Methodenartikel

Een protocol voor immunohistochemie en RNA-in-situ distributie binnen vroege drosophila-embryo's

DOI:

10.3791/61776

⸱

6 mei 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1National Engineering Laboratory for Resource Development of Endangered Crude Drugs in Northwest of China/CGDB, Shaanxi Normal University College of Life Sciences, 2Shaanxi Key Laboratory of Ischemic Cardiovascular Disease, Shaanxi Key Laboratory of Brain disorders, Institute of Basic & Translational Medicine, Xi'an Medical University, 3Ohio State University College of Medicine, 4Hematology-Oncology Division, Department of Medicine, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 5University of Pennsylvania ULAR, 6University of Maryland School of Medicine, 7Columbia University Medical Center

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een protocol voor detectie en lokalisatie van Drosophila embryo-eiwit en RNA van verzameling tot pre-embedding en embedding, immunostaining en mRNA in situ hybridisatie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Calcium geïnduceerde calciumafgiftesignalering (CICR) speelt een cruciale rol in veel biologische processen. Elke cellulaire activiteit van celproliferatie en apoptose, ontwikkeling en veroudering, tot neuronale synaptische plasticiteit en regeneratie zijn in verband gebracht met Ryanodine-receptoren (RyRs). Ondanks het belang van calciumsignalering is het exacte mechanisme van zijn functie in vroege ontwikkeling onduidelijk. Als organisme met een korte draagtijd zijn de embryo's van Drosophila melanogaster de belangrijkste proefpersonen voor het onderzoeken van de distributie en lokalisatie van CICR-geassocieerde eiwitten en hun regulatoren tijdens de ontwikkeling. Vanwege hun lipiderijke embryo's en chitinerijke chorion wordt hun nut echter beperkt door de moeilijkheid om embryo's op glazen oppervlakken te monteren. In dit werk introduceren we een praktisch protocol dat de hechting van drosophila-embryo op dia's aanzienlijk verbetert en gedetailleerde methoden voor succesvolle histochemie, immunohistochemie en in-situ hybridisatie. De chroomalum gelatine slide-coating methode en embryo pre-embedding methode verhoogt dramatisch de opbrengst bij het bestuderen van Drosophila embryo-eiwit en RNA-expressie. Om deze aanpak aan te tonen, bestudeerden we DmFKBP12/Calstabin, een bekende regulator van RyR tijdens de vroege embryonale ontwikkeling van Drosophila melanogaster. We identificeerden DmFKBP12 al in de syncytiele blastodermfase en rapporteerden het dynamische expressiepatroon van DmFKBP12 tijdens de ontwikkeling: aanvankelijk als een gelijkmatig verdeeld eiwit in het syncytiele blastoderm, vervolgens preliminaal lokaliserend naar de kelderlaag van de cortex tijdens cellulair blastoderm, voordat het zich verspreidde in de primitieve neuronale en spijsverteringsarchitectuur tijdens de drie-gem laagfase in vroege gastrulatie. Deze verdeling kan de cruciale rol verklaren die RyR speelt in de vitale orgaansystemen die afkomstig zijn van deze lagen: het subo-oesofageale en supra-oesofageale ganglion, ventraal zenuwstelsel en het bewegingsapparaat.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Calcium geïnduceerde calciumafgiftesignalering (CICR) speelt een cruciale rol in veel biologische processen, zoals skelet- / gladde spieren en cardiale vasculaire functie, celproliferatie en apoptose, ontwikkeling, veroudering, neuronale synaptische plasticiteit en regeneratie1,2,3,4,5,6 . Ryanodinereceptoren (RyRs) en inositol 1,4,5-trisfosfaatreceptoren (IP3R's) zijn belangrijke spelers in de calciumsignaleringsroute die wordt gecontroleerd door hun regulatoren eiwitkinase A (PKA), Ca2 + / calmodulin-afhankelijk eiwitkinase II (CaMKII), FK506-bindende eiwitten (FKBPs), calsequestrin (CSQ), triatidine en junctin1, 2,3,4,5,6 . Abnormale menselijke expressie en mutaties in deze eiwitten kunnen leiden tot pathologische fysiologie zoals aritmieën7 en oncogene proliferatie8,9.

