Methodenartikel

Beoordeling van neuronale levensvatbaarheid met behulp van Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Dubbele Verf In Cerebellaire Granule Neuron Cultuur

11.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55442

⸱

10 mei 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Ningbo Key Laboratory of Behavioral Neuroscience, Zhejiang Provincial Key Laboratory of Pathophysiology, School of Medicine, Ningbo University, 2Department of Applied Biology and Chemistry Technology, Institute of Modern Chinese Medicine, The Hong Kong Polytechnic University, 3Institute of New Drug Research, Guangdong Provincial Key Laboratory of Pharmacodynamic, Constituents of Traditional Chinese Medicine & New Drug Research, College of Pharmacy, Jinan University, 4International Joint Laboratory (SYSU-PolyU HK) of Novel Anti-Dementia Drugs of Guangdong

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft hoe om neuronale levensvatbaarheid nauwkeurig te meten met behulp van Fluorescein Diacetate (FDA) en Propidium Iodide (PI) dubbele kleuring in gekweekte cerebellar granule neuronen, een primaire neuronale cultuur die gebruikt wordt als een in vitro model in neurowetenschappen en neurofarmacologie onderzoek.

Samenvatting

Primaire gekweekte Cerebellar Granule Neuronen (CGN's) zijn veel gebruikt als een in vitro model in neuroscience en neuropharmacology onderzoek. Het co-bestaan ​​van gliale cellen en neuronen in CGN-cultuur kan echter leiden tot vooroordelen bij de nauwkeurige beoordeling van neuronale levensvatbaarheid. Fluoresceendiacetaat (FDA) en Propidiumjodide (PI) dubbele kleuring is gebruikt om de levensvatbaarheid van cellen te meten door de levensvatbare en dode cellen tegelijkertijd te evalueren. We hebben FDA-PI dubbele kleuring gebruikt om de gevoeligheden van de colorimetrische analyses te verbeteren en neuronale levensvatbaarheid in CGN's te evalueren. Verder voegde we blauwe fluorescerende DNA vlekken toe (bijvoorbeeld Hoechst) om de nauwkeurigheid te verbeteren. Dit protocol beschrijft hoe de nauwkeurigheid van de beoordeling van neuronale levensvatbaarheid kan verbeteren door gebruik te maken van deze methoden in de CGN-cultuur. Met behulp van dit protocol kan het aantal gliale cellen uitgesloten worden met behulp van fluorescentiemicroscopie. Een soortgelijke strategie kan worden toegepast om de ongewenste gli te onderscheidenAlcellen van neuronen in verschillende gemengde celculturen, zoals primaire corticale cultuur en hippocampale cultuur.

Inleiding

Colorimetrische cytotoxiciteitsbepalingen, zoals de 3- (4, 5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-difenyl-2-H-tetrazoliumbromide (MTT) -assay, worden gewoonlijk gebruikt om de levensvatbaarheid van cellen in vitro te meten. Primaire gekweekte Cerebellar Granule Neuronen (CGN's) van ratten zijn gevoelig voor verschillende neurotoxinen, waaronder 1-methyl-4-fenylpyridinium-ion, waterstofperoxide en glutamaat 1 , 2 . Daarom kunnen CGN culturen gebruikt worden als een in vitro model op het gebied van neurowetenschappen. CGN-culturen kunnen een verscheidenheid aan cellen bevatten, waaronder neuronen en gliale cellen, die ongeveer 1% van de totale cellen in de CGN-cultuur kunnen uitmaken. Glialcellen reageren echter verschillend op neurotoxinen in vergelijking met neuronen, wat leidt tot een vooroordeel in de neuronale levensvatbaarheid gemeten door colorimetrische analyses 3 .

In levensvatbare cellen kan fluoresceendiacetaat (FDA) omgezet worden in fluoresceïne door esterase.Propidiumjodide (PI) kan interageren met het DNA na het binnendringen van dode cellen en kan gebruikt worden om apoptose binnen de cultuur aan te geven. Daarom kan FDA-PI dubbele kleuring tegelijkertijd levensvatbare cellen en dode cellen evalueren, wat suggereert dat de cellevendigheid nauwkeuriger kan worden gemeten door beide colorimetrische methoden te combineren. Bovendien, door Hoechst toe te voegen, een blauwe fluorescerende vlek voor kernen, zou de nauwkeurigheid van de cellevendigheid verder kunnen worden verbeterd. Het hier beschreven protocol beschrijft FDA-PI dubbele kleuring en FDA-PI-Hoechst triple staining, die gebruikt kan worden om de neuronale levensvatbaarheid nauwkeurig te analyseren in primaire gekweekte CGN's.

