De volledige en actuele "Rotifer polycultuur Method" voor het opfokken van First Feeding zebravis

Samenvatting

Larven van zebravissen zijn aangepast om zich te voeden met zoöplankton. Het is mogelijk om in het laboratorium gebruik te maken van deze natuurlijke eigenschap door de vissen in de eerste voedingsfase samen in hetzelfde systeem te kweken met levende zoutwaterrotifers. Deze 'polycultuur'-strategie bevordert een hoge groei en overleving met minimale arbeid en verstoring voor de larven.

Samenvatting

De zebravis (Danio rerio) is een modelorganisme van toenemende belang in vele wetenschapsgebieden. Een van de meest veeleisende technische aspecten van het kweken van deze soort in het laboratorium is het grootbrengen van pas gevoerde larven tot het juveniele stadium met hoge groei- en overlevingspercentages. De centrale beheersuitdaging van deze ontwikkelingsperiode draait om het bijna continu aanbieden van hoogwaardige voeders aan de vissen zonder de waterkwaliteit te compromitteren. Omdat zebravislarven goed aangepast zijn om kleine zoöplankton in de waterkolom te eten, worden levende prooidieren zoals brachionide rotiferen, Artemia en Paramecium algemeen erkend als de favoriete voeders, in ieder geval totdat de vissen het juveniele stadium bereiken en efficiënt kunnen voeden met verwerkte diëten. Dit protocol beschrijft een methode waarbij pas uitgekomen zebravislarven samen met levende zoetwaterrotiferen (Brachionus plicatilis) in hetzelfde systeem worden gekweekt. Deze polycultuuraanpak biedt vissen een 'op aanvraag' voedselbron van hoogwaardige levende voeding zonder chemische afvalstoffen te produceren op niveaus die anders de prestaties zouden beperken. Belangrijk is dat, omdat het systeem zowel de natuurlijke hoge productiviteit van de rotiferen als de gedragsvoorkeuren van de vissen benut, het onderhoudswerk laag is. Het volgende protocol beschrijft een bijgewerkte, stap-voor-stap procedure die de productie van rotiferen (schaalbaar naar elk gewenst niveau) omvat voor gebruik in een polycultuur van zebravislarven en rotiferen die maximale prestaties bevordert tijdens de eerste 5 dagen van exogene voeding.

Inleiding

De zebravis (Danio rerio) is een vooraanstaande proefdier gebruikt in een groeiend aantal wetenschappelijke disciplines, waaronder maar niet beperkt tot ontwikkelingsstoornissen genetica, toxicologie, gedrag, aquacultuur, regeneratieve biologie, en het modelleren van vele menselijke aandoeningen ^1-5. Hoewel de species relatief gemakkelijk in het laboratorium te handhaven, zijn er een aantal managementuitdagingen verband met hun cultuur ^6. De meest prominente van deze is opkweek van larven, vooral wanneer de vissen eerst beginnen te voeden na gas blaas inflatie ^7. Onder normale gecontroleerde omstandigheden, deze ontwikkelingsfase gebeurtenis bij ~ 5 dagen na de bevruchting (DPF), met de volgende 3 - 5 dagen kweek zijn bijzonder kritisch ^7. De centrale technische moeilijkheid in deze fase is om adequaat te voldoen aan de nutritionele behoeften van de eerste voeding larven - feed items moet de juiste maat zijn, Digestible, aantrekkelijk, en beschikbaar op een bijna continue basis, zonder dat overmatige afval kweken tanks. Historisch gezien is dit meestal bereikt door het leveren van een groot aantal kleine hoeveelheden voer om de vis in tanks, samen met routine water uitwisseling ^8,9. Hoewel deze methoden zijn tot op zekere hoogte succesvol, ze zijn inefficiënt, vereisen een hoge input van arbeid, en terug te keren enige variabele en beperkte de tarieven van de groei en overleving ^10.