FKBPs reguleren de calciumafgifte uit de endoplasmatische reticulaire (ER) door RyRs. Dit proces is essentieel voor het mechanisme van contractie en dus verantwoordelijk voor alle mechanische bewegingen die worden gegenereerd door myosine-actinecontractie door calcium-geïnduceerde calciumafgifte samen met embryonale RyRs1,2. In muismodellen is het ontbreken van RyR2 en zijn regulator FKBP12 /Calstabin steevast dodelijk, hetzij tijdens de embryonale ontwikkeling of in de vroege postnatale periode10,11,12. FKBP12/Calstabin knock-out muizen vertonen kritieke hartafwijkingen met onregelmatige excitatie-contractiekoppeling (EC) en hersenoedeem tijdens de embryonale ontwikkeling. Dit geeft aan dat FKBP12/Calstabin een essentiële rol speelt bij het reguleren van RyR2-kanaalexpressie, wat belangrijk is voor zowel de cardiale als de cerebrale ontwikkeling10.

RyR uitgevoerde calciumvonken werden aanvankelijk ontdekt in de zygote-vormingsfase van bevruchte Medaka-eieren13,14. Er zijn echter weinig onderzoeken uitgevoerd naar de functie van calciumsignalering in de vroege embryonale ontwikkeling. In Drosophila melanogaster leveren de resultaten verkregen van DmFKBP12 S107-mutanten sterk bewijs ter ondersteuning van het belang van dit gen voor de ontwikkeling van larven en een gezonde levensduur, die wordt toegeschreven aan zijn functie tegen oxidatieve stress15,16. Onlangs identificeerden we de dynamische lokalisatie van FKBP12 / Calstabin-eiwit en boodschapper-RNA tijdens de vroege ontwikkeling van Drosophila melanogaster17. Met behulp van de benaderingen die in deze methodologie worden beschreven, konden we de expressie van FKBP12 / Calstabin in D. melanogaster volgen tijdens het syncytiele blastoderm (0-2 uur), cellulair blastoderm (2-3 uur), vroege gastrula (3-12 uur) en late gastrula (12-24 uur). In dit artikel presenteren we de gedetailleerde protocollen van elke benadering in de vorige studie, inclusief pre-embryo-inbedding voor klassieke paraffinesectie, pre-coating diabehandeling voor embryonale secties, histo-chemie kleuring en immunostaining, en mRNA in-situ hybridisatie voor identificatie van genexpressie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bereiding van druivensap agar borden

  1. Voeg 5 g agar en 5 g sucrose toe aan 150 ml gedestilleerd water. Kook het in de magnetron tot de agar en sucrose volledig zijn opgelost. Meng 50 ml 100% druivensap en de oplossing door elkaar.
  2. Voeg 1 ml 100% propionzuur toe om de uiteindelijke concentratie tot 0,5% propionzuur te maken. Giet 25 ml van de bereide oplossing in elke plaat. Nadat de agar is gestold, bewaart u de media in 4 °C.

2. Coating dia's

  1. Voorbehandeling glijdt met reinigingsmiddel. Was de glaasjes 3 keer met kraanwater en één keer met gedestilleerd water. Droog vervolgens de glaasjes 2 uur in een oven van 45 °C.
  2. Dompel de dia's gedurende 24 uur onder in ongeveer 450 ml kaliumdichromaat zwavelzuuroplossing (20 g kaliumdichromaat, 40 ml gedestilleerd water en 400 ml geconcentreerd zwavelzuur). Was de glaasjes 3 keer met kraanwater en één keer met gedestilleerd water.
    1. Droog de glaasjes twee uur in een oven van 45 °C. Dompel meer dan 2 uur onder in 95% ethanol.
  3. Voeg 0,5 g chroomkaliumsulfaat en 5 g gelatine toe aan 1 l gedestilleerd water. Los voor gebruik op in een waterbad van 60 °C. De chroomalumgelatine kan langdurig bij 4 °C worden bewaard.
  4. Laat 10 μL van de chroomalumgelatine op de dia vallen en bedek het volledige oppervlak van de dia volledig en gelijkmatig met de oplossing. Plaats de dia met de gelatinezijde naar boven in een oven bij 42 °C gedurende 48 uur. De voorbereide platen kunnen bij 4 °C worden bewaard voor later gebruik.
    OPMERKING: Dit is een cruciale stap. De volledige coating is noodzakelijk. Voor fruitvlieg en zijn embryo lijkt deze diacoatingbenadering efficiënter dan poly-lysinecoating.

