Methodenartikel

Verbeterd protocol voor Laser Microdissection der humane pancreatische eilandjes Van Chirurgische Specimens

DOI:

10.3791/50231

⸱

6 januari 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Molecular Diabetology, Paul Langerhans Institute Dresden, 2Department of GI-, Thoracic- and Vascular Surgery, University Hospital Carl Gustav Carus, University of Technology Dresden, 3Department of Endocrinology and Metabolism, Metabolic Unit University of Pisa, 4Labs DC0522, Lilly Corporate Center, 5Genomics, Faculty of Medicine Imperial College London, 6Vital-IT, SIB Swiss Institute of Bioinformatics, 7Clinical Biochemistry, Hannover Medical School, 8Cell Physiology and Metabolism, Medical School, University of Geneva, 9Department of Pathology, University Hospital Carl Gustav Carus, University of Technology Dresden, 10R&D DIAB Division / Translational Medicine, Sanofi-Aventis

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Laser microdissectie is een techniek die het herstel van de geselecteerde cellen uit minieme hoeveelheden parenchym mogelijk maakt. Hier beschrijven we een protocol voor die menselijke pancreatische eilandjes van chirurgische preparaten worden gebruikt voor transcriptoom studies. Ons protocol verbetert de intrinsieke autofluorescentie van menselijke beta-cellen, waardoor hun collectie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Laser microdissectie (LMD) is een techniek die het herstel van de geselecteerde cellen en weefsels van kleine hoeveelheden parenchym 1,2 toelaat. De gedissecteerde cellen kunnen worden gebruikt voor verschillende onderzoeken, zoals transcriptoom of proteomische studies, DNA assessment of chromosoomanalyse 2,3. Een bijzondere uitdaging toepassing van LMD transcriptoomanalyse, die vanwege de labiliteit van RNA 4, kan bijzonder prominent wanneer cellen worden geprepareerd uit weefsels die rijk RNases zoals de pancreas. Een microdissection protocol dat snelle identificatie en verzameling van doelwitcellen kan essentieel in deze instelling om het weefsel verwerkingstijd verkorten en dus om RNA houdbaarheid.

Hier beschrijven we een protocol voor die menselijke pancreatische beta cellen van chirurgische specimens worden gebruikt voor studies transcriptoom 5. Kleine stukjes van de alvleesklier van ongeveer 0,5-1 cm 3 werden uit de gezonde weergegeven marges van operatief pancreas specimens, ingebed in Tissue-Tek oktober verbinding, direct ingevroren in 2-methylbutaan gekoeld en opgeslagen bij -80 ° C tot snijden. Veertig seriële secties van 10 um dikte werden gesneden op een cryostaat onder -20 ° C instelling afzonderlijk overgebracht naar glazen objectglaasjes, gedroogd in de cryostaat voor 1-2 min en bewaard bij -80 ° C.

Onmiddellijk vóór de laser microdissectie procedure werden secties gefixeerd in ijskoude, versbereide 70% ethanol gedurende 30 seconden, gewassen met 5-6 dips in ijskoud DEPC-behandeld water, en gedroogd door twee minuut incubaties in ijskoude 100% ethanol gevolgd door xyleen (die wordt gebruikt voor weefseldehydratatie) gedurende 4 min; weefselcoupes werden vervolgens aan de lucht gedroogd daarna gedurende 3-5 min. Belangrijker alle stappen behalve de incubatie in xyleen werden uitgevoerd met ijskoude reagentia - een wijziging op een eerder beschreven protocol 6. Utilization van ijskoude reagentia resulteerde in een sterke stijging van de intrinsieke autofluorescentie van beta-cellen, en gefaciliteerd hun erkenning. Voor microdissectie, vier secties werden gedehydrateerd telkens: twee werden in een folie verpakte 50 ml buis, het weefsel bescherming tegen vocht en bleken, de twee andere werden onmiddellijk gemicrodissecteerde. Deze procedure werd uitgevoerd met een PALM microbundel instrument (Zeiss) onder toepassing van de Auto Laser Pressure Wegslingeren (AutoLPC) mode. De voltooiing van beta cel / eilandje dissectie van vier cryocoupes die niet meer nodig zijn dan 40-60 min.. Cellen werden verzameld in een AdhesiveCap en gelyseerd met 10 ui lysis buffer. Elke afzonderlijke RNA monster voor transcriptoom analyse werd verkregen door het combineren van 10 cellen gemicrodissecteerde monsters, gevolgd door RNA-extractie met behulp van de Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). Dit protocol verbetert de intrinsieke autofluorescentie van menselijke beta-cellen, waardoor hun snelle en accurate herkenning en collectie. Verdere verbetering van deze procedure in staat kan stellen de dissectie van fenotypisch verschillende beta-cellen, met mogelijke consequenties voor een beter begrip van de veranderingen die gepaard gaan met diabetes type 2.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bevriezing van de Mens pancreasweefsel