In de natuur, de zebravis larven vermoedelijk voeden met overvloedige kleine zoöplankton aanwezig in de waterkolom ^11. Daarom larvicultuur protocollen die levend voer zoals Paramecium, raderdiertjes en artemia bevatten typisch efficiëntste ^7. In 2010, Best en co-auteurs aangetoond dat het mogelijk was om larvale zebravis groeien statische, brak water met zout raderdiertjes de eerste 5 dagen van exogene voeding ^12. Deze aanpak, die harnases de natuurlijke hoge productiviteit van rotifer culturen om een ruime, zeer voedzaam prooi te bieden zonder vervuiling van het water, levert zeer hoge tarieven van larvale groei en overleving met een lage input van arbeid ^12,13. De laatste jaren hebben een toenemend aantal laboratoria wereldwijd variaties van dit protocol vastgesteld, en velen nu kweken raderdiertjes op continue wijze om de kweek systemen ¹⁴ ondersteunen.

In de afgelopen jaren hebben methoden voor zowel raderdiertje / zebravis polycultuur en raderdiertje productie is verfijnd en verbeterd om meer gestandaardiseerde en gemakkelijk schaalbaar geworden. Dit artikel bevat stap-voor-stap instructies voor het 1) continu en robuust rotifeer productie en 2) de oprichting van de rotifer / zebravis polycultuursysteem gebruikt om de sterke groei van de vis te ondersteunen voor de eerste 5 dagen van exogene voeding.