3. Inbedding van drosophila-embryo's

  1. Drosophila embryo collectie
    OPMERKING: We verzamelden Drosophila-embryo's in vier perioden van 0-2 uur (syncytieel blastoderm), 2-3 uur (cellulair blastoderm), 3-12 uur (vroege gastrula) en 12-24 uur (late gastrula)18. Het aandeel van de belangrijkste embryotypen in elke periode is weergegeven in tabel 1.
    1. Doe 400-500 vliegen in een plastic opvangfles en dek de fles af met de druivensap agarplaat met gistextract. Drosophila-embryo's worden bij kamertemperatuur op de druivensap-agar gelegd.
    2. Verzamel vier perioden embryo's en voeg voorzichtig 2 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCL, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) toe aan elke plaat om de embryo's te laten drijven. Breng ongeveer 200 embryo's over in een centrifugebuis van 50 ml en houd deze gedurende 2 minuten op ijs om de embryo's te laten bezinken.
  2. Vooraf insluiten
    1. Breng 200 Drosophila-embryo's over in een centrifugebuis van 1,5 ml. Houd de buis 2 minuten op ijs om de embryo's te laten bezinken en gooi het supernatant voorzichtig met pipet weg. Voeg 1 ml 50% bleekmiddel toe in de tube en schud het voorzichtig gedurende 2 minuten.
      OPMERKING: Het bleekmiddel moet vers worden bereid en de hoeveelheid bleekmiddel kan variëren afhankelijk van de hoeveelheid embryo's die worden verzameld.
    2. Verzamel embryo's voorzichtig door ze op filterpapier te gieten en was ze 3 keer met 1 ml PBS per keer.
    3. Breng de embryo's met filterpapier terug tot ongeveer 5 ml n-heptaan.
    4. Breng het mengsel over in een verse centrifugebuis van 1,5 ml. Voeg 1 ml methanol toe en schud het voorzichtig. Verzamel embryo's na sedimentatie.
    5. Verwijder supernatant en was de embryo's 3-5 keer in 1 ml PBS.
    6. Fixeer de embryo's met 400 μL Bouin's oplossing (71% verzadigd picrinezuur, 24% formaline, 5% azijnzuur) gedurende 30 min. Was de vaste embryo's 3 keer in 1 ml PBS gedurende 5 minuten elke keer.
    7. Om embryo's te aggregeren, brengt u de monsters over in een rubberen stop en verwijdert u de PBS.
    8. Bereid 1,2% agarose-PBS-oplossing en bewaar de oplossing bij 60 °C. Voeg 200 μL 1,2% agarose-PBS-oplossing toe aan embryo's om ze in een agarblok te fixeren.
    9. Haal het blok uit de stop en bewaar het blok in PBS.
      OPMERKING: Tijdens de pre-embedding-benadering is pro-warming van cruciaal belang voor succes. We raden ten zeerste aan dat de centrifugebuizen en micropipette-tips, die in deze stap worden gebruikt, volledig voorverwarmd zijn voordat ze worden gebruikt.
  3. Paraffine inbedding
    1. Dompel het vooraf ingebedde agarblok gedurende 15 minuten onder in 35% ethanol, 50% ethanol, 75% ethanol en 85% ethanol. Dompel vervolgens 2 keer in 95% ethanol en 100% ethanol.
      OPMERKINGEN: Ongeveer 5-10x blokvolume van elk gevolgd door een gegradeerd fixatief gedurende 15-30 minuten is nodig, afhankelijk van het aantal embryo's in het blok.
    2. Dompel het embryoblok gedurende 15 minuten onder in 100% ethanol en xyleen (1:1 verhouding) oplossing.
    3. Breng het blok gedurende 1 minuut over op xyleen om het embryoweefsel transparant te maken.
    4. Dompel het blok onder in xyleen en paraffine (1:1 verhouding) gedurende 30 minuten.
    5. Dompel het blok onder in paraffine I, paraffine II en paraffine III gedurende 2 uur elke keer.
    6. Vul het insluitvak vooraf met paraffine en breng het blok vervolgens voorzichtig en horizontaal over naar de onderkant van het insluitvak. Nadat de paraffine op natuurlijke wijze stolt, kan het gestolde paraffineblok bij 4 °C worden bewaard.
      OPMERKINGEN: Het vooraf ingesloten monster kan worden gebruikt in cryosectie door de volgende stappen te volgen. Nadat de embryo's vooraf zijn ingebed met agarose zoals hierboven beschreven, worden de monsters eenvoudigweg ingebed in OCT Compound. Daarna kan cryosectie worden uitgevoerd volgens het routinematige cryosectieprotocol. Vervolgens kunnen regelmatige kleuringsbenaderingen op de secties worden gebruikt.

