De Algemene Vergadering en de toepassing van 'Shear Rings': A Novel endotheliale Model voor Orbital, Unidirectionele en Periodieke Fluid Flow en Shear Stress

Samenvatting

Verschillende niveaus en patronen van vloeistofschuifspanning zijn bekend om hun modulatie van endothèle genexpressie, fenotype en gevoeligheid voor ziekten. We bespreken de samenstelling en het gebruik van'schuifringen': een model dat unidirectionele, periodieke schuurspanningspatronen produceert. Schuifringen zijn eenvoudig te assembleren, economisch en kunnen hoge celopbrengsten produceren.

Samenvatting

Afwijkingen van normale niveaus en patronen van vasculaire vloeistof shear spelen een belangrijke rol in vasculaire fysiologie en pathofysiologie door inductie adaptieve en pathologische veranderingen in endotheliale fenotype en genexpressie. In het bijzonder kan maladaptive effecten van periodieke unidirectionele stroming veroorzaakte afschuifspanning diverse effecten op vasculaire verschillende celtypes, met name endotheelcellen activeren. Hoewel inmiddels endotheelcellen van verschillende anatomische afkomst zijn gekweekt, diepgaande analyses van hun antwoorden op vloeistof shear werden gehinderd door de relatieve complexiteit van de shear modellen (bijvoorbeeld parallelle plaat stroom kamer, kegel en plaat flow model). Hoewel deze allemaal uitstekend benaderingen vertegenwoordigen dergelijke modellen technisch ingewikkeld en lijden aan nadelen waaronder relatief lange en ingewikkelde insteltijd, geringe oppervlak eisen voor pompen en druk brengen waarvoor vaak afdichtingsmiddelen en pakkingen, waardoor uitdagingen both steriliteit te handhaven en een onvermogen om meerdere experimenten uitgevoerd. Wanneer hogere doorvoersnelheid modellen van stroming en afschuiving beschikbaar, meer vooruitgang op vasculaire endotheliale shear reacties waren bijzonder periodieke afschuiving onderzoek op moleculair niveau, kan sneller gevorderd zijn. Hier beschrijven we de bouw en het gebruik van de shear ringen: een nieuwe, eenvoudig te monteren, en goedkope weefselkweek model met een relatief groot oppervlak dat gemakkelijk zorgt voor een hoog aantal experimentele herhalingen in één richting, periodieke shear stress studies over endotheel cellen.

Inleiding

Vloeistof shear stress is aangetoond dat endotheelcellen gen moduleren's ^1-5 door activatie van cis-regulerende elementen ^6, histone acetyltransferase-activiteit ⁷ en schuifspanning respons elementen (SSRE) ^8. Afschuifspanning invloeden endotheliale bijdragen voor coagulatie door het moduleren weefselfactor ⁹ en weefselplasminogeenactivator (tPA) ¹⁰ expressie. Shear stress beïnvloedt ook de controle van angiogenese ¹¹ en vat remodeling door het reguleren van PDGF-B-synthese en het reactievermogen ^8. Het endotheel afgeleide vasoactieve mediatoren adrenomedullin, endotheline-1, urotensine II en relaxin worden ook geregeld door afschuiving ^12. Transcriptie van endotheel stikstofoxide synthase productie en de productie van stikstofoxide zijn beide shear afhankelijk ^10. Shear controleert ook endotheliale ICAM-1-expressie ^13. Stromingsgeïnduceerde shear stress kan dus powerfully kracht een grote verscheidenheid aan endotheliale responsen. Belangrijker vasculaire pulsaties nu ook blijken belangrijke rol spelen in de pathofysiologie van zowel normale vasculaire veroudering en vormen van vasculaire dementie ¹⁴ en kan zelfs bijdragen aan andere neurodegeneratieve ziekten, zoals multiple sclerose ^15.

Veneuze en arteriële endotheelcellen inherent blootgesteld aan diverse hemodynamische stromingspatronen in vivo, en veel verschillende endotheelcellen fenotypes kunnen worden tentoongesteld ^16. Afhankelijk van de grootte en frequentie van stroming, kan effecten op endotheliale cellen omvatten ontstekingscellen activering en apoptose, die veranderingen in gen of eiwitexpressie ^17,18 kunnen weerspiegelen. Studies op endotheliale celreacties op verschijnselen blijft derhalve gecompliceerd door de moeilijkheden afschuiven vervaardiging van in vitro modellen die adequaat produceren dergelijke afschuiving patronen.

