerde methode RPPA is een high throughput alternatief voor de veel gebruikte maar relatief lage doorzet western blot techniek eiwitanalyse. De werkwijze maakt honderden monsters te semi-kwantitatief geanalyseerd en vergeleken gelijktijdig waardoor directe vergelijking van de belangrijkste eiwitten in een brede selectie van cellijnen en weefselmonsters. Multiplexing met verschillende antistofspecies verder vergroot het vermogen van de techniek die meerdere antilichamen gelijktijdig worden gebruikt. De hi...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Het werk van auteurs FCO, DF, JN, DJH en GDS hierboven genoemde wordt gefinancierd door de Chief Scientist Office, subsidie-nummer: ETM37 en ondersteund door het Cancer Research UK Experimenteel Kankeronderzoek Geneeskunde Centrum. Het werk van AL wordt gefinancierd door de Royal College of Surgeons of Edinburgh Robertson Trust, de Melville Trust voor de verzorging en genezing van kanker en de Medical Research Council. IO wordt ondersteund door een Royal Society of Edinburgh Schotse regering Fellowship medegefinancierd door Marie Curie-acties en het Verenigd Koninkrijk Medical Research Council. De auteurs willen graag SCOTRRCC mede-aanvragers en medewerkers bedanken voor hun nuttige discussies op een aantal van de onderwerpen die in dit document.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van het reagens | Vennootschap | Catalogusnummer | |
| aprotinine | Sigma | A6279 | |
| fosfatase-inhibitor cocktail 2 | Sigma | P5726 | |
| fosfatase-inhibitor cocktail 3 | Sigma | P0044 | |
| protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Triton X-100 | Triton-X | T8787 | |
| Li-Cor Odyssey Blokkeringsbuffer | Li-Cor | 927-40.000 | |
| TissueLyser | Qiagen | 85600 | |
| MicroGrid II robot spotter | Biorobotics | ||
| FastFrame 'vier bay diahouder | Whatman papier | 10486001 | |
| FAST Slide - 2-Pad | Whatman papier | 10485317 | |
| IRDye 680LT geit anti-muis IgG | Licor | 926-68.020 | |
| IRDye 800CW geit anti-konijn IgG | Licor | 926-32.211 |
Referenties
- Stewart, G. D., O'Mahony, F. C., Powles, T., Riddick, A. C., Harrison, D. J., et al. What can molecular pathology contribute to the management of renal cell carcinoma. Nat. Rev. Urol. 8, 255-265 (2011).
- Rini, B. I., Michaelson, M. D., Rosenberg, J. E., Bukowski, R. M., Sosman, J. A., et al. Antitumor activity and biomarker analysis of sunitinib in patients with bevacizumab-refractory metastatic renal cell carcinoma. J. Clin. Oncol. 26, 3743-3748 (2008).
- Swanton, C., Larkin, J. M., Gerlinger, M., Eklund, A. C., Howell, M., et al. Predictive biomarker discovery through the parallel integration of clinical trial and functional genomics datasets. Genome Med. 2, 52(2010).
- Cortes, J., Jabbour, E., Kantarjian, H., Yin, C. C., Shan, J., et al. Dynamics of BCR-ABL kinase domain mutations in chronic myeloid leukemia after sequential treatment with multiple tyrosine kinase inhibitors. Blood. 110, 4005-4011 (2007).
- Gerlinger, M., Rowan, A. J., Horswell, S., Larkin, J., Endesfelder, D., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N. Engl. J. Med. 366, 883-892 (2012).
- Fisher, R., Larkin, J., Swanton, C. Inter and intratumour heterogeneity: a barrier to individualized medical therapy in renal cell carcinoma. Front. Oncol. 2, 49(2012).
- Yachida, S., Jones, S., Bozic, I., Antal, T., Leary, R., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467, 1114-1117 (2010).
- O'Mahony, F. C., Faratian, D., Varley, J., Nanda, J., Theodoulou, M., et al. The use of automated quantitative analysis to evaluate epithelial-to-mesenchymal transition associated proteins in clear cell renal cell carcinoma. PLoS One. 7, e31557(2012).
- Spurrier, B., Ramalingam, S., Nishizuka, S. Reverse-phase protein lysate microarrays for cell signaling analysis. Nat. Protoc. 3, 1796-1808 (2008).
- Hu, J., He, X., Baggerly, K. A., Coombes, K. R., Hennessy, B. T., et al. Non-parametric quantification of protein lysate arrays. Bioinformatics. 23, 1986-1994 (2007).
- Wang, X., Dong, Y., Jiwani, A. J., Zou, Y., Pastor, J., et al. Improved protein arrays for quantitative systems analysis of the dynamics of signaling pathway interactions. Proteome Sci. 9, 53(2011).
- Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society Series B (Methodological). 57, 289-300 (1995).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