Dit protocol profiteert van het visualiseren en onderscheiden van CGNs en glialcellen door hun verschillende maten en vormen. Na kleuring worden de aantallen levensvatbare neuronen en dode neuronen geteld uit representatieve beelden die worden genomen door fluorescerende microscopie. De grote gliale cellen worden uitgesloten door de vergelijking van typische CGNs tAken onder fluorescerende modus met die welke onder fase contrast modus zijn genomen. Een soortgelijke strategie kan worden uitgevoerd om neuronale levensvatbaarheid in gemengde celculturen te meten die neuronen en gliale cellen bevatten, zoals primaire corticale culturen en hippocampale culturen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures volgden de National Institutes of Health (NIH) Gids voor de zorg en het gebruik van laboratoriumdieren (NIH Publicaties nr. 80-23, herzien 1996) en werden goedgekeurd door het Institutionele Diervoeder- en Gebruikskomitee (IACUC) aan de universiteit van Ningbo ( SYXK-2008-0110).

1. Bereiding van oplossingen en cultuurmedia

Opmerking: Reagenten en voorraden moeten onder steriele omstandigheden worden bereid. Steriliseer door te filteren met behulp van een filter met een poriegrootte van 0,22 μm.

  1. Bereid Poly-L-Lysine (PLL) voorraadoplossing door 5 mg PLL toe te voegen aan 10 ml dubbel gedestilleerd water (ddH 2 O). Steriliseren door te filteren. Aliquot en sla de PLL voorraadoplossing bij -20 ° C gedurende enkele maanden op.
  2. Bereid Krebs-buffer door 7,25 g NaCl, 0,4 g KCl, 0,14 g NaH2P04, 2,6 g D-glucose en 5,94 g 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur toe te voegen aan 100 ml DdH 2 </ Sub> O. Steriliseren door te filteren. Bewaar de Krebs-bufferoplossing bij maximaal een maand bij 4 ° C.
  3. Bereid 3.82% Mg 2 SO 4 oplossing door 3,82 g Mg 2 SO 4 aan 100 ml ddH 2 O toe te voegen. Steriliseren door te filtreren. Bewaar de Mg 2 SO 4 oplossing bij 4 ° C gedurende enkele maanden.
  4. Bereid 1,2% CaCl2 oplossing op door 1,2 g CaCl2 toe te voegen aan 100 ml ddH20. Steriliseer door te filtreren. Bewaar de CaCl2 oplossing bij 4 ° C gedurende meerdere maanden.
  5. Bereid 2M KCl-oplossing door 15 g KCl toe te voegen aan 100 ml ddH 2 O. Steriliseer door te filtreren. Bewaar de KCl-oplossing gedurende 4 maanden bij 4 ° C.
  6. Bereid de D-glucose voorraadoplossing door 1,8 g D-glucose toe te voegen tot 100 ml ddH 2 O. Steriliseer door te filtreren. Aliquot en sla de D-glucose oplossing op bij 4 ° C gedurende maximaal een maand.
  7. Bereid Cytosine β-D-Arabinofuranoside (Ara-C) voorraadoplossingIon door 0,24 g Ara-C toe te voegen aan 10 ml ddH20. Steriliseren door te filtreren. Aliquot en sla de Ara-C voorraadoplossing bij 4 ° C gedurende enkele maanden op.
  8. Bereid 250 ml kweekmedium (voor 25-30 pups) met 25 ml Fetal Bovine Serum (FBS), 2,5 ml 100x glutamine, 2,78 ml 2M KCl oplossing en 2,5 ml 100x antibiotica in Basal Medium Eagle (BME) . Stel het volume in op 250 ml en steriliseer door te filtreren.
  9. Bereid 25K medium op met 2,5 ml 100x glutamine, 2,78 ml 2M KCl oplossing en 2,5 ml 100x antibiotica in BME. Stel het volume in op 250 ml en steriliseer door te filtreren.
  10. Bereid 5K medium op met 2,5 ml 100x glutamine en 2,5 ml 100X antibiotica in BME. Stel het volume in op 250 ml en steriliseer door te filtreren.
    OPMERKING: Het kweekmedium, 25K medium en 5K medium moet vers bereid worden
  11. Bereid FDA voorraadoplossing door 5 mg FDA toe te voegen aan 1 ml aceton. Bewaar de FDA-voorraadoplossing bij 4 ° C voor langdurige opslag.
  12. Bereid PI-voorraadoplossing door 1 mg PI aan 1 ml ddH 2 O toe te voegen. Bewaar de PI-voorraadoplossing bij 4 ° C gedurende enkele maanden.
  13. Bereid Hoechst voorraadoplossing door 5 mg Hoechst 33342 toe te voegen aan 1 ml ddH 2 O. Bewaar de Hoechst voorraadoplossing bij 4 ° C gedurende enkele maanden.

