De Citrobacter rodentium Muis Model: Studeren pathogeen en gastheer Bijdragen aan infectieuze colitis

Samenvatting

Citrobacter rodentium infectie biedt een waardevol model voor enterische bacteriële infecties te bestuderen, evenals het hosten immuunreacties en colitis bij muizen. Dit protocol beschrijft de meting van de barrière integriteit, pathogeen belasting en histologische schade waardoor de grondige karakterisering van pathogeen en gastheer bijdragen aan murine infectieuze colitis.

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de stappen om een robuust model van infectieziekten en colitis produceren, evenals de methoden om Citrobacter rodentium infectie in muizen karakteriseren. C. rodentium is een gram-negatieve murine specifieke bacteriële pathogenen die nauw verband houdt met de klinisch belangrijke humane pathogenen enteropathogene E. coli en enterohemorragische E. coli. Na infectie met C. rodentium, immunocompetente muizen last van bescheiden en van voorbijgaande aard gewichtsverlies en diarree. Histologisch, worden intestinale crypte rek, immuun cel infiltratie en goblet cel depletie waargenomen. Klaring van infectie wordt bereikt na 3 tot 4 weken. Meting van intestinale epitheliale barrière integriteit bacteriologische belasting en histologische schade op verschillende tijdstippen na infectie, kan de karakterisering van muizenstammen gevoelig voor infectie.

De virulentiemechanismes waardoor bacteriële pathogenen koloniseren de darm van de gastheer, evenals specifieke gastheer responsen die verdedigen tegen dergelijke infecties worden slecht begrepen. Daarom C. rodentium model van enterische bacteriële infectie dient als een waardevol instrument om te helpen in ons begrip van deze processen. Enterische bacteriën zijn ook verbonden met inflammatoire darmziekten (IBDs). Er is verondersteld dat de onaangepaste chronische inflammatoire reacties die bij IBD patiënten ontwikkelen genetisch gevoelige individuen na abnormale blootstelling van de intestinale mucosale immuunsysteem darmbacteriën. Daarom is de studie van modellen van infectieuze colitis biedt aanzienlijke mogelijkheden voor het definiëren van potentieel pathogene gastheer responsen tegen darmbacteriën. C. rodentium geïnduceerde colitis is een dergelijke zeldzame model waarmee voor de analyse van gastheer responsen tegen darmbacteriën, bevordering van ons inzicht in potentiële mechanismen van IBD pathogenese;essentieel voor de ontwikkeling van nieuwe preventieve en therapeutische behandelingen.

Inleiding

Enterische infectie door bacteriële pathogenen triggers gastro-intestinale (GI) ontsteking en intestinale pathologie en pathofysiologie, waaronder diarree en intestinale epitheliale barrière disfunctie. De virulentie mechanismen waardoor bacteriële pathogenen koloniseren het maagdarmkanaal van de gastheer, evenals specifieke gastheer responsen die verdedigen tegen dergelijke infecties slecht begrepen, hebben echter recente ontwikkelingen in de modellering van enterische bacteriële infecties begonnen ons begrip van deze processen ondersteunen. Enterische bacteriën zijn ook verbonden met inflammatoire darmziekten (IBDs). De IBDs Crohn's Disease (CD) en UC complexe ziekten van onbekende etiologie die wordt gekenmerkt door chronische darmontsteking en weefselschade. Veel muismodellen van darmontstekingen bestaan ​​van spontane ontsteking in genetisch gemodificeerde stammen, zoals IL10 - / - muizen, chemische problemen met verbindingen, zoals natriumsulfaat dextran (DSS) en dinitrobenzene sulfonzuur (DNBS) ^1. Er is verondersteld dat de onaangepaste chronische ontstekingsreacties in IBD patiënten ontwikkelen genetisch gevoelige individuen op abnormale blootstelling van de intestinale mucosale immuunsysteem darmbacteriën ^2, dus de studie van modellen van colitis infectieuze ook een groot potentieel voor het definiëren van potentieel pathogene ontvangende . reacties op darmbacteriën Citrobacter rodentium geïnduceerde colitis is een van de zeldzame modellen van colitis infectieuze dat goed is gekarakteriseerd ^1,3, waardoor de analyse van gastheer responsen tegen enterische bacteriën en verder begrip van mogelijke mechanismen van IBD pathogenese, een essentiële stap in de ontwikkeling van nieuwe preventieve en therapeutische behandelingen.