Protocol

1. Rotifer Cultuur

1. Basiscomponenten van een Cultuurstelsel met een 100 L kweekvat
   1. Verzamel alle onderdelen voor de raderdiertje cultuur setup. De raderdiertje cultuur opstelling bestaat uit een kweekvat (CV) aan de raderdiertjes groeien; een gelijkaardig schip feedout raderdiertjes (feedout kweekvat, FCV) te behouden; een ronde bodem uitkomen jar (voerreservoir, FR) voor opslag van de algen toevoermengsel (AFM); een luchttoevoer (AS) te beluchten de CV, FCV en de FR; een peristaltische pomp met een lichtmeettijd (PMT) om de levering van algen voeding in de CV en FCV controleren; floss en een roetfilter (FPF), dat zit in de CV.
      LET OP: Een compleet overzicht van supplies en onderdelen wordt in de Materials List.
2. Configuratie
   1. Verheffen de CV en FCV op een stand of tafel, zodat de culturen gemakkelijk via een afvoer passend in een verzameling vervolg kan worden geoogstainer (Figuur 1). Gebruik flexibele luchttoevoerslang de AS verbinden met een lengte van stijve buis in elk kweekvat. Zorg ervoor dat de slang lang genoeg is om lucht te leveren aan de onderkant van de CV of FCV.
   2. Gebruik een kleine capaciteit luchtleiding naar de AS verbinden met een lengte van stijve buis die zich uitstrekt tot de bodem van het FR die de AFM bevat. Installeer een klep in elke luchtleiding om de luchtstroom te regelen. Sluit de FR aan de PMT diervoeders levering slangen, en voer de slang van de PMT in een gat geboord in de zijkant van de CV / FCV, in de buurt van de top. Figuur 1.
3. Beginnen
   1. Vul het kweekvat tot 90% van het beschikbare volume met omgekeerde osmose (RO). Als RO niet beschikbaar is, gebruik schone, gedechloreerd gemeentelijke water; Er moet echter een bioveiligheid risicobeoordeling worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat er geen potentieel pathogene organismen aanwezig in de bron water. OPMERKING: Een dergelijke analyse kan worden uitgevoerddoor een gekwalificeerde water testlaboratorium.
   2. Dosis van de cultuur schip water met aquarium zout aan een zoutgehalte van 15 g / l te bereiken. Stel de luchtstroom in het vat, zodat het blijft een "kook", en dan langzaam voeg de gemeten hoeveelheid zout aan de cultuur vat totdat deze volledig is opgelost door de beluchting. Verder beluchten het water gedurende> 1 uur om te verzekeren dat deze goed zuurstof.
   3. Maak de algen toevoermengsel. Tot 3 L schoon, chloorvrij vers (0 ppm) water voeg 100 g NaHCO ₃ en 100 g ammonia neutralisatiemiddel (natrium hydroxymethylsulfonate). Dit laatste reagens biedt het extra voordeel van het neutraliseren van eventuele resterende chloor uit het leidingwater of bleekmiddel residuen van het zuiveren van de cultuur-apparatuur. Het is cruciaal om te waarborgen dat deze verbindingen volledig opgelost. Voeg vervolgens 1 liter algenconcentraat (biomassa drooggewicht ~ 15%). Voeg het voedingsmengsel aan de FR en bewaar bij 4 ° C.
   4. Voeg een voorgerecht cultuur van 5-10.000.000 Brachionus plicatilis raderdiertjes aan de CV met daarin de koolzuurhoudende 15 g / l zoutgehalte water. Als de raderdiertjes gekoeld zijn tijdens het transport of opslag, moeten ze langzaam (gedurende 30 minuten of langer) geacclimatiseerd aan de temperatuur van het water in het kweekvat (25 - 27 ° C).
   5. Schakel de PMT en beginnen met het pompen van de algen voeding in de raderdiertje cultuur schip. Met de functie timer van de PMT, stelt de levering tarief van algen voedingsmengsel zodat ~ 1,6 ml van algen toevoermengsel wordt geleverd per miljoen raderdiertjes in de cultuur, per dag. Verdeel voeder in kleine porties op regelmatige tijdstippen in de loop van een periode van 24 uur; hoe frequenter de voedingen, hoe beter.
   6. Kalibreer het debiet van de pomp door met de hand inschakelen van de PMT voor een bepaalde periode (bijvoorbeeld 1 min) en verzamel de algen die pompt in die periode in een maatcilinder of bekerglas. Als bijvoorbeeld de PMT doses 5 ml algen in 1 min, vervolgens de dosering zou5 ml algen / min.
   7. Bereken de vereiste dagelijkse voeding tarief door het aantal raderdiertjes aanwezig te vermenigvuldigen, in miljoenen, met 1,6 ml. Bijvoorbeeld, zou een rotifer cultuur met een populatiegrootte van 100 miljoen raderdiertjes vereisen ~ 160 ml voer per dag (100 x 1,6 ml).
   8. Stel de PMT aan de totale dagelijkse voeding eis regelmatig dosis gedurende een periode van 24 uur. Bijvoorbeeld kan toediening van een totale dagelijkse toevoer van 160 ml worden geleverd in porties eens 3 uur gedurende een periode van 24 uur met een PMT set met een doseerpomp snelheid van 5 ml / min gedurende 4 min, 8 maal daags (5 ml / min x 4 min = 20 ml x 8 voedingen = 160 ml).
   9. Laat de kweek groeien totdat genereert de gewenste populatie, typisch van 48 - 72 uur vóór het oogsten. 24 uur na de start, voeg de floss roetfilters om de cultuur vat en begint normaal onderhoud.
4. Onderhoud
   LET OP: De cultuur werkt op een continue basis en vereist routine onderhoud dat idealiter tegelijkertijd worden uitgevoerd elke dag, in deze volgorde.