2. Bereiding van Dissectie Oplossingen

OPMERKING: Doe dit 1 d voor de dissectie.

  1. Bereid de dissectieoplossing door 15 ml Krebs-buffer, 1,2 ml 3,82% Mg2SO4-oplossing en 0,45 g Bovine Serumalbumine (BSA) toe te voegen aan 150 ml ddH20. Pas de pH aan op 7,4 met behulp van NaOH.
  2. Label 5 x 50 ml buizen als volgt: 1, 2, 3, 4 en 5.
  3. Plaats 40 ml dissectieoplossing in een 50 ml spuit met een filter. Filter 30 ml dissectieoplossing in buis 1 en 2 ml elk tot meerdere 35 mm celcultuurschotels, die gebruikt worden om weefsels te verwerken.
  4. Naar tUbe 2, voeg 12,5 mg trypsine in 50 ml dissectieoplossing toe. Meng volledig door vortexing. Steriliseren door te filteren.
  5. Aan buis 3, voeg 1,2 mg DNAse I, 7,8 mg sojaboon-trypsine-inhibitor en 150 μl van 3,82% Mg2S04-oplossing in 15 ml dissectieoplossing toe. Meng volledig door vortexing. Steriliseren door te filteren.
  6. Voeg bij buis 4 5 ml van de oplossing uit buis 3. Voeg 10,5 ml dissectieoplossing toe. Steriliseren door te filteren.
  7. Aan buis 5, voeg 100 μl van 3,82% Mg2S04-oplossing en 15 μl van 1,2% CaCl2-oplossing in 12,5 ml dissectieoplossing toe. Meng volledig door vortexing. Steriliseren door te filteren.
  8. Bewaar alle buizen bij 4 ° C voor gebruik.

3. Coating van de celcultuurplaten

OPMERKING: Doe dit 1 d voor de dissectie.

  1. Voeg 1 ml PLL voorraadoplossing toe aan 100 ml ddH 2 O (eindconcentratie: 5 μg / ml). Coat plastic6-putjes of 12-putjes celcultuurplaten (2 ml per putje voor 6-putjescelcultuurplaten of 1 ml per putje voor 12-cellencultuurplaten) door 5 μg / ml poly-L-lysineoplossing toe te voegen.
  2. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 dag (of bij 37 ° C gedurende 2 uur). 1-2 uur voor de dissectie, verwijder de oplossing met een pipet. Was eens met ddH20 en droog in de celkweekkap.

4. Verwerking van weefsels voor 8 dagen oude Sprague-Dawley-ratten.

  1. Zet een 100 mm schotel op ijs. Decapiteer de ratpups in het gerecht met een paar gesteriliseerde scharen.
  2. Steek de schaar in de foramen magnum en snijd de twee kanten van de schedel, van de oren naar de ogen. Til de schedel op met een paar tang. Zorg ervoor dat de hele hersenen in de schedel zijn. Isoleer het cerebellum en zet het in de bovenstaande 35 mm schaal met een paar tang.
  3. Werk onder een dissectiemicroscoop. Verwijder de meninges en bloedvaten met twee paar tang.
  4. Knip de weefsels met een mes. Zet de weefsels in buis 1. Centrifuge gedurende 5 minuten bij RT en 1.500 x g.
  5. Aspirateer de supernatant. Bewaar de pellet.
  6. Voeg de oplossing in buis 2 toe aan de pellet. Resuspendeer door zachtjes te schudden.
  7. Plaats de buis in een waterbad van 37 ° C gedurende 15 minuten. Schud elke 3 minuten voorzichtig.
  8. Voeg de oplossing in buis 4 toe aan deze oplossing. Schud en centrifugeer gedurende 5 minuten bij RT en 1500 x g.
  9. Aspirateer de supernatant. Bewaar de pellet.
  10. Voeg de oplossing in buis 3 toe om de pellet te resuspenderen.
  11. Bereid twee 15 ml buizen. Plaats de helft van de cellen in elke buis. Pipet omhoog en omlaag 60-70x met een katoenen plug Pasteur pipette om de cellen te homogeniseren.
  12. Voeg 3 ml van de oplossing in buis 5 toe aan elke 15 ml buis. Laat ze 10 minuten bij kamertemperatuur zitten en verwijder de supernatant zorgvuldig met een Pasteur-pipet met katoen. Plaats de supernatant in nieuwe 15 ml buizen en centrifugeer gedurende 5 minuten bij RT en 1500 x g.
  13. EENSpiraal het supernatant. Bewaar de pellet.
  14. Voeg kweekmedium in de pellet om een ​​celdichtheid van ongeveer 1,5 x 106 cellen / ml (ongeveer 100 ml voor 10 pups) te krijgen.
  15. Zet de cellen in cultuurplaten en kweek ze in de incubator bij 37 ° C en 5% CO2.