C. rodentium is een gram-negatieve bevestiging en uitwissen (A / E), murine specifieke bacteriële pathogenen die nauw verband houdt met de belangrijke menselijkepathogenen enteropathogene E. coli (EPEC) en enterohemorragische E. coli (EHEC) ^3-8. De familie van A / E pathogenen nauw hechten aan het apicale membraan van gastheercel en de cecal colonepitheel, die een niet-invasieve voetstuk-achtige structuur van de gastheercel. Orale uitdaging met C. rodentium van 10 ⁸ -10 ⁹ organismen produceert een robuust model van infectieuze colitis gekenmerkt door dikke hyperplasie of verlenging van de crypten, mononucleaire immuuncellen infiltratie en goblet cel depletie ^3,4. De eerste site van kolonisatie, een paar uur na uitdaging is bovenaan cecal patch, gevolgd door overgang naar het distale colon 2 tot 3 dagen na infectie ^3. In immunocompetente muizenstammen wordt klaring van het pathogeen bereikt 3 tot 4 weken na infectie ^1,3,4. Echter veel genetisch gemodificeerde stammen, namelijk gen deficiënte of knockout (- / -) muizen zijn, bleken increa weersed vatbaarheid voor infecties resulteert in overdreven schade en / of chronische infecties en ontstekingen ^9-14. Het gebruik van deze infectieuze colitis model in deze knock-out stammen, veel ontbreekt aangeboren signaleringeiwitten, is onmisbaar in het onthullen van een aantal gastheereiwitten integraal naar de resolutie van de intestinale infecties en ontstekingen.

Protocol

1. Voorbereiding van Citrobacter rodentium Inoculum en orale sondevoeding van Muizen

1. Voorbereiden en autoclaaf Luria Bertani bouillon (LB).
2. Verkrijgen levensvatbare C. rodentium uit een bevroren glycerol voorraad en streeploos op LB-agar plaat met behulp van een steriele enten lus of pipetpunt. Incubeer bij 37 ° C geroerd. Enten 3 ml steriel LB bouillon in een falcon kweekbuis met kolonies van de LB plaat met een entnaald of pipetpunt. Bereiding van het inoculum worden gedaan met behulp van aseptische technieken.
3. Incubeer de C. rodentium cultuur aëroob bij 37 ° C overnacht in een benchtop incubatie schudinrichting bij 200 rpm. De geïnoculeerde LB-bouillon moet troebel zijn na een nacht cultuur.
4. Gebruik een lamp gaven maag gavage naald bevestigd aan een 1 ml spuit elke muis gavage met 100 ul van de overnacht C. rodentium cultuur. Voorzichtig scruff de muis, door stevig vast te pakken in de losse huid over zijn nek en rugmet duim en vingers. Trek het dier het hoofd met de wijsvinger naar het hoofd te immobiliseren en de slokdarm recht voor het inbrengen van de maagsonde naald.
5. Houd de muis in een rechtopstaande positie en richt de lamp punt van de maagsonde naald langs de zijkant van haar mond en over haar tong. Voorzichtig langs de naald langs het dak van de mond en vooruit naar beneden de slokdarm. Als er een weerstand gevoeld tijdens deze procedure, moet u de sonde naald en plaats deze opnieuw.
6. Injecteer langzaam 100 ul van de bacteriële inoculum en verwijder voorzichtig de sonde naald. Toezicht houden op de ademhaling en het gedrag van de muis na terugkeer het aan zijn kooi.

