We beschrijven een methode om apparaten te construeren voor 3D-cultuur en experimenten met cellen en multicellulaire organoids. Dit apparaat maakt analyse van cellulaire reacties op oplosbare signalen in 3D-micromilieus met gedefinieerde chemoattractant gradiënten. Organoids zijn beter dan enkele cellen bij de opsporing van zwakke luidruchtige ingangen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
3D-analyse van multi-cellulaire reacties op chemoattractant gradiënten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Verschillende beperkingen van de 2D-cel cultuursystemen hebben gevonkt interesse in 3D-cel cultuur en analyse platforms, die beter zou nabootsen van de ruimtelijke en chemische complexiteit van levende weefsels en na te bootsen in vivo weefsel functies. Recente ontwikkelingen in de microfabricage technologieën hebben de ontwikkeling van 3D in vitro omgevingen vergemakkelijkt waarin cellen kunnen worden geïntegreerd in een goed gedefinieerde extracellulaire matrix (ECM) en een gedefinieerde set van oplosbare of matrix geassocieerde biomoleculen. De technologische belemmeringen hebben echter hun wijdverbreide gebruik in onderzoekslaboratoria beperkt. Hier beschrijven we een methode om eenvoudige apparaten te construeren voor 3D-cultuur en experimenten met cellen en multicellulaire organoids in 3D-micromilieus met een gedefinieerde chemoattractant gradiënt. Wij illustreren het gebruik van dit platform voor de analyse van de respons van epitheelcellen en organoids naar gradiënten van groeifactoren, zoals epidermale groeifactor (EFG). EFG gradiënten waren stabiel in de apparaten voor enkele dagen die leiden tot gerichte Branch vorming in de borst organoids. Deze analyse konden we concluderen dat collectieve gradiënt sensing door groepen van cellen is gevoeliger versus enkele cellen. We beschrijven ook de fabricagemethode, die niet nodig fotolitho grafie faciliteiten, noch geavanceerde zachte lithografie technieken. Deze methode zal nuttig zijn om 3D cellulair gedrag te bestuderen in de context van de analyse van de ontwikkeling en pathologische staten, met inbegrip van kanker.
Inleiding
In fysiologische omgeving, cellen zijn ingebed in een extracellulaire matrix (ECM) en blootgesteld aan een overvloed aan biomoleculen. Interacties tussen cellen en de omliggende omgeving reguleren intracellulaire processen die diverse fenotypes beheersen, waaronder migratie, groei, differentiatie en overleving1,2. Er is veel geleerd over cellulair gedrag in een conventionele 2D-cel cultuur. Echter, met de komst van intravital Imaging en experimenten met cellen ingebed in 3D-hydrogels, belangrijke verschillen in cel gedrag zijn erkend in de vereenvoudigde 2D in vitro culturen versus 3D-weefsel-achtige omgevingen. Terwijl de cellen interageren met ECM vezels en de betekenis van hun mechanische eigenschappen binnen de 3D-matrix, de materiële stijfheid van de gel is niet een volledig onafhankelijke variabele in een 2D in vitro-systeem. De dimensionaliteit verandert focal adhesie vorming, wat resulteert in verschillende cel morfologie en gedrag. Bovendien zijn cellen op een 2D-oppervlak blootgesteld aan minder signalering cues dan cellen open voor alle richtingen in 3D.
Deze beperkingen hebben de belangen verhoogd voor 3D-systemen die de ruimtelijke en chemische complexiteit van levende weefsels vertegenwoordigen en beter voorspellen in vivo weefsel functies. Zij zijn ontwikkeld in vele vormen van organoids als zelf-assembleert cellulaire microstructuren aan cellen die willekeurig in ECM worden gestrooid3,4. Recente ontwikkelingen in de microfabricage technologieën hebben de komst van verschillende soorten 3D-cultuursystemen5,6,7,8,9 voor het bestuderen van fenotypische veranderingen en cellulaire reacties op oplosbare signalen; technologische belemmeringen beperken echter het wijdverbreide gebruik in onderzoekslaboratoria. In veel gevallen, de fabricageprocessen vereisen fotolitho grafie technieken en achtergrondkennis voor zachte lithografie. Bovendien moeten verschillende factoren worden gecontroleerd om met succes een apparaat te bouwen en om een optimale functie van het apparaat te bereiken over een lange periode van tijd.