Veel verschillende experimental protocollen ontwikkeld om vloeistof schuifspanning toepassing op endotheliale celmonolagen. Een van de meest gebruikte systemen is de parallelle plaat stroming kamer, die gelijkmatige laminaire stroming binnen de kamer ¹⁹ creëert ^{- 21.} Een peristaltische pomp is typisch verbonden met periodieke stroom, die stromingseigenschappen kenmerkend voor vele locaties in vivo ²² kan herhalen maken. Een andere gemeenschappelijke opstelling gebruikt het 'kegel en plaat-model, waarbij fluïdum afschuifspanning wordt bepaald door de rotatiesnelheid van de conus ^23. Beide systemen, en andere soortgelijke regelingen hen kan vervelend zijn voor het opzetten en vereisen componenten die relatief duur en ontoegankelijk voor veel laboratoria kunnen worden.

Een andere belangrijke beperking van deze huidige modellen is het relatief lage aantal gelijke studies die gelijktijdig kunnen worden uitgevoerd, elk met een relatief klein oppervlak. Dit verhoogt de tijd en co mplexity van deze aanpak. Daarom zou een ideaal model unidirectionele en periodieke shear induceert een waar een groot aantal studie duplo eenvoudig worden ingesteld, elk met een relatief groot oppervlak. Bovendien, de eerder genoemde modellen vereisen een vrij geavanceerde setup, die kosten prohibitief kan zijn voor veel gebruikers. Een model dat shear verstoringen vloeistof kan produceren met behulp van elementaire laboratorium materialen kan enkele voordelen hebben.

Een eenvoudige en zeer voordelige wijze van aanbrengen unidirectionele periodieke afschuifspanning omvat het plaatsen van cirkelvormige schotels op een rondschudapparaat ^24. Dit protocol is zeer eenvoudig en kan worden opgeschaald naar grote aantallen studie gerepliceerd, elk met een betrekkelijk groot oppervlak te bereiken, indien nodig. Cellen in het midden van de schaal worden blootgesteld aan verschillende stromingspatronen dan cellen langs de omtrek, waarbij gemengde cellulaire fenotypische responsen in dezelfde schotel.

_content "> In dit huidige rapport beschrijven we de bouw en het gebruik van 'shear ringen', ons model voor het creëren van één richting en periodieke shear stress. Het ontwerp voor de shear ring effectief 'mixed' cellulaire afschuiving geïnduceerde fenotypes grenzen door de stroming te beperken route in een cirkelvormige kweekschaal aan de omtrek door de plaatsing van een binnenring. de constructie en werking van de afschuifring eenvoudig en goedkoop en kan eenvoudig worden aangepast aan een breed scala van orbitale shakers geschikt gebruik van algemeen beschikbare weefselkweek voorraden. Deze model kan in endotheelcellen experimenten worden toegepast op één richting en periodieke stromingspatronen te bieden binnen de fysiologische en pathofysiologische niveaus.

Protocol

1. Constructie van 150 mm Diameter Shear ringen (figuur 1)

OPMERKING: Shear ringen kunnen worden geconstrueerd om verschillende dimensies te creëren door het variëren van de buitenste en binnenste petrischaal maten, waardoor inrichtingen met verschillende totale oppervlak, mobiele opbrengsten en ontwikkelde gebieden van afschuifkrachten. Dit rapport beschrijft een 150 mm schaal gecombineerd met een inwendige 100 mm schotel voor een totale oppervlakte van 98 cm ² (figuur 2).

