Dit artikel geeft een gedetailleerde beschrijving van hoe een diermodel van de anhepatische fase (leverischemie) bij ratten kan worden gebouwd om fundamenteel onderzoek naar ischemie-reperfusieletsel na levertransplantatie te vergemakkelijken.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Orgaan Ischemia-Reperfusie Letsel door het simuleren van hemodynamische veranderingen in rat levertransplantatie model
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Orthotopische levertransplantatie (OLT) bij ratten is een beproefd diermodel dat wordt gebruikt voor preoperatieve, intraoperatieve en postoperatieve studies, waaronder ischemie-reperfusieletsel (IRI) van extrahepatische organen. Dit model vereist tal van experimenten en apparaten. De duur van de anhepatische fase hangt nauw samen met de tijd om IRI te ontwikkelen na transplantatie. In dit experiment gebruikten we hemodynamische veranderingen om extrahepatische orgaanschade bij ratten op te wekken en bepaalden we de maximale tolerantietijd. De tijd tot de ernstigste orgaanverwonding varieerde voor verschillende organen. Deze methode kan gemakkelijk worden gerepliceerd en kan ook worden gebruikt om IRI van de extrahepatische organen na levertransplantatie te bestuderen.
Inleiding
Ischemia-reperfusion injury (IRI) is een veel voorkomende complicatie na levertransplantatie. Lever IRI is een pathologisch proces waarbij ischemiegemedieerde celschade en abnormale verslechtering van leverreperfusie. Lever IRI en de lokale aangeboren immuunrespons kunnen worden onderverdeeld in warme en koude IRI, volgens verschillen in de klinische omgeving1. Hete IRI wordt veroorzaakt door stamcelletsel, meestal als gevolg van levertransplantatie, shock en trauma2. Cold IRI is een complicatie van levertransplantatie veroorzaakt door endotheelcellen en periferecirculatie 3. Klinische rapporten hebben aangetoond dat lever-IRI geassocieerd is met 10% van vroege orgaanfalen en de incidentie van acute en chronische afstoting kan verhogen4,5. Bovendien kan lever IRI ook meerdere orgaandisfunctiesyndromen of systemisch ontstekingsreactiesyndroom induceren, met een hogemortaliteit 6. Patiënten met extrahepatische orgaanbetrokkenheid blijven meestal langer in het ziekenhuis, geven meer geld uit en hebben een slechtereprognose 7. De ontwikkeling van complicaties hangt nauw samen met de lengte van de anhepatische fase van levertransplantatie8.
Orthotopische levertransplantatie (OLT) bij ratten werd voor het eerst gemeld door de Amerikaanse professor Lee in 1973. De experimentele operatie simuleerde de stappen van klinische levertransplantatie en de anastomose van bloedvaten en het gemeenschappelijke galkanaal (CBD) met behulp van de hechtmethode. De procedure is moeilijk en tijdrovend met een laag slagingspercentage9. In 1979 hebben Kamada et al. een aanzienlijke verbetering aangebracht ten opzichte van OLT bij ratten door creatief gebruik te maken van de 'two-cuff methode' voor anastomose van de poortader om de anhepatische fase binnen 26 minuten te beheersen10. In hetzelfde jaar stelde Zimmermann de 'single biliary stent method' voor. Op basis van Lee's werk gebruikte Zimmermann polyethyleen buizen om de CBD van de donor en ontvanger direct te anastomoseren, de reconstructie van CBD te vereenvoudigen en de functie van de sluitspier te behouden, en deze methode werd de standaard voor galreconstructie van OLT-modellen11. In 1980 stelden Miyata et al. de 'driemanchetmethode' voor waarbij de portaalader (PV), suprahepatische vena cava (SVC) en intrahepatische vena cava (IVC) werden anastomosed door de manchetmethode. Er is echter een risico op vervorming van de canule met deze methode, wat kan leiden tot de obstructie van inferieure vena cava reflux12. In 1983 werd de "tweemanchetmethode" voorgesteld met behulp van de manchetmethode voor anastomose van de PV en IVC, maar met de hechtmethode voor de SVC13. Deze methode werd door wetenschappers wereldwijd toegepast om OLT-modellen op te zetten. Sindsdien zijn de cuff anastomosestappen verbeterd om de anhepatische fase te verkorten en de overlevingskans van de ratten te verbeteren14. Op dezelfde manier worden in de klinische praktijk verbeterde methoden gebruikt om de anhepatische fase15te verkorten . Fundamenteel onderzoek naar IRI na levertransplantatie heeft echter aangetoond dat de overlevingskans omgekeerd gerelateerd is aan de mate van letsel aan extrahepatische organen. Daarom is verder onderzoek vereist en is een eenvoudig en reproduceerbaar diermodel nodig om IRI na levertransplantatie te simuleren.