   1. Vul het FCV tot 90% van het beschikbare volume met schone, gedechloreerd zoet water, gedoseerd met 10 g / l aquarium zouten. Zorg ervoor dat het water goed gemengd is, en dat al het zout volledig is opgelost. Stel de luchtstroom in het vat, zodat het blijft een "kook". Meet het zoutgehalte met een refractometer en ervoor te zorgen dat het zoutgehalte is 10 g / l. Is het essentieel om dit doel te bereiken en niet te overschrijden.
   2. Proef de raderdiertjes in het CV: Zorg ervoor dat de cultuur is goed gemengd, verzamel dan 3 monsters van een 2-3 elk met een transfer pipet of autopipettor ml, uit verschillende delen van de cultuur. Combineer deze monsters in een buis of flesje van handige formaat (bv 10 ml).
   3. Overdracht 1 - 2 ml van het gecombineerde monster in een petrischaal, zodat deze kan worden gevisualiseerd onder een stereomicroscoop. Controleer de kwaliteit van de cultuur (zwemmen gedrag van deraderdiertjes, aanwezigheid van vrijstaande eieren, verontreinigende protozoa).
   4. Immobiliseer de raderdiertjes in de resterende gecombineerde monster door het toevoegen van 100 pl 50% Lugols joodoplossing het monster. Binnen enkele seconden na toevoeging van de Lugols, observeert de raderdiertjes zwemmen stoppen. Nu, gemakkelijk te tellen de raderdiertjes.
      OPMERKING: Ethanol, verdunde bleekwater of azijn kan worden gebruikt in plaats van Lugols. Azijn (2 druppels / 10 ml) biedt de voordelen van niet-gevaarlijk, sterkte niet verliezen bij opslag bleekmiddel en jodium oplossingen en niet optimaal raderdiertjes contract, zodat de corona van cilia en de "voet" blijven uitgebreid en dieren er natuurlijker uitzien.
   5. Zorg ervoor dat het monster goed gemengd (geïmmobiliseerd raderdiertjes zal snel te regelen), dan snel een ~ 2 ml subgroep in een plastic pipet en afzien 1 ml in een Sedgewick-Rafter tellen slide (20 x 50 1-mm vierkantjes) (figuur 2 ). Met behulp van een dissectie of samengestelde microscoop, de telling van de intacte raderdiertjes en de total aantal eieren verbonden aan deze raderdiertjes (figuur 2). Tellen als een groot deel van de dia gebied als nodig is om ~ tellen 100 raderdiertjes. Bereken het aantal raderdiertjes per ml en noteer deze in een spreadsheet of logboek.
   6. Oogst ~ 30% van het volume van de raderdiertjes in het CV: Verwijder de luchttoevoer en floss filter, langzaam de klep aan de onderzijde van de CV en laat het water stromen in een plankton collector met een 53 urn mesh zeef. Verzamel het water dat uit de onderkant van de collector na verfijning in een emmer of afvoer. Gebruik een milde tot matige stroom om te voorkomen dat schade aan de raderdiertjes. Sta niet toe dat de raderdiertjes te drogen op het scherm.
   7. Om redenen van consistentie, is het raadzaam om de FCV vast te stellen met een standaard aantal raderdiertjes elke dag. Daarom, gebaseerd op de bekende CV rotifer dichtheid en oogsten volume stelt het totale volume FCV een consistente uiteindelijke dichtheid te bereiken (bijv., 1500 raderdiertjes / ml). Voeg de geoogste rotifers aan de FCV: voorzichtig overdracht van de raderdiertjes uit de collectie scherm met behulp van een wassen fles gevuld met schoon zout water (10 - 15 g / l). Omkeren het scherm over de FCV en was de raderdiertjes in de FCV met een zachte stroom van zout water. Start de PMT om voer te leveren (~ 1,57 ml per miljoen raderdiertjes per dag) naar de FCV.
   8. Schrob de gehele binnenkant van de CV met een schone, zachte nylon borstel of scrub pad.
   9. Nieuwe combinatie van 15 g / l water door toevoeging van de juiste hoeveelheid zout tot een afgemeten hoeveelheid schone RO water in een 5 gallon emmer ter vervanging van de hoeveelheid water verloren te oogsten. Voeg het zout aan het water in de emmer en roer krachtig tot het volledig is opgelost, en vervolgens toe te voegen aan de CV.
   10. Met behulp van een hoge-druk-spray in een wastafel, spoel de floss filter totdat het vrij is van vuil, en dan terug naar het CV.
   11. Pas toevoersnelheden van algen door het veranderen van de duur van elke dosering evenement om CV afgeleverd volgens de dagelijkse telling van raderdiertjes / ml.Gebruik de berekeningen die in stap 1.3.8, hierboven om de juiste hoeveelheid voeder te leveren bepalen.
   12. Ongeveer 24 uur later, herhaal het proces. Begin met het oogsten van de raderdiertjes nog in de FCV (die niet noodzakelijk zijn voor de vorige dag) op dezelfde wijze als hierboven beschreven (stap 1.4.2 - 1.4.10). Concentreren ze in 2 liter vers, schoon gedechloreerd water (5 g / l zout). Deze kunnen bij 4 ° C worden bewaard als backup supply of gebruikt voor latere stadia van visvoer, dan wordt beschreven in dit protocol.
       NB: Dit protocol maakt tot 2-3 dagen minder onderhoud cultuur (met een normale automatische voeding), omdat de raderdiertjes in het CV weglaten van oogsten kunnen verdragen zonder ernstige gevolgen.