Figuur 1. Shear assemblage. Het bovenste gedeelte van de figuur toont een gedeeltelijk geassembleerd afschuifring. Injecteer 0,5 ml methyleenchloride door het 3 mm gat met een transferpipet indien een goede afdichting niet volledig gevormd tussen de binnenste en buitenste gerechten. De shear ring wordt dichtgesmeerd met het aanbrengen van een 1 mm dikke streep van siliconenrubber lijm rond de binnenste EDGe van de shear ring top. Het onderste gedeelte van de figuur toont de geassembleerde shear ring. Het blauw vertegenwoordigt het gebied van vergulde endotheelcellen. De buitenste en binnenste rode pijlen geven de baanbeweging van de shear ring en media in de shear ring wanneer geplaatst op een rondschudapparaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Surface metingen voor een 150 mm shear ring (niet op schaal getekend). Top paneel toont centrifugale verschuiving van de vloeistof in de richting van de buitenste ring in reactie op de orbitale rotatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Maak een shear ring constructie template door het genereren van een150 mm breedte profiel presentatiesoftware met een 100 mm inwendige diameter in het midden van de cirkel 150 mm. Print het sjabloon op een vel A4 wit papier.
2. Pipetteer 10 ml van methyleenchloride (dichloormethaan) in een 150 mm glazen petrischaal. Het is essentieel dat de schotel glas en niet polystyreen (of andere vinyl plastic), dichloormethaan oplost meeste kunststoffen en wordt hier gebruikt om plastic componenten treden.
   LET OP: Gebruik handschoenen voor alle constructie met voldoende ventilatie kap. Methyleenchloride is een contact irriterend is hepatotoxische.
3. Lijn 150 mm plastic petrischaal op de buitenste ring shear template.
4. Boor een 3 mm gat in het midden van een 100 mm schaal met behulp van een draaiend gereedschap. Verwijder alle plastic spaanders geproduceerd uit het boren.
5. Terwijl met een gehandschoende hand, omkeren en dompel de bovenrand van de 100 mm petrischaal uit de vorige stap in het zwembad van dichloormethaan gedurende ongeveer 3 sec.
6. Transfer de "natte" 100 mm schaal edge-neer op het midden van een 150 mm schaal, zorgvuldig afstemmen van de 100 mm schaal op de gemarkeerde template. Het dichloormethaan wordt het plastic smelten, de toetreding tot de 100 mm en 150 mm gerechten. Voorzichtig zwenken de 100 mm schaal klok mee en tegen een paar keer om goede hechting aan de 150 mm schaal te waarborgen.
   OPMERKING: Let goed om een ​​goede uitlijning van de binnenste schaal naar het midden van de buitenste schaal te waarborgen. Excentrische uitlijning kan resulteren in variaties van de schuifspanning op verschillende locaties in de afschuifring. Zorg ervoor dat niet toe methyleenchloride per ongeluk druppelen het buitenste spoorgedeelte van de 150 mm petrischaal gedurende de plaatsing van de 100 mm schaal. Dit zal de kunststof aan de onderkant waar de cellen zal groeien smelt een res- oppervlak stroming stoornissen kunnen veroorzaken.
7. Nadat de methyleenchloride droog is, draait u de onlangs gehouden petrischaaltjes over en zorgvuldig te inspecteren de contactpunten om ervoor te zorgen dateen goede afdichting is gevormd tussen de twee petrischalen.
8. Als een goede afdichting niet volledig is gevormd, injecteer 0,5 ml methyleenchloride door het 3 mm gat met een transferpipet. Pak de schotel en voorzichtig draaien om het methyleenchloride naar de rand bereikt.
   LET OP: Als er te snel gedraaid, kan het dichloormethaan vloeistof in het buitenste gedeelte van de 150 mm schaal, vervormen het oppervlak waar de cellen zal groeien en verpest de shear ring. Lekkende shear ringen moet worden weggegooid.
9. Dicht de opening in de 100 mm schaal door een 3 mm brede streep siliconenrubber kit.
10. Met behulp van een draaiend gereedschap uitgerust met een flatscreen snijkop, afgesneden van de cm deel van een 15 ml conische polystyreen weefselkweek tube top 3, waarbij ten minste 1 cm van de buis onder de dop. Pools de rand van de snede buis tot een glad en plat met de platte kant van de snijkop. Verwijder alle plastic spaanders geproduceerd door slijpen.
11. Trace de cut-off 15 ml conische buis op dedeksel van de 150 mm schotel met een marker, ongeveer 0,5 cm van de rand van de schaal. Boor een gat in de getekende cirkel, waardoor een marge van ongeveer 1-2 mm vanaf de rand van de cirkel.
12. Leg de afgesneden conische buis top over het geboorde gat. Met behulp van een overdracht pipet, breng ongeveer 250 pl methyleenchloride werd aan de afgesneden randen van de conische buis naar de conische buis het deksel 150 mm binden.
13. Dicht de 150 mm deksel op de 150 mm schaal door een 1 mm dikke streep siliconenrubber kit rond de binnenrand van de bovenste petrischaal.

2. Sterilisatie van Shear Rings

1. Pipet ongeveer 10 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing in het nieuw gevormde afschuifring door de 15 ml conische buis poort. Wervelen rond om alle vuil in de shear ring te verwijderen. Verwijder de fosfaat gebufferde zoutoplossing met een Pasteur pipet / vacuum aspirator.
2. Herhaal de vorige stap totdat vuil wordt verwijderd.
3. om Sterilize de afschuifring, een combinatie van een 70% ethanol spoelen met UV bestraling.
   1. Draai de ontluchtingsdop, pipet ongeveer 10 ml van 70% ethanol door de toegang tot de haven, en schroef de dop er weer op. Draaien en kantelen via afschuifring meerdere keren, zodat de binnenzijde van de afschuifring grondig gewassen.
   2. Onder een zuurkast, zuig het overtollige 70% ethanol. Met een spuitfles, grondig spuit de dop en de toegang tot de haven met 70% ethanol.
   3. Plaats de shear ring en dop onder UV-straling binnen de weefselkweek kap tot het volledig droog.
4. Eenmaal droog, schroef de dop er weer op en slaan gesteriliseerd shear ringen bij kamertemperatuur tot gebruik in celcultuur plating.