4. Hematoxyline-eosine kleuring

  1. Bereid Drosophila embryo secties voor. Plaats bereide secties gedurende 15 minuten in een oven bij 60 °C en dompel de secties vervolgens 2 keer gedurende 10 minuten onder in xyleen. Dompel de secties eenmaal in 100% ethanol en xyleen (1:1 verhouding) gedurende 2 minuten onder.
  2. Hydrateer de secties in 100% ethanol I, 100% ethanol II, 95% ethanol, 85% ethanol, 75% ethanol, 50% ethanol en in gedestilleerd water gedurende 3 minuten.
  3. Kleur de secties met hematoxyline-oplossing gedurende 2 minuten. Dompel de glaasjes snel in 1% zure alcoholoplossing (1 ml zoutzuur, 100 ml 70% ethanol) en was de glaasjes in gedestilleerd water.
  4. Doop de glaasjes achtereenvolgens in 50% ethanol, 75% ethanol, 85% ethanol en 95% ethanol.
  5. Kleur de secties met eosine-oplossing gedurende 1 min.
  6. Droog de glaasjes uit in 95% ethanol I, 95% ethanol II, 95% ethanol III, 100% ethanol I, 100% ethanol II en 100% ethanol III gedurende telkens 1 minuut.
  7. Verwijder de dia's in 100% xyleen I, 100% xyleen II en 100% xyleen III gedurende 5 minuten elke keer.
  8. Monteer de glijbanen met neutrale balsem volgens de instructies van de fabrikant.

5. Periodieke zuur-zilver methenamine kleuring

  1. Deparaffiniseren en hydrateren van paraffinesecties van Drosophila embryo tot gedestilleerd water.
  2. Oxideer de secties in 1% periodiek zuur gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Spoel de glaasjes 3 keer in gedestilleerd water gedurende 1 min.
  4. Incubeer de glaasjes in ongeveer 40 ml vers gefilterde zilvermethenamine werkoplossing (3% methenamine, 5% zilvernitraat, 5% natriumboraatoplossing) gedurende 1 uur en 20 minuten bij 60 °C. Spoel de glaasjes vervolgens gedurende 1 min af in gedestilleerd water.
  5. Toon de glaasjes gedurende 2 minuten in 0,2% goudchloride en spoel de glaasjes vervolgens gedurende 1 min af in gedestilleerd water.
  6. Plaats de glaasjes gedurende 3 min in 3% natriumthiosulfaat en spoel de glaasjes vervolgens gedurende 1 min af in gedestilleerd water.
  7. Counterstain de dia's in hematoxyline voor 30 s. Was de glijbanen gedurende 3-5 minuten in stromend kraanwater.
  8. Droog de glaasjes uit in 70% ethanol, 80% ethanol, 95% ethanol I, 95% ethanol II, 95% ethanol III, 100% ethanol I en 100% ethanol II gedurende elk 5 minuten.
  9. Verwijder de dia's in 100% xyleen I, 100% xyleen II en 100% xyleen III gedurende elk 5 minuten.
  10. Monteer de glaasjes in neutrale balsem volgens de instructies van de fabrikant.

6. Immunohistochemie

  1. Paraffinesecties van Drosophila-embryo deparaffiniseren en rehydrateren tot PBS volgens het standaardprotocol19.
  2. Behandel dia's met 0,3% H2O2 in methanol gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en vermijd licht.
  3. Verwarm de juiste antigeenophaalbuffer tot ongeveer 100 °C in een container met de glaasjes in de groentestomer. De container moet ook een deksel hebben. Doe de dia's in de container. Sluit het deksel van de stomer.
    1. Houd de container vanaf dit punt 20 minuten in de stomer. Merk op dat het deksel van de schuifcontainer niet volledig moet worden aangedraaid, zodat waterdamp tijdens het stomen kan binnendringen.
  4. Laat de dia's terugkeren naar kamertemperatuur voordat u deze voorzichtig spoelt in PBS-T (PBS met Tween-20, pH 7,2) 3 keer gedurende 5 minuten elk, en spoel de dia's vervolgens 3 keer in PBS gedurende 1 minuut elk.
  5. Blokkeer de dia's met 1% runderserumalbumine (BSA) in PBS gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur.
  6. Incubeer de dia's met primair antilichaam (anti-FKBP12 om 1:1000) 's nachts bij 4 °C of bij kamertemperatuur gedurende 4 uur.
  7. Was de dia's in PBS-T 4 keer gedurende 5 minuten elk.
  8. Breng de dia's met HRP-gelabeld polymeer geconjugeerd met secundaire antilichamen (anti-Konijn, 1:5.000) gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur aan. Doe dit in het donker om te voorkomen dat foto's bleken.
  9. Was de dia's in PBS-T 3 keer gedurende 5 minuten elk.
  10. Incubeer de dia's met 5% 3,3'-diaminobenzidine-tetrahydrochloride (DAB) gedurende 2-10 minuten totdat de kleur van reactieproducten geschikt is onder microscoop.
  11. Houd de glaasjes 30 s in hematoxyline en was de glaasjes 2 keer gedurende 5 minuten in gedestilleerd water.
  12. Droog de glaasjes uit in 50% ethanol, 70% ethanol, 90% ethanol, 95% ethanol en 100% ethanol gedurende elk 1 minuut.
  13. Verwijder de dia's in 100% xyleen I, 100% xyleen II en 100% xyleen III gedurende elk 5 minuten.
  14. Monteer de glaasjes in neutrale balsem volgens de instructies van de fabrikant.