Opmerkingen:

• In stap 2 en 3, maken ook een falcon kweekbuis behulp van aseptische technieken met 3 ml steriel LB bouillon gedurende de nacht worden gekweekt om te garanderen dat er geen bacteriële besmetting van de bouillon zelf. De LB-bouillon moet duidelijk blijken na een nacht cultuur.
• voorzichtig roeren vóór de cultuur in de falcon-buis worden geladen spuiten voor gavage zodat een gelijke dosis bacteriën wordt aan elke muis in stap 4.
• Overnachting cultuur moet worden weggegooid als het is ingeënt voor meer dan 24 uur.
• Alle C. rodentium infecties en huisvesting van geïnfecteerde dieren worden uitgevoerd in een Biosafety Level 2 faciliteit.

2. Het meten van Colonic epitheliale barrière permeabiliteit in C. rodentium-geïnfecteerde muizen

1. Meet barrière integriteit op een gewenst tijdstip na infectie.
2. Op de dag van de test, om genoeg 4 kDa fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-dextran opgelost in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) tot een concentratie van 80 mg ^ml-1 tot elke muis gavage met 150 pi en de standaard curve te bereiden.
3. Nekvel de muis en gavage met 150 ul FITC-dextran. Trek voedsel uit de kooi op dit moment.
4. Verdoven muizen 4 uur nagavaging en verzamel zo veel mogelijk bloed (~ 450 pi) door hartpunctie. Voeg het bloed tot een eindconcentratie van 3% zuur citraat dextrose in een microcentrifugebuis om coagulatie te voorkomen. Euthanaseren de muizen en verzamel colon weefsels in PBS voor bacterietellingen (stap 3,1 tot 3,5) en in 10% formaline fixatie weefsel en uiteindelijk immunofluorescentiekleuring (stap 4,1 tot 4,8).
5. Draai de bloedmonsters bij 1.000 xg gedurende 12 min in een centrifuge bij 4 ° C. Verzamel de serum en vul aan tot 1/10 en 1/100 in PBS. Voeg 100 ul van elk monster bij deze twee verdunningen van een plaat met 96 putjes in duplo.
6. De standaard curve te bereiden, verdun het oorspronkelijke 80 mg ^ml-1 FITC-dextran gebruikt om de muizen in PBS maagsonde de volgende concentraties: 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25 en 0 ug / ml . Voeg 100 pl van elke concentratie een plaat met 96 putjes in drievoud.
7. Kwantificeer de fluorescentie van elk monster met behulp van een fluorometer bij een excitatie wavelength van 485 nm en 535 nm emissie golflengte.
8. Analyseer de ruwe gegevens getrokken waarbij de standaardcurve. Voer de ruwe gegevens voor elk monster in de vergelijking van de lijn die door de standaardcurve van de concentratie van FITC-dextran bepalen in elk monster.

Opmerkingen:

• Vanaf stap 4 verder, houden bloedmonsters op ijs en het minimaliseren van de blootstelling aan licht.
• Bij het meten van epitheliale barrière-integriteit een tijdstip op of vóór en 7 dagen na infectie is optimaal, aangezien ernstige weefselbeschadiging na dit punt. Het meten van barrière-integriteit voor ernstige schade voorkomende kunt u bepalen maximale verschillen in permeabiliteit tijdens C. rodentium infectie tussen muizenstammen.
• Zorg ervoor dat niet-geïnfecteerde muizen in de controlegroep ook worden getest op epitheliale barrière integriteit.