3. Shear Stress Studies

1. Plate endotheelcellen in gesteriliseerde shear ringen na de standaard celkweek protocol meestal met behulp van een 1: 4 splitsingsverhouding voor getransformeerde endotheliale cellijnen.
   LET OP: Rat netvlies microvascular endotheelcellen werden commercieel verkregen. Menselijke hersenen endotheelcellen (hCMEC / D3) cellen werden verstrekt als een gulle gift van Dr. Pierre-Oliver Couraud (Inserm, Frankrijk) en werden gekweekt in compleet endotheliale basaal medium (EBM).
2. Laat culturen samenvloeiing bereiken voorafgaand aan de start van stroom studies. Gebruik 30 ml weefselkweek medium (10% foetaal kalfsserum, Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium met 1% penicilline / streptomycine / amfotericine). Veranderen celcultuurmedium om de 3 dagen en handhaven cellen bij 37 ° C met _7,5% CO2 en 92,5% kamerlucht.
3. Plaats de orbitale schudder in de incubator.
   Opmerking: Orbital shakers zijn meestal zwaar (> 10 kg). Plaats de rondschudapparaat op de onderste plank van de incubator om plank stress en trillingen te minimaliseren.
4. Plaats de experimentele shear ringen op de orbitale schudinrichting. Plaats statische controle groep shear ringen in hetzelfde incubator.
5. Schat de maximale schuifspanning in de shoor ring met de vergelijking waar de straal van de rotatie van de rondschudapparaat (in cm), is de viscositeit van het medium (in poise), de dichtheid van het medium (in g / ml), en is de rotatiefrequentie (in rotatie / sec) ^24.
6. Start de rotatie-instelling op de orbitale schudinrichting het gewenste toerental (bijvoorbeeld 90 min), waarbij de afschuiving ringen op de schudder gedurende de gewenste duur van afschuifspanning applicatie (bijvoorbeeld 72 uur).
   LET OP: Orbital shakers kan warmte produceren, zodat de incubator temperatuur in eerste instantie moeten worden gecontroleerd om ervoor te zorgen 37 ° C wordt gedurende de looptijd van het experiment gehandhaafd. Als alternatief, shoren ringen kunnen worden overgebracht in klimaatkamers (bijvoorbeeld modulair incubator kamer) en vervolgens geplaatst in een roterende incubator.
7. Na cellagen werden blootgesteld aan afschuiving voor de gewenste tijdsduur verwijderen shear ringen uit de incubator. Trek de afschuifring deksel en ophalen cellen en / of dragers van de behandeling gewenst eindpunt analyses (bijvoorbeeld Western blotting, fluorescentie-geactiveerde celsortering, enz.) ^25.

Resultaten

Hier presenteren we representatieve resultaten van zowel hCMEC / D3 hersenen endotheelcellen en rat retinale microvasculaire endotheliale celmonolagen, gekweekt in shear ringen.

Nadat men hCMEC / D3 hersenen endotheliale celmonolagen te groeien tot confluentie in volledige EBM werden de afschuiving ringen op een schudapparaat geplaatst gedurende 72 uur. Met de vergelijking van stap 3,5, de berekende maximale schuifspanning

Discussie

De constructie van de afschuiving ringsysteem voor het belichten endotheelcellen afschuiving is een eenvoudige benadering van het uitvoeren afschuifspanning studies. Toch zijn er enkele stappen die essentieel zijn voor het verkrijgen van superieure afschuiving ringen en betere resultaten. Een volledige afdichting moet worden gemaakt tussen de binnenste en buitenste ring om de media te voorkomen dat lekken die in strijd zijn shear stress onder samples zou kunnen leiden. Als een volledige afdichting uitblijft, slechts een...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
100 x 20 mm kunststof weefselkweekschaal	Corning	430167	De schalen moeten van polystyreen zijn
150 x 25 mm kunststof weefselkweekschaal	Corning	430599	De schalen moeten van polystyreen zijn
150 mm glazen Petri-schaal	Fisher	3160150BO
15 ml polystyreen weefselkweek kunststof buizen	Falcon	352099
Methyleenchloride	Sigma-Aldrich	D65100
siliconenrubber afdichtingsmiddel	DAP	7079808641
ethanol	Decon	2701
3 ml overdrachtpipet	Becton-Dickinson	357524
printerpapier
schaar
handschoenen
roterend gereedschap en set	Dremel	4000-6/50
roterend gereedschap snijkop	Dremel	EZ476
roterend gereedschap boorkop
gedestilleerd water
orbitale shaker	VWR	57018-754
incubator
Ratten retinale microvasculaire endotheelcellen	Cell Biologics	RA-6065