7. In-situ hybridisatie

OPMERKING: Drosophila embryo secties werden bereid met 0,01% diethyl pyrocarbonaat (DEPC) behandeld water. Alle accessoires die worden gebruikt voor in situ hybridisatie passen DEPC 's nachts behandeling vooraf toe.

  1. Riboprobe voorbereiding
    1. Lineariseer sjabloon-DNA door te knippen op een restrictie-enzymplaats stroomafwaarts van de gekloonde insert met behulp van een restrictie-enzym dat 5 'overhangen creëert. Na linearisatie zuivert u het sjabloon-DNA via fenol / chloroform-extractie en daaropvolgende ethanolprecipitatie. Gebruik standaardprotocollen.
    2. Voeg 1 μg gezuiverd sjabloon-DNA toe aan een RNase-vrije centrifugebuis. Plaats de centrifugebuis op ijs. Voeg voldoende DEPC-behandeld water toe aan het totale volume 13 μL.
      1. Voeg vervolgens de volgende reagentia toe in volgorde: 2 μL 10x NTP-etiketteringsmengsel, 2 μL 10x transcriptiebuffer, 1 μL protector RNase-remmer, 2 μL RNA Polymerase SP6 of RNA Polymerase T7.
    3. Meng de reactie door te pipetteren en centrifugeer kort. Incubeer gedurende 2 uur bij 37 °C.
      OPMERKING: Langere incubaties verhogen de opbrengst van gelabeld RNA niet. Een korte spin (~ 800 rpm) toegepast op de reactiebuis is van cruciaal belang voordat u doorgaat naar de volgende stap. Met deze spin kan alle inhoud, die uit de incubatie kan ontstaan, naar de bodem van de buis komen.
    4. Voeg 2 μL RNase-vrije DNase I toe om sjabloon-DNA te verwijderen en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C.
    5. Voeg 2 μL van 200 mM EDTA (pH 8,0) toe om de reactie te stoppen.
      OPMERKING: DIG-gelabelde RNA-sondes kunnen gedurende één jaar bij -15 tot -25 °C in ethanol worden bewaard.
  2. Pre-hybridisatie van drosophila embryo sectie
    1. Plaats delen van het Drosophila-embryo gedurende 48 uur in een oven van 42 °C.
    2. Deparaffiniseer de glaasjes tweemaal in 100% xyleen gedurende 10 minuten.
    3. Hydrateer de glaasjes door ze gedurende 5 minuten achtereenvolgens onder te dompelen in 100% ethanol, 95% ethanol, 90% ethanol, 70% ethanol en 50% ethanol.
    4. Incubeer de dia's in PBS gedurende 5 min 3 keer om de fixatieve oplossing / Bouin's oplossing uit het weefsel te verwijderen.
    5. Was de glaasjes met 100 mmol/L glycine/PBS-oplossing 2 keer gedurende 5 minuten elk.
    6. Was de dia's met PBS 2 keer gedurende 5 minuten elk.
    7. Incubeer de dia's met 0,3% Triton X-100 in PBS gedurende 15 minuten om de membranen te permeabiliseren.
    8. Was de dia's met PBS 3 keer gedurende 5 minuten elk.
    9. Incubeer de glaasjes in 15 μg/ml RNase-vrij proteïnase K gedurende 30 minuten bij 37 °C.
    10. Incubeer de glaasjes met 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 3 minuten om de spijsvertering te stoppen.
    11. Was de dia's met PBS 2 keer gedurende 5 minuten elk.
    12. Incubeer de dia's in 100 mM triethanolamine buffer (pH 8,0) met 0,25% (v/v) azijnzuuranhydride 2 keer gedurende 5 minuten elk.
    13. Voeg DEPC-water toe aan de vochtkamer van de dia. Voeg 20 μL pre-hybridisatieoplossing (met 100 μg/ml zalmsperma-DNA) toe aan de dia's. Plaats de dia's in de schuifvochtkamer. Incubeer de glijbanen bij 42 °C gedurende 4 uur.
      OPMERKING: Het is noodzakelijk om de dichtheid van het deksel van de natte doos te waarborgen en dat de natte doos altijd horizontaal wordt gehouden om vervluchtiging en afwijking van het weefsel van de pre-hybridisatieoplossing en de gevolgde hybridisatieoplossing te voorkomen.
  3. Hybridisatie van drosophila embryo sectie
    1. Verwijder de pre-hybridisatieoplossing en was de dia's met 0,2x SSC (150 mM natriumchloride, 15 mM natriumcitraat, pH 7,0) 3 keer gedurende 5 minuten elk. Veeg overtollige 0,2x SSC rond de weefselmonsters af.