3. Meting van de bacteriële verontreiniging in de weefsels van C. rodentium-geïnfecteerde muizen

1. Voeg 1 ml steriele PBS eennd een geautoclaveerd metalen kraal met een ronde bodem 2 ml centrifugebuis met behulp van aseptische techniek. Afzonderlijke weefsels verzameld van elk dier worden in afzonderlijke buizen PBS. Weeg de buizen voorafgaande aan de toevoeging van het weefsel.
2. Verwijder de blindedarm en de dikke darm van de muis. Scheid de blindedarm van de dikke darm en druk de luminale inhoud behulp van een tang. Voeg de inhoud van een buis PBS. Na scheiding 0,5 cm secties van het distale colon en blindedarm 10% formaline fixatie lengterichting opengesneden de resterende colon en blindedarm en wassen met steriele PBS voordat weefsels in tubes.
3. Weeg de buizen met PBS en het weefsel Homogeniseer de monsters met een bead beater gedurende 6 minuten bij 30 Hz.
4. Met behulp van aseptische technieken, voeg 180 ul steriele PBS per putje van een plaat met 96 putjes. Voeg 20 ul van elk monster gehomogeniseerde het eerste putje in elke rij. Meng goed en serieel te verdunnen, het toevoegen van 20 pi van elk voorheen goed om verdunningen te verkrijgen van 10 ^-1 (we eerstll) tot 10 ^-6. Plaat 10 pi van elke verdunning van elk monster in drievoud op een vierkante bodem LB plaat met een raster. Incubeer overnacht bij 37 ° C.
5. Tellen kolonievormende eenheden (CFU) en de gemiddelde 3 tellen en noteer de verdunning waarbij elk monster werd geteld. Vermenigvuldigen gemiddelde CFU met 50, tot 20 ul van de oorspronkelijke 1 ml monster werd gebruikt, en met de verdunningsfactor waarop het monster werd geteld resulteert in CFU / ml. Tenslotte delen door het weefsel gewicht CFU / g bepalen.

4. Histologische evaluatie en immunofluorescentiekleuring van geïnfecteerde Colon Tissues

1. Verzamel weefsels als in stap 3.2. Bewaren weefsels in formaline 's nachts, daarna wassen met 70% ethanol. Embedden weefsels in paraffine en gesneden 5 um secties voor kleuring. Vlek met hematoxyline & eosine voor histologische beoordeling en gaat u verder met de volgende stappen voor immunofluorescentie kleuring.
2. Om weefsels deparaffinize vóór de kleuring, plaats schuift ineen Coplin kleuring pot en zet in 65 ° C waterbad gedurende 10 minuten. Vervolgens plaats dia's in xyleen voor vier wasbeurten van 2 minuten elk. Objectglaasjes dan gerehydrateerd met twee 5 minuten wassen in 100% ethanol, gevolgd door 5 min was in elk van de volgende: 95% ethanol, 75% ethanol en dH ₂ 0. Deze wasbeurten moet worden gedaan in een hoofdkap gebruiken om blootstelling aan schadelijke dampen te voorkomen.
3. Plaats de glaasjes in de Coplin pot met voorverwarmd natriumcitraatbuffer en plaats in een stomer gedurende 30 min, laat zitten voor 30 minuten. Dit proces breekt het eiwit verknopingen gevormd door formalinefixatie ophalen potentieel antigene plaatsen.
4. Wassen met PBS gedurende 5 min azide, driemaal. Droge slides en mark omgeving weefsel met een PAP pen op een hydrofobe barrière te creëren, waarbij de kleurstoffen gelokaliseerd op het weefsel.
5. Block weefsel gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met blokkerende buffer (bijvoorbeeld α-geiteserum) in een vochtige kamer immunokleuring.
6. Verdun primary antilichaam gewenste concentratie met antilichaamverdunning buffer. Giet blokkeerbuffer en breng 50 tot 100 ul van primair antilichaam aan weefsels. Incubeer bij 4 ° C gedurende de nacht of bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
7. Wassen met PBS gedurende 5 min azide, driemaal. Voeg 50 tot 100 pi secondair antilichaam verdund in buffer antilichaamverdunning aan de weefsels en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur in het donker. Wassen met dH ₂ O 5 minuten, driemaal.
8. Uitdrogen dia's, voeg DAPI Verleng Gold montage medium en breng een dekglaasje aan. Bekijk dia's onder een fluorescentie microscoop.