  1. Verwijder vetweefsel, bloedvaten, zenuwen en niet-parenchym weefsel met een scalpel en pincet, en snijd de pancreas weefsel in stukken (~ 0.5-1 cm blokjes).
  2. Plaats een alvleesklierweefsel stuk in het midden van een Cryomold, en volledig te bedekken het met koud Tissue-Tek oktober Compound. Plaats de Cryomold in een pot waarvan de bodem is bedekt met voorgekoelde 2-methylbutaan en snap-vries in vloeibare stikstof. Bewaar het bevroren monster bij -80 ° C.

2. Voorbereiding van vriescoupes

  1. Draag handschoenen in alle stappen om denaturatie van RNA te vermijden.
  2. Reinig de cryostaat mes, preparaathouder en penseel met koude 100% ethanol en RNase Away. Plaats de bevroren weefsel binnen de cryostaat.
  3. Wacht tot het weefsel, mes en kwast te bereiken -20 ° C. Label de SuperFrost Plus dia's en pre-cool ze in de cryostaatkamer tijdens het wachtenhet weefsel tot -20 ° C. bereikt
  4. Breng de Tissue-Tek oktober Compound op de preparaathouder en plaats de bevroren weefsel op de top.
  5. Zodra de Tissue-Tek oktober Compound is bevroren trim de cryoblock en verwijder een eventueel overschot van Tissue-Tek oktober Compound met een scheermesje.
  6. Snijd een totaal van 40 opeenvolgende 10 pm plakjes uit de pancreas weefsel blok. Daarnaast adviseren wij het snijden van een eerste en middelste segment te worden opgeslagen voor overzichtstekeningen van de pancreas gedeelte dat de identificatie van eilandjes kan binnen de plakken te vergemakkelijken tijdens de microdissectie proces.
  7. Breng de secties van het mes naar het centrum van een SuperFrost Plus dia door op de achterzijde van de schuif met een vinger (bedekt met een handschoen) te warmen alleen het gebied van de sectie die moet hechten.
  8. Droog de secties 1-2 min in de cryostaat bij -20 ° C, waarna u ze in een dia box geplaatst op droogijs. Bewaar de sectiesbij -80 ° C.
  9. Reinig indien nodig het mes met papieren handdoeken en koude 100% ethanol.

3. Uitdroging van vriescoupes

  1. Bereid de Reagentia: giet 30 ml vers bereide 70% ethanol, 30 ml DEPC-behandeld water, 2x30 ml 100% ethanol en 30 ml xyleen in 50 ml Cellstar buizen (Falcons) chill en alle reagentia (behalve xyleen) op ijs bewaren.
  2. Reinig de werkruimte onder de motorkap met 100% ethanol en RNaseZAP.
  3. Worden twee cryosecties als volgt: in ijskoude 70% ethanol vastgesteld voor 30 sec, wassen met 5-6 lijst dips in ijskoud DEPC-behandeld water, tweemaal drogen gedurende 1 min in ijskoude 100% ethanol, incuberen gedurende 4 minuten in xyleen bij kamertemperatuur (25 ° C) en drogen gedurende 3-5 min. Herhaal deze stap met een ander paar vriescoupes.
  4. Terug Plaats twee gedroogde cryocoupes om een ​​back-in een 50 ml Cellstar buis omwikkeld met aluminiumfolie om ze te beschermen tegen licht en vocht.

