Dit protocol beschrijft hoe om neuronale levensvatbaarheid nauwkeurig te meten met behulp van Fluorescein Diacetate (FDA) en Propidium Iodide (PI) dubbele kleuring in gekweekte cerebellar granule neuronen, een primaire neuronale cultuur die gebruikt wordt als een in vitro model in neurowetenschappen en neurofarmacologie onderzoek.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Beoordeling van neuronale levensvatbaarheid met behulp van Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Dubbele Verf In Cerebellaire Granule Neuron Cultuur
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Primaire gekweekte Cerebellar Granule Neuronen (CGN's) zijn veel gebruikt als een in vitro model in neuroscience en neuropharmacology onderzoek. Het co-bestaan van gliale cellen en neuronen in CGN-cultuur kan echter leiden tot vooroordelen bij de nauwkeurige beoordeling van neuronale levensvatbaarheid. Fluoresceendiacetaat (FDA) en Propidiumjodide (PI) dubbele kleuring is gebruikt om de levensvatbaarheid van cellen te meten door de levensvatbare en dode cellen tegelijkertijd te evalueren. We hebben FDA-PI dubbele kleuring gebruikt om de gevoeligheden van de colorimetrische analyses te verbeteren en neuronale levensvatbaarheid in CGN's te evalueren. Verder voegde we blauwe fluorescerende DNA vlekken toe (bijvoorbeeld Hoechst) om de nauwkeurigheid te verbeteren. Dit protocol beschrijft hoe de nauwkeurigheid van de beoordeling van neuronale levensvatbaarheid kan verbeteren door gebruik te maken van deze methoden in de CGN-cultuur. Met behulp van dit protocol kan het aantal gliale cellen uitgesloten worden met behulp van fluorescentiemicroscopie. Een soortgelijke strategie kan worden toegepast om de ongewenste gli te onderscheidenAlcellen van neuronen in verschillende gemengde celculturen, zoals primaire corticale cultuur en hippocampale cultuur.
Inleiding
Colorimetrische cytotoxiciteitsbepalingen, zoals de 3- (4, 5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-difenyl-2-H-tetrazoliumbromide (MTT) -assay, worden gewoonlijk gebruikt om de levensvatbaarheid van cellen in vitro te meten. Primaire gekweekte Cerebellar Granule Neuronen (CGN's) van ratten zijn gevoelig voor verschillende neurotoxinen, waaronder 1-methyl-4-fenylpyridinium-ion, waterstofperoxide en glutamaat 1 , 2 . Daarom kunnen CGN culturen gebruikt worden als een in vitro model op het gebied van neurowetenschappen. CGN-culturen kunnen een verscheidenheid aan cellen bevatten, waaronder ne....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle procedures volgden de National Institutes of Health (NIH) Gids voor de zorg en het gebruik van laboratoriumdieren (NIH Publicaties nr. 80-23, herzien 1996) en werden goedgekeurd door het Institutionele Diervoeder- en Gebruikskomitee (IACUC) aan de universiteit van Ningbo ( SYXK-2008-0110).
1. Bereiding van oplossingen en cultuurmedia
Opmerking: Reagenten en voorraden moeten onder steriele omstandigheden worden bereid. Steriliseer door te filteren met behulp van een filter met een poriegrootte van 0,22 μm.
- Bereid Poly-L-Lysine (PLL) voorraadoplossing door 5 mg PLL toe te voegen aan 10 ml dubbel ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De dubbele immunostaining van GAP43 (rood) en GFAP (groen) werd gebruikt om de vorm van neuronen en gliale cellen, respectievelijk 2 , 5 te analyseren. Zowel neuronen als gliale cellen zijn aanwezig in CGN-cultuur. De GFAP-positieve glialcellen zijn groot en onregelmatig in vorm, zoals aangegeven door de pijlen in de afbeeldingen ( Figuur 1 ). Traditionele assays voor cel vitaliteit kunnen geen gliale cellen onde.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol werd gewijzigd van procedures die eerder zijn beschreven 6 , 7 . Onderzoekers hebben tijd aan het proberen om de niet-neuronale celgroei te verminderen door de voorwaarden te verbeteren bij het cultiveren van primaire neuronen in vitro 8 . Echter, zelfs bij verbeterde kweekomstandigheden blijven sommige gliale cellen. Bovendien zijn niet-neuronale cellen nodig in primaire neuronale culturen, omdat ze helpen bij neuro.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Stichting Natuurwetenschappen van de provincie Zhejiang (LY15H310007), het toegepaste onderzoeksproject inzake non-profit technologie van de provincie Zhejiang (2016C37110), de Nationale Natuurwetenschappenstichting van China (U1503223, 81673407), de Ningbo International Science and Technology Cooperation Project (2014D10019), het Ningbo Municipal Innovation Team van Life Science and Health (2015C110026), het Guangdong Provinciaal Internationaal Samenwerkingsproject van Wetenschap en Technologie (No. 2013B051000038), het Shenzhen Basic Research Programma (JCYJ20160331141459373), de Guangdong-Hong Kong Technology Co-oper....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Poly-L-Lysine (PLL) | Sigma | P2636 | |
| D-glucose | Sigma | G8270 | |
| Cytosine β-D-Arabinofuranoside | Sigma | C1768 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099141 | hoge kwaliteit FBS is essentieel voor cultuur |
| 100x glutamine | Gibco | 25030081 | |
| 100x antibiotica | Gibco | 15240062 | |
| Basal Medium Eagle (BME) | Gibco | 21010046 | |
| Fluoresceine diacetaat (FDA) | Sigma | F7378 | |
| Propidium Jodide (PI) | Sigma | P4170 | |
| Hoechst 33342 | Yesen | 40731ES10 | |
| konijn Anti-GAP43 antilichaam | Abcam | ab75810 | |
| muis Anti-GFAP antilichaam | Cellsignaling | 3670 | |
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Sangon Biotech | A602440 | |
| Trypsine | Sigma | T4665 | |
| DNAse | Sigma | D5025 | |
| Sojabonen trypsine remmer | Sigma | T9003 | |
| Pasteur-pipet | Volac | Z310727 | brand de punt rond voor gebruik |
| 12-well cellen kweekplaten | TPP | Z707783 | |
| 6-well cellen kweekplaten | TPP | Z707759 | hoge kwaliteit cellen kweekplaat is essentieel voor cultuur |
| Filter | Millipore | SLGP033RB | |
| Pipet 5 mL | Excell Bio | CS017-0003 | |
| Pipet 10 mL | Excell Bio | CS017-0004 | |
| Dissectiemicroscoop | Shanghai Caikang | XTL2400 | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 311 | |
| Fluorescentiemicroscoop | Nikon | TI-S | |
| Fluorescentiefilter en emissie cubes | Nikon | B-2A, G-2A, UV-2A | |
| Foto software | Nikon | NIS-Elements | |
| Grafische editor software | Adobe | Photoshop CS | |
| Beeldverwerkingssoftware | NIH | ImageJ |
Referenties
- Yu, J., et al. Indirubin-3-oxime prevents H2O2-induced neuronal apoptosis via concurrently inhibiting GSK3beta and the ERK pathway. Cell Mol Neurobiol. , (2016).
- Cui, W., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