5. Toevoeging van Ara-C en D-glucose tijdens de cultuur

  1. Na 24 uur voeg Ara-C voorraadoplossing toe (10 μl / putje voor 12-cellencelcultuurplaten of 20 μl / putje voor 6-cellencelcultuurplaten; eindconcentratie: 1 mM) om de groei van de glialcellen te remmen.
  2. Op dag 7 voeg 50 μL D-glucose voorraadoplossing per put toe voor 12-cellencultuurcultuurplaten of 100 μl per putje voor 6-putjescelcultuurplaten zodat de uiteindelijke concentratie 1 mM is.

6. FDA-PI Double Staining en FDA-PI-Hoechst Triple Staining in CGN Culture

  1. Bereid FDA-PI werkoplossing door 20 μL FDA voorraadoplossing toe te voegen (Eindconcentratie: 10 μg / ml) en 50 μl PI-stamoplossing (eindconcentratie: 50 μg / ml) in 10 ml PBS. Meng door vortexing en plaats dit op ijs.
    1. Voor de FDA-PI-Hoechst werkoplossing voegt u 20 μL FDA-voorraadoplossing toe (eindconcentratie: 10 μg / ml), 50 μl PI-voorraadoplossing (eindconcentratie: 50 μg / ml) en 10 μl Hoechst voorraadoplossing (Uiteindelijke concentratie: 5 μg / ml) in 10 ml PBS. Meng door vortexing en plaats dit op ijs.
      OPMERKING: Verspreid de FDA-PI werkoplossing en FDA-PI-Hoechst werkoplossing voor het gebruik.
  2. Neem de celkweekplaat uit de incubator. Zet het op ijs.
  3. Aspireer het kweekmedium en vervang het met koude PBS.
    OPMERKING: De oplossing moet langzaam en zorgvuldig worden uitgevoerd. Vermijd het aanraken van de cellen met pipet tips.
  4. Aspireer de koude PBS en vervang deze met koude FDA-PI of FDA-PI-Hoechst werkoplossing (500 μl / weLl voor 12-cellencelcultuurplaten of 1 ml / putje voor 6-putjescelcultuurplaten). Laat het ijs voor 5 minuten.
  5. Aspireer de FDA-PI of FDA-PI-Hoechst werkoplossing en voeg koude PBS (100 μL / putje toe voor 12-cellencelcultuurplaten of 50 μl / putje voor 6-cellencelcultuurplaten).
    OPMERKING: Cellen mogen niet drogen bij het maken van afbeeldingen.
  6. Neem afbeeldingen met behulp van fluorescerende microscopie. Gebruik een excitatiefilter met een pasband van 450 - 490 nm. Ontdek de fluorescentie emissies voor respectievelijk FDA, PI en Hoechst bij respectievelijk 520, 620 en 460 nm. Onder dezelfde omstandigheden, neem een ​​afbeelding onder normaal licht met behulp van de fase contrast modus van fluorescerende microscopie.
    OPMERKING: Neem beelden binnen 15 minuten na FDA-PI of FDA-PI-Hoechst-kleuring. De belichtingstijd bedraagt ​​100-300 ms en de analoge winst is 2,8x.