2. polycultuur

1. Opstelling
   1. Verzamelen zebravis embryo's uit een paai evenement door het gieten was aanleiding tot embryo's door middel van een thee-zeef en vervolgens voorzichtig spoelen met steriele fish water (of een andere niet-verontreinigde bron van de juiste geconditioneerde oplossing, bijvoorbeeld, embryo medium, E3, enz.) uit een wassen fles in petrischaaltjes.
   2. Incubeer de embryo's bij 25 - 28 ° C in petrischalen met een dichtheid van 40 - 50 embryo's per plaat gedurende 5 dagen.
   3. Begin de polycultuur fase op dag 5 na de bevruchting, of wanneer meer dan 90% van de uitgekomen larven zijn actief zwemmen in de waterkolom.
2. Inenting
   1. Voeg 500 ml rotifer cultuur rechtstreeks van de FCV een 3,5 L kwekerij tank; opneming van rotifer cultuur water biedt algenvoeding dat de voedingswaarde van de raderdiertjes tijdens polycultuur onderhoudt.
   2. Giet de larven van de ene petrischaal in de kwekerij tank. Zorg dat er geen larven blijven in de schotel.
   3. Voeg 500 ml van schone, geconditioneerde vis water uit een recirculatiesysteem of dedicated waterbron naar de tank tot een eindvolume van 1 L en een uiteindelijke s bereiktalinity van 5 g / l.
      LET OP: Deze zoutgehalte is van cruciaal belang, omdat de zebravis larven overleven zal negatief worden beïnvloed als zoutgehalte> 7 g / L en raderdiertje overleven zal negatief worden beïnvloed als het zoutgehalte <2 g / l.
3. Polycultuur fase
   LET OP: De polyculture fase moet duren tot 4 dagen na de inenting (een totaal van 5 dagen, wat overeenkomt met 5-9 dagen na de bevruchting).
   1. Let op de polycultuur tank ten minste eenmaal per dag gedurende deze periode om ervoor te zorgen dat raderdiertjes en vis aanwezig en groeiende zijn. Zorg ervoor dat de raderdiertjes zijn de hele waterkolom zichtbaar. Zorg ervoor dat de de fishs zijn ook zichtbaar in de waterkolom, zwemmen onder de raderdiertjes.
   2. Het normale waterstroom door de tank. Plaats een scherm of baffle via afvoeropening opdat larven niet gespoeld uit de tank.
      Opmerking: Aan het einde van deze fase, de vissen groot genoeg om grotere prooien zoals Artemia consumerennauplii of verwerkt feed items in de orde van grootte van 75-125 urn.
      Opmerking: De dynamiek raderdiertje populatie binnen een representatieve polycultuur tank werden gemeten door bemonstering / tellen raderdiertjes uit de tank op dezelfde wijze als beschreven in stappen 1.4.2 - 1.4.5. Dit werd eenmaal per dag uitgevoerd vanaf het begin van de polyculture fase totdat het voltooid was.

Resultaten

De continue rotifer kweeksysteem beschreven is dynamisch en het is normaal dat rotifer aantallen fluctueren geringe mate in de tijd wanneer er variaties in de dagelijkse voeding en exploitatiehoeveelheden. De bevolking van de raderdiertjes in een van de actieve culturen in de aquacultuur faciliteiten Boston Children's Hospital, gehandhaafd op de hierboven beschreven werd gedurende 30 dagen (figuur 3). De gemiddelde kweekdichtheid deze periode was 932 raderdiertjes / ...