    2. Breng 30 μL sondehybridisatieoplossing (met 2-6 ng digoxine-gelabelde RNA-sonde door verdunning in pre-hybridisatieoplossing) aan met een pipet. Incubeer de glaasjes in de schuifvochtkamer bij 42 °C gedurende ongeveer 20 uur.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de dop strak is als de suggestie van de laatste noot. Anders zal de opdroging veroorzaakt door het lekken van pre-hybridisatie of pre-hybridisatie vuile achtergrond genereren, inclusief pseudo-positieve in dia's.
  4. Kruising
    1. Verwijder de hybridisatieoplossing en was de glaasjes met 4x SSC-oplossing 4 keer gedurende 15 minuten elk bij 37 °C.
    2. Was de glaasjes in 2x SSC-oplossing met 20 μg/ml RNase A gedurende 30 minuten bij 37 °C.
    3. Was de glaasjes gedurende 15 min in 1x SSC-oplossing op 37 °C.
    4. Was de glaasjes gedurende 15 minuten in 0,5x SSC-oplossing op 37 °C.
    5. Was de glaasjes gedurende 15 minuten in 0,1x SSC-oplossing op 37 °C.
    6. Was de dia's met PBS 3 keer gedurende 5 minuten elk.
    7. Was de glaasjes in wasbuffer (100 mM maleïnezuur, 150 mM NaCl, 0,3% (v/v) Tween 20, pH 7,5) gedurende 1 min.
    8. Incubeer de glaasjes in 100 ml vers bereide blokkerende oplossing (2% schapenserum in maleïnezuurbuffer zonder Tween 20) gedurende 30 minuten.
    9. Incubeer de dia's in 20 ml antilichaamoplossing gedurende 45 minuten.
      1. Centrifugeer het antilichaam gedurende 5 minuten bij 10.000 tpm in de oorspronkelijke injectieflacon vóór elk gebruik en pipetteer de benodigde hoeveelheid zorgvuldig van het oppervlak. Verdun anti-digoxigenine-AP 1:5000 (150 mU/ml) in blokkerende oplossing.
    10. Was de glaasjes in 100 ml wasbuffer 2 keer gedurende 15 minuten elk om ongebonden antilichaamconjugaat te verwijderen.
    11. Breng de dia's in evenwicht in 20 ml detectiebuffer (100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 9,5) gedurende 2-5 minuten.
    12. Incubeer de dia's met 10 ml vers bereide kleursubstraatoplossing in de diavochtkamer. De reactie begint binnen enkele minuten en is na 16 uur voltooid. Niet schudden of mengen terwijl de kleur zich ontwikkelt.
    13. Was de glaasjes gedurende 5 minuten met 50 ml gedestilleerd water om de reactie te stoppen.
    14. Droog het monster een nacht in het donker.
    15. Droog de glaasjes uit in 70% ethanol, 80% ethanol, 90% ethanol, 95% ethanol, 100% ethanol I en 100% ethanol II gedurende elk 3 minuten.
    16. Verwijder de dia's in 100% xyleen I, 100% xyleen II en 100% xyleen III gedurende elk 20 minuten.
    17. Monteer de glijbanen met neutrale balsem.
    18. Documenteer afbeeldingen en analyseer met de omgekeerde microscopie en fabrikantsoftware. Voer distributieanalyse uit met ImageJ op basis van de dichtheid van het positieve signaal langs de lengteas of binnen de differentiële zone van embryo's.
      OPMERKING: Tijdens de incubatie met de vers bereide kleursubstraatoplossing in stap 7.4.12 kan de reactiekleur zelfs met een met het blote oog worden gezien. Deze observatie over hoe kleurontwikkeling kan worden geïnspecteerd onder stereoscoop. Zodra de reactiekleur redelijk is en de stap 7.4.13 kan worden uitgevoerd om de reactie te stoppen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De cijfers beschrijven protocollen die worden gebruikt om de uitdaging van het bevestigen van hoge lipide- en chitinebevattende chorion Drosophila-embryo's (tabel 1) aan het glasplaatoppervlak te overwinnen voor onderzoek en experimenten. Met behulp van de chroomalum gelatine slide-coating methode getoond in figuur 1, hebben we de hechting van Drosophila embryo's op het oppervlak van dia's verbeterd, terwijl de embryo pre-embedding methode getoond in