4. Laser Microdissection van Beta-cellen met PALM microbundel, Zeiss

  1. Reinig de microscoop met RNaseZAP en monteer de Adhesive Cap in de RoboMover.
  2. Stel de volgende instellingen: Filter set 09 (excitatie: 450-490 nm, emissie> 515 nm), AutoLPC-modus, 50% laserenergie, 65% laser focus, 100% laser de snelheid, 5 micrometer afstand tussen AutoLPC schoten, 6 micrometer afstand naar lijn, werkhoogte: -10.100.
  3. Plaats een dia in het podium.
  4. Zoek de autofluorescente beta-cellen onder de microscoop visualisatie (5x of 10x lens).
  5. Schakel over naar de 40x lens, selecteert u de beta-cellen met de "vrije hand" selectie tool en microdissect ze met behulp van de laser.
  6. Leg het weefsel van vier uitgedroogd vriescoupes in een AdhesiveCap.
    Opmerking 1: de tijd om de beta cellen van een gedehydrateerde cryosection ontleden mag niet langer dan 10-20 min om rehydratatie van de weefselsecties die leidt tot voorkomenRNA degradatie.
    Opmerking 2: controleer succesvolle microdissectie proces door middel van visuele inspectie na het verplaatsen van de etappe naar de controlepost.

5. Lyse van gemicrodissecteerde Beta Cell Verrijkt Tissue

  1. Verwijder de AdhesiveCap de RoboMover.
  2. Pipet 10 pl extractiebuffer (XB, PicoPure RNA Isolation Kit, Arcturus) in het deksel van de AdhesiveCap en incubeer ondersteboven bij 42 ° C gedurende 30 minuten.
  3. Spin down bij 10.000 xg en zet het lysaat op droog ijs. Bewaard bij -80 ° C tot de RNA-extractie uitgevoerd.
  4. Herhaal stap 3.) Tot 5.) Met alle andere secties.

6. RNA-extractie

  1. Combineer alle tien 10 ul lysaten
  2. Ga door met de RNA isolatie door te werken bij kamertemperatuur volgens het protocol van de PicoPure RNA Isolation Kit, Arcturus, met een 1:1 verhouding extractiebuffer (XB) tot 70% Ethanol (waaronder DNase behandeling).

7. RNA Analysis

  1. Gebruik 1 ui RNA voor de analyse van de kwaliteit en kwantiteit met behulp van een Agilent 2100 bioanalyser (PicoChip). Kwantitatieve evaluatie uitgevoerd ten opzichte van een standaard RNA geladen in parallel op de chip.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zoals getoond in figuur 1, de gemodificeerde protocol drogen tot een verbetering van de bètacellen autofluorescentie vergeleken met de eerder gepubliceerde protocol 6. Het toepassen van de beschreven protocol werd elk van 39 chirurgische pancreas exemplaren gebruikt tot 40 seriële cryocoupes voor een gemiddelde van 31'544'704 micrometer 3 weefsel / pancreas monster (bereik: 8'742'390 - 81'522'153 micrometer 3) het genereren van zoals getoond in