Discussie

Succesvolle implementatie van de rotifer polyculture methode voor het voeden van de vroege larvale zebravis vereist een effectieve protocollen voor twee taken: het opzetten en onderhouden van een continu rotifer kweeksysteem te voeden de vis, en het kweken van de eerste voeden zebravis larven samen met raderdiertjes in dezelfde tank.

De opstelling voor continue zoutwater rotifer productiesysteem voor zebravis laboratoria eerst beschreven door Lawrence en co-auteurs ¹⁴ is gewijzigd...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Rotifer Cultuur Infrastructuur
100 L Cultuurvat	Aquaneering	Aangepast	Polycarbonaat cultuurvat, kegelvormige bodem, met afvoerklep
5 Gallon Cultuuremmer Kit	Reed Mariculture	CCS Starter Kit	Klein volume cultuurvat voor kleine faciliteiten
Stijve Heldere Buizen 1/2" O.D., 36”	Pentair Aquatic Ecosystems	16025	Stijve heldere buizen voor luchttoevoer
Gaasbuis	Pentair Aquatic Ecosystems	RT444X	Gaasbuisondersteuning voor flossfilter
Rotifer Floss	Reed Mariculture	Rotifer floss 12” x 42”	Partikelafvalval
Peristaltiek Doseringstimerpomp, 5 GPD	Grainger	38M003	Doseringspomp met timer voor het doseren van voer aan rotifers
Peristaltiek Doseringstimerpomp, 1-100 mL/hr (voor kleinere schaal cultuur)	Coral Vue	SKU: IC-LQD-DSR	Doseringspomp met timer voor het doseren van voer aan rotifers
Siliconen Buizen	Cole Parmer		Buizen voor algentoevoer naar rotifervat
Stijve Heldere Buizen " O.D.,36”	Pentair Aquatic Ecosystems	16025	Stijve heldere buizen voor luchttoevoer naar algenpasta
Stijve Heldere Buizen O.D., 36”	Pentair Aquatic Ecosystems	16025	Stijve heldere buizen voor algentoevoer
Rotifers
Levende Rotifers Brachionus plicatilis Type L	Reed Mariculture	Type L 5 miljoen	Rotifer stockcultuur voor systeemstart
Rotifervoer
Natriumhydroxymethylsulfonaat	Reed Mariculture	ClorAm-X® 1lb buis	Ammoniakreducer voor algenvoermix
Natriumbicarbonaat	Fisher Scientific	S25533B	pH-buffer voor algenvoermix
Microalgenconcentraat	Reed Mariculture	Rotigrow Plus® 1 liter zak	Nutritioneel geoptimaliseerd rotifervoer
RG Complete	Reed Mariculture	RG Complete 6 oz fles	Alles-in-één microalgen gebaseerd voer voor kleine schaal culturen
Watervoorbereiding
Reef Crystals Reef Salt	That Fish Place	198210	Zout voor het maken van cultuurwater (OPMERKING: dit item is slechts een voorbeeld; elke contaminantvrije zoutformuleringen kunnen worden gebruikt).
Refractometer	Pentair Aquatic Ecosystems	SR6	meten van zoutgehalte
Rotifer Cultuurapparatuur
Planktoncollectoren 12" Dia, 53 microns	Pentair Aquatic Ecosystems	BBPC20	Gaasscherm voor het verzamelen van rotifers
Schuurpads	Pentair Aquatic Ecosystems	SCR-58	Schuurpad voor het schoonmaken van de binnenkant van cultuurvaten
Schuurborstel
Emmer	Grainger Supply	43Y530	Gegradueerde emmer voor het mengen van cultuurwater
Uitbroedpot	Pentair Aquatic Ecosystems	J30	Opslag van algenvoermix
Lugol’s Oplossing, Verdund	Fisher Scientific	S99481	Agent gebruikt om levende rotifers te immobiliseren voor het tellen
Sedgewick-Rafter plankton telplaat met raster	Pentair Aquatic Eco-Systems	M415	Tellen van rotifers
Diverse
Theezeef	Kitchenworks	971972	Gebruikt voor het verzamelen van zebravisembryo's na het spawnen