Onze methode beschrijft hoe een 3D PDMS apparaat te construeren voor de integratie van cellen en multicellulaire organoids in een 3D-omgeving met gedefinieerde chemoattractant gradiënten en vervolgens te analyseren epitheel reacties op EFG10. Uit onze gegevens blijkt dat de capaciteit van organoids om te reageren op ondiepe EFG-gradiënten voortvloeit uit intercellulaire chemische koppeling door gap junctions. Het suggereert het potentieel van organoids voor een nauwkeurigere opsporing van zwakke en lawaaierige ruimtelijk gegradeerde ingangen. Het fabricageproces vereist geen cleanroom installatie, noch fotolitho grafie technieken. Echter, de 3D PDMS apparaat bevat de nodige factoren van 3D fysiologische omgeving. Deze methode zal nuttig zijn om 3D cellulair gedrag te bestuderen en het heeft groot onderzoekpotentieel met verschillende cel types, chemoattractants, en ECM combinaties.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dieren werk werd uitgevoerd in overeenstemming met de protocollen beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Animal zorg en het gebruik Comite, Johns Hopkins University, school of Medicine.
1. fabricage van het mesofluidic apparaat
- Ontwerp het masker van de mal voor PDMS apparaat met behulp van een 3D-CAD-software.
- Print de mal met behulp van stereolithography apparatuur met een thermisch resistente hars.
Opmerking: de hier beschreven procedures werden uitgevoerd door een commerciële 3D print service. - Meng een PDMS monomeer oplossing met het Uithardings middel in een 10:1 verhouding. voor de fabricage van het apparaat is 3 mL PDMS mengsel vereist. Het totale volume is afhankelijk van het aantal van de mallen worden gefabriceerd.
- Degas het mengsel door het toepassen van een vacuüm met het gebruik van een in-house laboratorium vacuüm of vacuümpomp in een vacuüm verdrooger gedurende 1 uur.
- DEP het oppervlak van de mal met een plakband om stof te verwijderen, en giet het PDMS mengsel aan de mal. Als bubbels worden ingevoerd in het proces, herhaal ontgassing in de vacuüm verdrooger. Bubbels opgesloten tussen de pilaren van de mal kan worden verwijderd doorprikken ze met een scherpe naald.
Opmerking: de ontgassing proces bij kamertemperatuur moet worden gedaan binnen 1 uur of minder. - Cure de PDMS door het verwarmen van 80 °C gedurende 2 uur. Laat de mal af te koelen bij kamertemperatuur.
- Snijd de grens tussen de mal en PDMS met een mes en dan afpellen PDMS uit de mal zorgvuldig.
- Trim de PDMS deel aan de 22 mm x 22 mm dekglaasje te passen en punch een gat aan de inlaat.
Opmerking: het protocol kan hier worden onderbroken. - Reinig de PDMS deel en 22 mm x 22 mm dekglaasje door het afvegen van de oppervlakken met een laag-lint weefsels en 70% ethanol. Verwijder vervolgens grote stofdeeltjes door deppen met een plakband.
- Steriliseer het PDMS deel en dekglaasje door een van beide autoclaaf (121 °C gedurende 8 minuten NAT, 15 minuten droog) of blootstelling aan UV-licht gedurende 1 uur.
- Behandel de onderkant van de PDMS deel en cover slip met Corona kwijting Gun voor 5 min in het weefselcultuur kap en vervolgens Bond ze samen.
Let op: Leg alle niet-geleidend materiaal zoals polystyreenschuim op de bodem en verwijder alle geleidende materialen tijdens dit proces. Injecteer collageen onmiddellijk in het apparaat, binnen 5 minuten, na de behandeling om de verlijming tussen collageen gel en glas dekglaasje te verhogen.
2. Cell voorbereiding: primaire borst organite isolatie
Opmerking: de details van de borstklier organite isolatie kan worden gevonden in een vorig werk11. Elke vorm van enkele cel of organite kan worden bereid volgens hun eigen isolatie/detachement protocollen.