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RyRs en IP3Rs gemedieerde calciumsignalering is een fundamentele route in veel fysiologische en pathologische processen van zowel gewervelde als ongewervelde dieren1,2,3,4. Bij mensen leiden puntmutaties, zoals CPVT-geassocieerde R4496C-mutatie, in het RyR2-gen tot calciumlekkage uit het sarcoplasmatisch reticulum van cardiomyocyten, wat resulteert in cardiale disfunctie. Deze mutaties presente...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (#31771377 / 31571273/31371256), het Foreign Distinguished Scientist Program van het National Department of Education (#MS2014SXSF038), het National Department of Education Central Universities Research Fund (#GK201301001/201701005/GERP-17-45) en XZ wordt ondersteund door Outstanding Doctoral Thesis Fund (#2019TS082 /2019TS079), Key Program of Shaanxi Provincial Education Department (#20JS138), het Natural Science Basic Research Program Youth Project van Shaanxi Provincial Science and Technology Department (#2020JQ-885).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
-20°C KoelkastMeiling Biology &MedicalDW-YL270Geschikt voor reagensopslag
-80°C Ultra lage temperatuur koelkastThermoForma 90 SeriesGeschikt voor reagensopslag
AgarSigma-AldrichWXBB6360VBereiding van druivensap-agar platen
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragmentenRoche11093274910Voor de detectie van digoxigenine-gelabelde verbinding
Biochemische incubatorShanghai Bluepard InstrumentsLRH-250In-situ Hybridisatie
Bouin's oplossingSinopharm Chemical Reagent at Beijing69945460Drosophila Embryo Inbedding
CentrifugeEppendorf540BH07808In-situ Hybridisatie
CentrifugebuisDenvilleC-2170Drosophila Embryo Verzameling
Chrome AlumSinopharm Chemical Reagent at Beijing10001018Bekleden van dia's
Constant temperatuur waterbadJintan Henfeng InstrumentsKW-1000DCHematoxyline-Eosine Kleuring, Immunohistochemie, In-situ Hybridisatie en Periodieke Zuur-Zilver Methenamine Kleuring
Dako REAL EnVision DetectiesysteemDakoK5007In immunohistochemische reactie of in situ hybridisatiereactie, het bindt aan het primaire antigeenantilichaam, en het doelwit wordt gelabeld door kleuring.
DEPCSigma-AldrichD5758In-situ Hybridisatie
DIG RNA Labelling KitRoche11093274910RNA labelen met diagoxigenine-UTP door in vitro transcriptie met SP6 en T7 RNA polymerase
Drosophila melanogasterBloomington Stock CenterBDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664De voorraden van Drosophila melanogaster mutant
Elektrisch blaasdrogenkastTianjin Taiste Instruments101-0ABVoor het bekleden van dia's en paraffine-inbedding
EosineSigma-Aldrich230251Hematoxyline-Eosine Kleuring
EthanolSinopharm Chemical Reagent at Beijing100092680Paraffine Inbedding, Hematoxyline-Eosine Kleuring, Immunohistochemie, In-situ Hybridisatie en Periodieke Zuur-Zilver Methenamine Kleuring
GelatineSinopharm Chemical Reagent at Beijing10010328Bekleden van dia's
GoudchlorideSigma-Aldrich379948Periodieke Zuur-Zilver Methenamine Kleuring
HematoxylineSigma-AldrichH3136Hematoxyline-Eosine Kleuring
High Pure PCR Product Purification KitRoche11732668001Voor zuivering van PCR-producten
Intelligente constant temperatuur en vochtigheidskastNingbo Jiangnan InstrumentsHWSVoor vliegenonderhoud
LE AgaroseHyAgarose14190108029Voor-inbedding
MethanolSinopharm Chemical Reagent at Beijing10014108Drosophila Embryo Verzameling
MicroscoopZEISSObserver.A1Hematoxyline-Eosine Kleuring, Immunohistochemie, In-situ Hybridisatie en Periodieke Zuur-Zilver Methenamine Kleuring
Microscoop dia'sMeVid Labware ManufacturingP105-2001Bekleden van dia's
Neutrale GumSinopharm Chemical Reagent at Beijing10004160Hematoxyline-Eosine Kleuring
N-heptaanSinopharm Chemical Reagent at Beijing40026768Drosophila Embryo Verzameling
Paraffine snijderHuahai science instrumentHH-2508IIIIn-situ Hybridisatie
ParaffineSinopharm Chemical Reagent at Beijing69019461Paraffine Inbedding
pH/mV MeterSartoriusPB-10Voor het bepalen van de pH-waarde van een oplossing
ZilvernitraatSinopharm Chemical Reagent at Beijing10018461Periodieke Zuur-Zilver Methenamine Kleuring
Ultrapuur watermeterThermoAFXI-0501-PIn-situ Hybridisatie
XyleenSinopharm Chemical Reagent at Beijing10023418Paraffine Inbedding