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven een betrouwbare aanpak voor de laser microdissectie (LMD) van menselijke eilandjes van chirurgische pancreas exemplaar. Op voorwaarde dat een LMD microscoop beschikbaar is, kan deze procedure worden toegepast op elk onderzoeksinstelling het uitvoeren van een gedeeltelijke pancreatectomies, waardoor de toegang tot de menselijke eilandje materiaal van zowel niet-diabetische en type 2 diabetes. Dit is vooral van belang omdat het gebrek aan pancreata aangeboden eilandje isolatie. Gunstige aspecten van LMD opz...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We willen al onze collega's die hulp, advies en kritische inbreng van de verschillende stappen van dit project bedanken. De productie van deze video artikel werd ondersteund met middelen van IMIDIA ( http://www.imidia.org ), het Duitse ministerie van Onderwijs en Onderzoek (BMBF) aan het Duitse Centrum voor Diabetes Onderzoek (DZD, http://www.dzd -ev.de ) en het Universitair Ziekenhuis Carl Gustav Carus aan de University of Technology Dresden. De werkzaamheden die leiden tot deze publicatie heeft steun gekregen van het Innovative Medicines Initiative gemeenschappelijke onderneming onder subsidieovereenkomst nr. 155005 (IMIDIA), middelen waarvan van de financiële bijdrage bestaat uit Zevende Kaderprogramma van de Europese Unie (FP7/2007-2013) en EFPIA bedrijven 'in natura bijdrage.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Naam van het reagens Vennootschap Catalogusnummer Reacties
2-methylbutaan (isopentaan) ROTH 3927,1
AdhesiveCap (ondoorzichtig, 500 pl) ZEISS 415190-9201-000
Cellstar buizen (50 ml) Greiner Bio-One 210 261 met ondersteuning rok
Cellstar buizen (50 ml) Greiner Bio-One 227.261
Diethylpyrocarbonaat (DEPC) SIGMA D 5758
Droogijs
Ethanol absolute VWR 20821.310
Vloeibare stikstof
Paint brush
PALM microbundel ZEISS
Peel-a-Way inbedding mallen (afgekapt), 12 x 12 mm ProSciTech RR12 Top interne 22x22 mm, diepte 21 mm
Arcturus PicoPure Bevroren RNA Isolation Kit Applied Biosystems KIT 0204
Kunststof klem
Scheermes
RNase-vrij DNase Set Qiagen 79254
RNaseZAP SIGMA R 2020
Scalpel /chirurgisch mes Techno Cut 2800111
SuperFrost Plus hechting microscoopglaasjes Thermo Scientific J1800AMNZ 25x75x1.0 mm
Tissue-Tek oktober Compound Sakura 4583 of 0807000022
Pincet BRAUN BD168R
Xyleen VWR 28975.291

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bonner, R. F., Emmert-Buck, M., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
  2. Suarez-Quian, C. A., Goldstein, S. R., et al. Laser capture microdissection of single cells from complex tissues. Biotechniques. 26 (2), 328-3235 (1999).
  3. Espina, V., Wulfkuhle, J. D., et al. Laser-capture microdissection. Nature Protocols. 1, 586-603 (2006).
  4. Mikulowska-Mennis, A., Taylor, T. B., et al. High-quality RNA from cells isolated by laser capture microdissection. Biotechniques. 33 (1), 176-179 (2002).
  5. Bötticher, G., Sturm, D., Ehehalt, F., Knoch, K. P., Kersting, S., Grützmann, R., et al. Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients. J. Vis. Exp. (53), e2962(2011).
  6. Marselli, L., Sgroi, D. C., et al. Laser capture microdissection of human pancreatic beta-cells and RNA preparation for gene expression profiling. Methods in Molecular Biology. 560, 87-98 (2009).
  7. Marselli, L., Thorne, J., et al. Gene Expression of Purified {beta}-Cell Tissue Obtained from Human Pancreas with Laser Capture Microdissection. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 93, 1046-1053 (2008).
  8. Bottino, R., Balamurugan, A. N., et al. Response of human islets to isolation stress and the effect of antioxidant treatment. Diabetes. 53 (10), 2559-2568 (2004).
  9. Abdelli, S., Ansite, J., et al. Intracellular stress signaling pathways activated during human islet preparation and following acute cytokine exposure. Diabetes. 53 (11), 2815-2823 (2004).
  10. Negi, S., Jetha, A., et al. Analysis of beta-cell gene expression reveals inflammatory signaling and evidence of dedifferentiation following human islet isolation and culture. PLoS One. 7 (1), e30415(2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Laser MicrodissectionPancreatic IsletsHuman TissueTissue PreparationCryosectioningAutofluorescence DetectionRNA PreservationTranscriptomic AnalysisPALM MicroBeamAdhesiveCap Collection

Gerelateerde artikelen