7. Beoordeling van neuronale levensvatbaarheid

  1. Voor FDA-PI dubbele kleuring, overlay de beelden van de cellen gedetecteerd na het filterenDoor verschillende fluorescentiefilters door de FDA-positieve laag op de PI-positieve laag in een grafische editorsoftware te slepen.
    1. Pas de dekking van de FDA-positieve laag aan door "50%" in het veld "Opaciteit" van het "Lagen" paneel in te voeren. Voeg twee lagen samen door op de knop "Merge Visible" in het menu "Layer" te klikken. Stel het contrast van de overlaybeelden in door "50" in het veld "Contrast" in te voeren onder "Afbeelding" | "Aanpassingen" | "Helderheids contrast." Zorg ervoor dat er geen FDA en PI dubbel positieve cellen in de overlaybeelden zijn.
  2. Voor FDA-PI-Hoechst triple-kleuring, overlay de beelden van de cellen die zijn vastgesteld na het filteren van verschillende fluorescentiefilters door de FDA-positieve laag op de PI-positieve laag in een grafische editorsoftware te slepen. Pas de opaciteit van de FDA-positieve laag aan door "50%" in het veld "Opaciteit" van de "Layers & #"34; paneel.
    1. Voeg twee lagen samen door op de knop "Merge Visible" in het menu "Layer" te klikken. Sleep de Hoechst-positieve laag op de samengevoegde laag. Pas de opaciteit van de Hoechst-positieve laag aan door "50%" in het veld "Opaciteit" van het "Lagen" paneel in te voeren. Voeg de twee lagen samen door op de knop "Merge Visible" in het menu "Layer" te klikken.
  3. Visueel onderscheid grote, onregelmatige glialcellen van CGNs door de beelden die onder de fluorescentiemodus zijn genomen te vergelijken met die welke onder fase contrastmodus zijn genomen - cellen met een diameter van drie keer groter dan CGNs worden beschouwd als glialcellen en dienen uitgesloten te worden.
  4. Tel het aantal respectievelijke levensvatbare neuronen en dode neuronen, met behulp van een celteller plugin in een beeldverwerkingsprogramma ( bijv. ImageJ) 4 .
    1. Voor dubbele kleuring van FDA-PI markeer handmatig kleine FDA-positieve cellen alsLevensvatbare neuronen. Markeer PI-positieve cellen handmatig als dode neuronen. Voor FDA-PI-Hoechst triple staining, markeer kleine FDA- en Hoechst-dubbel-positieve cellen handmatig als levensvatbare neuronen. Markeer PI- en Hoechst-dubbel-positieve cellen handmatig als dode neuronen.
  5. Bereken het percentage neuronale levensvatbaarheid door gebruik te maken van de volgende vergelijking:% neuronale levensvatbaarheid = [aantal levensvatbare neuronen / (aantal dode neuronen + aantal levensvatbare neuronen)] x 100%. Kies voor elke put vijf willekeurige velden en gemiddelde het percentage neuronale levensvatbaarheid.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De dubbele immunostaining van GAP43 (rood) en GFAP (groen) werd gebruikt om de vorm van neuronen en gliale cellen, respectievelijk 2 , 5 te analyseren. Zowel neuronen als gliale cellen zijn aanwezig in CGN-cultuur. De GFAP-positieve glialcellen zijn groot en onregelmatig in vorm, zoals aangegeven door de pijlen in de afbeeldingen ( Figuur 1 ). Traditionele assays voor cel vitaliteit kunnen geen gliale cellen onde...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol werd gewijzigd van procedures die eerder zijn beschreven 6 , 7 . Onderzoekers hebben tijd aan het proberen om de niet-neuronale celgroei te verminderen door de voorwaarden te verbeteren bij het cultiveren van primaire neuronen in vitro 8 . Echter, zelfs bij verbeterde kweekomstandigheden blijven sommige gliale cellen. Bovendien zijn niet-neuronale cellen nodig in primaire neuronale culturen, omdat ze helpen bij neuro...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Stichting Natuurwetenschappen van de provincie Zhejiang (LY15H310007), het toegepaste onderzoeksproject inzake non-profit technologie van de provincie Zhejiang (2016C37110), de Nationale Natuurwetenschappenstichting van China (U1503223, 81673407), de Ningbo International Science and Technology Cooperation Project (2014D10019), het Ningbo Municipal Innovation Team van Life Science and Health (2015C110026), het Guangdong Provinciaal Internationaal Samenwerkingsproject van Wetenschap en Technologie (No. 2013B051000038), het Shenzhen Basic Research Programma (JCYJ20160331141459373), de Guangdong-Hong Kong Technology Co-operation Funding Scheme (GHP / 012 / 16GD), de Onderzoeksraad van Hong Kong (15101014), de Hong Kong Polytechnische Universiteit (G-YBGQ) en het KC Wong Magna Fonds aan de Universiteit van Ningbo.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Poly-L-Lysine (PLL)SigmaP2636
D-glucoseSigmaG8270
Cytosine β-D-ArabinofuranosideSigmaC1768
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco10099141hoge kwaliteit FBS is essentieel voor cultuur
100x glutamineGibco25030081
100x antibioticaGibco15240062
Basal Medium Eagle (BME)Gibco21010046
Fluoresceine diacetaat (FDA)SigmaF7378
Propidium Jodide (PI)SigmaP4170
Hoechst 33342Yesen40731ES10
konijn Anti-GAP43 antilichaamAbcamab75810
muis Anti-GFAP antilichaamCellsignaling3670
Bovine Serum Albumine (BSA)Sangon BiotechA602440
TrypsineSigmaT4665
DNAseSigmaD5025
Sojabonen trypsine remmerSigmaT9003
Pasteur-pipetVolacZ310727brand de punt rond voor gebruik
12-well cellen kweekplatenTPPZ707783
6-well cellen kweekplatenTPPZ707759hoge kwaliteit cellen kweekplaat is essentieel voor cultuur
FilterMilliporeSLGP033RB
Pipet 5 mLExcell BioCS017-0003
Pipet 10 mLExcell BioCS017-0004
DissectiemicroscoopShanghai CaikangXTL2400
CO2 IncubatorThermo Scientific311
FluorescentiemicroscoopNikonTI-S
Fluorescentiefilter en emissie cubesNikonB-2A, G-2A, UV-2A
Foto softwareNikonNIS-Elements
Grafische editor softwareAdobePhotoshop CS
BeeldverwerkingssoftwareNIHImageJ