- Gehakt de borstklier weefsel van de muizen met een scalpel tot het weefsel ontspant en schud het voor 30 min bij 37 ° c in 50 mL van Collagenase/trypsine oplossing (10 mL per muis) in DEME/F12 aangevuld met 0,1 g van trypsine, 0,1 g van Collagenase , 5 mL FBS, 250 l van 1 μg/mL insuline, en 50 l van 50 μg/mL gentamicine.
- Centrifugeer de Collagenase/trypsine oplossing bij 1.250 x g voor 10 min. Verwijder de bovendrijvende door aspiratie. Verspreid cellen in 10 mL van DMEM/F12, en centrifugeer bij 1.250 x g gedurende 10 min. Na het verwijderen van DMEM/F12 door aspiratie, opnieuw op te schorten cellen in 4 mL van DMEM/F12 aangevuld met 40 l van DNase (2 eenheden/l).
- Schud de DNase oplossing met de hand voor 2-5 min en dan Centrifugeer bij 1.250 x g voor 10 min.
- Afzonderlijke organoids van enkele cellen door vier differentiële Centrifuges (Pulse tot 1.250 x g en stop de centrifuge 3-4 s na het bereiken van de beoogde snelheid). Tussen elke puls, aspireren de bovendrijvende en de pellet opnieuw op te schorten in 10 mL van DMEM/F12.
- Re-Suspend de laatste pellet in de gewenste hoeveelheid groeimedium van DMEM/F12 met 1% penicilline/streptomycine en 1% insuline-transferrin-selenium-X voor de voorbereiding van collageen.
3. collageen voorbereiding en injectie
Opmerking: andere soorten ECM gels kunnen worden bereid volgens hun eigen gelering protocollen.
- Bereid collageen type I oplossing (3,78 mg/mL), 10x DMEM, 1 N NaOH oplossing, normaal groeimedium op ijs.
Nota: Houd op ijs tot de procedure wordt voltooid. - Voeg 6 l van 1 N NaOH oplossing toe, 200 l van groeimedium en 50 l van 10x DMEM in een pre-gekoelde micro centrifugebuis en meng de oplossing grondig.
- Voeg 425 l van collageen in de pre-Mixed oplossing toe en meng door pipetten.
- Centrifugeer het collageen mengsel kort (minder dan 5 seconden) te scheiden en te verwijderen bubbels uit het mengsel.
- Houd de geneutraliseerde collageen oplossing op ijs voor 1 uur tot vezelvorming te induceren.
- Voeg 50 l van de cel schorsing in het collageen mengsel en meng grondig.
Opmerking: de uiteindelijke collageen concentratie is 2 mg/mL. - Injecteer de oplossing met 200 l pipet door de inlaat van het PDMS apparaat totdat de hele kamer is ingevuld. Als het collageen mengsel overloopt door de lacunes van de pilaren, knip de overtollige collageen gel met scherpe chirurgische mes na gelering.
- Houd het apparaat in de incubator bij 37 °C met 5% CO2 voor 1 uur om gelering te induceren.
- Vul de reservoirs aan beide zijden met groeimedium en houd het apparaat in de incubator op 37 ° c met 5% CO2 tot confocale beeldvorming wordt uitgevoerd.
4.3D beeldvorming en kwantificering
- Installeer een levende-cel Imaging cultuurkamer aan een confocale Microscoop en vooraf ingesteld de temperatuur en CO2 tot 37 ° c en 5%, respectievelijk. Om vochtigheid omhoog te krijgen, voeg water in het reservoir van de kamer toe en plaats natte doekjes in de kamer indien nodig.
- Plaats het PDMS apparaat in de kamer en voeg EFG toe aan een van de reservoirs als "bron" van het EFG in de gradiënt formatie. Het andere reservoir zal een ' gootsteen ' dienen voor de ontwikkeling van de ruimtelijk gegradeerde EFG-verdeling. 2,5 nM EFG werd toegevoegd in de gootsteen voor het maken van de gradiënt van 0,5 nM/mm in deze studie.
- Stel het bereik van de Z-stack met betrekking tot het volume van de organoids van belang en start de Imaging.