Opmerkingen:

• PBS azide kan gesubstitueerd met vers bereide PBS als alternatief voor bacteriële groei in het wasmedium uit stap 4 verder voorkomen.

Resultaten

Tijdens een standaard infectie experiment worden de muizen geïnfecteerd met ongeveer 2,5 x 10 ⁸ CFU door gavage van 100 pi overnacht C. rodentium cultuur. Infectie van C57BL / 6 muizen met C. rodentium resulteert in een bescheiden en van voorbijgaande aard gewichtsverlies en diarree. Hoewel een zeldzame gebeurtenis met C57BL / 6 muizen, kunnen dieren ziek worden en vereisen euthanization. Derhalve muizen worden gecontroleerd mate van gewichtsverlies en symptomen van angst zoals piloerect bon...

Discussie

Citrobacter rodentium infectie een waardevol model voor de studie van zowel infectieziekten en colitis bij muizen. Dit unieke model maakt de karakterisering van zowel gastheer reacties en de pathogene eigenschappen van bacteriën. De stappen die in dit protocol detail het succesvolle gebruik van dit model.

Er zijn verschillende kritische stappen in dit protocol in gedachten te houden bij het opwekken van colitis en het analyseren van reacties. Enerzijds de bereiding van een verse ove...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van de Reagens / Materiaal	Vennootschap	Catalogusnummer	Reacties
Luria Broth	ABM	G247	Voeg 25 g LB poeder 1 liter water. Autoclaaf voor gebruik.
Vierkante bodem plaat met rooster	Visser	08-757 11A-
Falcon cultuur buis	Sarstedt	62.515.006
Bulb getipt maag gavage naald	Fine Science Tools	18.060-20
1 ml spuit	BD Biosciences	309659
4 kDa FITC-dextran	Sigma	FD-4
Citroenzuur	Sigma	C7129
Natriumcitraat	Visser	S279-500
Dextrose	Visser	D16.1
Zuurcitraatdextrose			20 mM ctiric zuur, 110 mM natriumcitraat, 5 mM dextrose
Zwarte 96-putjesplaat	Visser	07-200-762
Metalen kralen (5 mm)	Qiagen	69989
10% formaline	Visser	5F93-4
5 ml flacon	DiaMed	STK3205
Hematoxylin	Visser	H345-23
Eosine	Visser	E511-100
Xyleen	Visser	HC700-1GAL
Tween 20	Sigma	P5927
Coplin vlekken jar	VWR	47751-792
Natriumcitraatbuffer			10 mM natriumcitraat, 0,05% Tween 20, pH 6,0
Pap pen	Cedarlane	Mu22
Geitenserum	Sigma	G902-3
Bovine Serum Albumine (BSA)	Visser	BP1600-100
Triton X-100	Sigma	T8532
Natriumazide	Sigma	SZ002
Het blokkeren van buffer			2% geitenserum, 1% BSA, 0,1% triton X-100, 0,05% Tween 20, 0,05% natriumazide, 0,01 M PBS, pH 7,2, mix en bewaar bij 4 ° C.
Antilichaamverdunning buffer			0,1% triton X-100, 0,1% BSA, 0,05% natriumazide, 0,04% EDTA
Het blokkeren van buffer & antilichaamverdunning buffer voor tir			Dezelfde recepten als hierboven, maar zonder toevoeging van detergentia (Triton X-100 en Tween 20)
Verleng Gold antifade Reagens met DAPI	Invitrogen	P-36931
Dekglaasjes	Visser	12.54SE
Benchtop incubatie shaker	Barnstead Lab Line	Max Q4000
Fluorometer	Perkin Elmer	Victor2D
Gekoelde centrifuge	Beckman Coulter	Microfuge 22R
Stoomboot	Black & Decker
Fluorescentiemicroscoop	Zeiss	Axio Image.Z1