Referenties

  1. Yu, J., et al. Indirubin-3-oxime prevents H2O2-induced neuronal apoptosis via concurrently inhibiting GSK3beta and the ERK pathway. Cell Mol Neurobiol. , (2016).
  2. Cui, W., et al. The anti-cancer agent SU4312 unexpectedly protects against MPP(+) -induced neurotoxicity via selective and direct inhibition of neuronal NOS. Br J Pharmacol. 168 (5), 1201-1214 (2013).
  3. Jebelli, J., Piers, T., Pocock, J. Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester. J Vis Exp. (101), e52983(2015).
  4. Labno, C. Two way to count cells with ImageJ. , https://digital.bsd.uchicago.edu/docs/cell_counting_automated_and_manual.pdf (2008).
  5. Haag, D., et al. Nos2 Inactivation promotes the development of medulloblastoma in Ptch1(+/-) mice by deregulation of Gap43-dependent granule cell precursor migration. Plos Genet. 8 (3), e1002572(2012).
  6. Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), e990(2009).
  7. Messer, A. The maintenance and identification of mouse cerebellar granule cells in monolayer culture. Brain Res. 130 (1), 1-12 (1977).
  8. Li, W., et al. Novel dimeric acetylcholinesterase inhibitor bis7-tacrine, but not donepezil, prevents glutamate-induced neuronal apoptosis by blocking N-methyl-D-aspartate receptors. J Biol Chem. 280 (18), 18179-18188 (2005).
  9. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).
  10. Cheung, G., Cousin, M. Quantitative analysis of synaptic vesicle pool replenishment in cultured cerebellar granule neurons using FM Dyes. J Vis Exp. (57), e3143(2011).
  11. Atlante, A., et al. Genistein and daidzein prevent low potassium-dependent apoptosis of cerebellar granule cells. Biochem Pharmacol. 79 (5), 758-767 (2010).
  12. Silva, R., Rodrigues, C., Brites, D. Rat cultured neuronal and glial cells respond differently to toxicity of unconjugated bilirubin. Pediatr Res. 51 (4), 535-541 (2002).
  13. Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of cerebellar granule neurons undergoing apoptosis by potassium/serum deprivation. Cell Death Differ. 13 (9), 1595-1610 (2006).
  14. Garner, D. L., Johnson, L. A. Viability Assessment of Mammalian Sperm Using Sybr-14 and Propidium Iodide. Biol Reprod. 53 (2), 276-284 (1995).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Beoordeling van de neuronale viabiliteitfluoresce ne diacetaatkleuringpropidiumjodidekleuringuitsluiting van gliacellenfluorescentiemicroscopieFDA PI dubbelkleuringHoechst DNA kleuringmeting van de celviabiliteitprimaire neuronale cultuur

Gerelateerde artikelen