Let op: om fototoxiciteit te voorkomen, probeer dan een lagere Laser intensiteit in confocale beeldvorming of gebruik multi-foton Imaging technieken. - Reconstrueren een 3D-beeld van 2D-afbeelding stacks met behulp van commerciële software of een op maat gemaakt programma. Meet de lengte en hoek van de takken die zich uitstrekken van de organoids of migratie van individuele cellen. Hier, uit te voeren kwantificering door het tekenen van een FreeHand schets rond de organite lichaam met behulp van ImageJ.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
EFG is een essentiële regulator van vertakking morfogenese in de borstklieren en een kritische chemoattractant het begeleiden van de migratie van borst epitheelcellen in invasieve groei van kanker. We gebruikten de mesoscopische vloeibare apparaten hierboven beschreven om de reactie van cellen te bestuderen om gedefinieerde EFG gradiënten (Figuur 1a, B)10. Het apparaat levert een cultuurgebied van 5 mm breed, 10 mm lan...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De fabricage van PDMS mallen werd uitgevoerd met behulp van een commerciële 3D print service, maar kan ook worden bereikt door een high-end 3D-printer in-House. Onder verschillende 3D fabricagemethoden, stereolithography wordt aanbevolen voor hoge resolutie schimmel generatie. Omdat PDMS uitharding op hoge temperatuur (80 °C) plaatsvindt, moeten de materialen voldoende thermisch resistent zijn, die expliciet moeten worden gespecificeerd, als het afdrukken uitbesteed is. Een thermische post-Cure kan worden besproken met d...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gesteund door toelagen aan AJE (NSF PD-11-7246, de Stichting van het onderzoek van de borstkanker (BCRF-17-048), en NCI U54 CA210173) en AL (U54CA209992).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 22mm x 22mm dekglas | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Collageen I, Rat | Fisher Scientific | CB-40236 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| COMSOL Multiphysics 4.2 | COMSOL Inc | Gebruikt voor het simuleren van diffusiedynamica | |
| 10x DMEM | Sigma-Aldrich | D2429 | |
| DEME/F12 | Thermo Fisher | 11330032 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D4623 | |
| EGF Recombinant Muis-Eiwit | Thermo Fisher | PMG8041 | |
| Fetaal Runderserum (FBS) | Life technologies | 16140-071 | |
| Fiji-ImageJ | Gebruikt voor het meten van vertakkingslengte en hoeken | ||
| Gentamicine | GIBCO | 5750-060 | |
| IMARIS | Bitplane | ||
| Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
| Insulin-Transferrine-Selenium-X | GIBCO | 51500 | |
| Weinig pluis tissue | Kimberly-Clark Professional | Kimtech doek | |
| Materiaal voor mal | Proto labs | Accura SL5530 | |
| Apparatuur voor malprinten | Proto labs | Stereolithogrphy | Maximale afmeting: 127mm x 127mm x 63.5mm, Laagdikte: 0.0254mm |
| Dienst voor malprinten | Proto labs | Aangepast | https://www.protolabs.com/ |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Penicilline/Streptomycine | VWR | 16777-164P | |
| Spinning-disk confocale microscoop | Solamere Technology Group | ||
| Sylgard 184 | Electron Microscopy Sciences | 184 SIL ELAST KIT | PDMS kit |
| Trypsine | Sigma-Aldrich | T9935 |
Referenties
- Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 15 (12), 802-812 (2014).
- Schwartz, M. A., Schaller, M. D., Ginsberg, M. H. Integrins: emerging paradigms of signal transduction. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 11, 549-599 (1995).
- Yin, X., et al. Engineering Stem Cell Organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
- Doyle, A. D., Carvajal, N., Jin, A., Matsumoto, K., Yamada, K. M. Local 3D matrix microenvironment regulates cell migration through spatiotemporal dynamics of contractility-dependent adhesions. Nature Communications. 6, 8720(2015).
- Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 423-449 (2008).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Zervantonakis, I. K., et al. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13515-13520 (2012).
- Barkefors, I., Thorslund, S., Nikolajeff, F., Kreuger, J. A fluidic device to study directional angiogenesis in complex tissue and organ culture models. Lab on a Chip. 9 (4), 529-535 (2009).
- Hou, Z., et al. Time lapse investigation of antibiotic susceptibility using a microfluidic linear gradient 3D culture device. Lab on a Chip. 14 (17), 3409-3418 (2014).
- Ellison, D., et al. Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), E679-E688 (2016).
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. 3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion. Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