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weisleder, N., Ma, J. Altered Ca2+ sparks in aging skeletal and cardiac muscle. Ageing Research Reviews. 7 (3), 177-188 (2008).
  2. Cheng, H., Lederer, W. J. Calcium Sparks. Physiological Reviews. 88 (4), 1491-1545 (2008).
  3. Fan, J., et al. Ryanodine Receptors: Functional Structure and Their Regulatory Factors. Chinese Journal of Cell Biology. 37 (1), 6-15 (2015).
  4. Xu, X., Balk, S. P., Isaacs, W., Ma, J. Calcium signaling: an underlying link between cardiac disease and carcinogenesis. Cell & Bioscience. 8 (39), 1-2 (2018).
  5. Xu, X., Bhat, M. B., Nishi, M., Takeshima, H., Ma, J. Molecular cloning of cDNA encoding a Drosophila ryanodine receptor and functional studies of the carboxyl-terminal calcium Release Channel. Biophysical Journal. 78 (3), 1270-1281 (2000).
  6. George, G. K., et al. Comparative analysis of FKBP family protein: evaluation, structure, and function in mammals and Drosophila melanogaster. BMC Developmental Biology. 18 (1), 1-12 (2018).
  7. Zhou, X., et al. Syncytium calcium signaling and macrophage function in the heart. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).
  8. Wang, L., et al. Calcium and CaSR/IP3R in prostate cancer development. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-7 (2018).
  9. Xu, M., Seas, A., Kiyani, M., Ji, K. S., Bell, H. N. A temporal examination of calcium signaling in cancer- from tumorigenesis, to immune evasion, and metastasis. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).
  10. Shou, W., et al. Cardiac defects and altered ryanodine receptor function in mice lacking FKBP12. Nature. 391 (6666), 489-492 (1998).
  11. Xin, H., et al. Oestrogen protects FKBP12.6 null mice from cardiac hypertrophy. Nature. 416 (6878), 334-337 (2002).
  12. Zalk, R., et al. Structure of a mammalian ryanodine receptor. Nature. 517 (7532), 44-49 (2015).
  13. Ridgway, E. B., Gilkey, J. C., Jaffe, L. F. Free calcium increases explosively in activating medaka eggs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (2), 623-627 (1977).
  14. Gilkey, J. C., Jaffe, L. F., Ridgway, E. B., Reynolds, G. T. A free calcium wave traverses the activating egg of the medaka, Oryzias latipes. Journal of Cell Biology. 76 (2), 448-466 (1978).
  15. Kreko-Pierce, T., Azpurua, J., Mahoney, R. E., Eaton, B. A. Extension of health span and life span in Drosophila by S107 requires the calstabin homologue FK506-BP2. Journal of Biological Chemistry. 291 (50), 26045-26055 (2016).
  16. Sullivan, K. M., Scott, K., Zuker, C. S., Rubin, G. M. The ryanodine receptor is essential for larval development in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 5942-5947 (2000).
  17. Feng, R., et al. Dynamics expression of DmFKBP12/Calstabin during embryonic early development of Drosophila melanogaster. Cell & Bioscience. 9 (1), 1-16 (2019).
  18. Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , Springer. 633-645 (1958).
  19. Xu, X., Dong, C., Vogel, B. Hemicentins Assemble on Diverse Epithelia in the Mouse. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (2), 119-126 (2007).
  20. Wehrens, X. H., et al. FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell. 113 (7), 829-840 (2003).
  21. Wehrens, X. H., et al. Protection from cardiac arrhythmia through ryanodine receptor-stabilizing protein calstabin2. Science. 304 (5668), 292-296 (2004).
  22. Bellinger, A. M., et al. Remodeling of ryanodine receptor complex causes "leaky" channels: a molecular mechanism for decreased exercise capacity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (6), 2198-2202 (2008).
  23. Maruyama, M., et al. FKBP12 is a critical regulator of the heart rhythm and the cardiac voltage-gated sodium current in mice. Circulation Research. 108 (9), 1042-1052 (2011).
  24. Xu, X., et al. FKBP12 is the only FK506 binding protein mediating T-cell inhibition by the immunosuppressant FK506. Transplantation. 73 (11), 1835-1838 (2002).
  25. Zalk, R., Marks, A. R. Ca2+ release channels join the 'resolution revolution'. Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 543-555 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

In situ hybridisatiehistochemiecoating van objectglazeninbedding van embryo seiwitdistributieRNA expressielokalisatie van FKBP12calciumsignalering

Gerelateerde artikelen