Op basis van de definitie van de anhepatische fase simuleerden we de hemodynamische veranderingen in levertransplantatie resulterend in IRI van extrahepatische organen bij ratten. Hierin geven we een gedetailleerde beschrijving van hoe een diermodel van de anhepatische fase (leverischemie) bij ratten kan worden gebouwd om fundamenteel onderzoek naar IRI na levertransplantatie te vergemakkelijken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De Animal Ethics Committee keurde het experiment van Guangxi Medical University (No20190920) goed. Alle dieren werden geleverd door het Animal Experiment Center van guangxi Medical University. We gebruikten SPF mannelijke Sprague Dawley ratten (200-250 g, 10-12 weken), gehouden onder de kamertemperatuur van 25 ± 2°C en vochtigheid van 50 ± 10%. De voeding werd 24 uur voor de operatie gestopt; er werd echter water verstrekt.
OPMERKING: Eén operator kan alle operaties uitvoeren zonder microchirurgiebasis of chirurgische microscoop.
1. Werking
- Verdoof de ratten na het wegen met isofluraan (5%) met behulp van een dierenanesthesiemachine.
- Na 1-2 minuten klemt u de tenen van de rat voorzichtig vast met een pincet. Als de rat niet reageert na het knijpen, is hij in een staat van anesthesie terechtgekomen. Gebruik dierenartszalf op de ogen om droogheid te voorkomen. Gebruik dierenverwarmingslampen om de lichaamstemperatuur van de ratten op 37-38 °C te houden.
- Na abdominale desinfectie (povidone jodiumoplossing) bevestigt u de rat op de dissectietafel van het dier. Maak een mediane incisie van 3 cm onder het xiphoid-proces met behulp van een tang en een schaar.
- Open de buikholte, stel de lever bloot met behulp van een oprolmechanisme en mobiliseer het hepatogastric ligament. Gebruik wattenstaafjes om de middelste kwab van de lever voorzichtig om te draaien en draai deze naar boven om de porta hepatis bloot te leggen. Identificeer de CBD, PV en HA.
- Duw de dunne darm naar de linker onderbuikholte met wattenstaafjes, bedek deze met nat gaas en verplaats de intrahepatische vena cava naar de rechter nierader.
- Isoleer de poortader, de leverslagader en de inferieure vena cava boven de rechter nierader met een intraoculaire lens en tang gemarkeerd met 3-0 zijden draad, elk met een slipknoop.
- Snijd de linker- en rechter onderste extremiteitshuid open en stel de femurader bloot met behulp van een oogheelkundige tang. Injecteer langzaam heparine met een laag molecuulgewicht 625 IE/kg door de femurader om het hele lichaam te hepariniseren.
- Ligate de poortader, leverslagader en inferieure vena cava boven de rechter nierader met nr. 3-0 hechtingen, die 45 minuten duren (figuur 1). Vervang de dunne darm in de buikholte en bedek deze met gaas. Verminder inhalatie-anesthesie tijdens deze periodes.
- Laat na 45 minuten de poortader, de leverslagader en de inferieure vena cava boven de rechter nierader los.
- Hecht de spier en huid laag voor laag en beëindig de inhalatie-anesthesie. Zorg voor postoperatieve analgesie met subcutane morfine van 5 mg/kg om de 4 uur.
- Observeer de rat tot hij wakker is en voer onder een temperatuur van 25 ± 2 °C en een luchtvochtigheid van 50 ± 10%. Dierlijke verwarmingslampen zijn noodzakelijk.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Rattentolerantie voor leverischemie
In dit diermodel zijn de locaties waar de bloedvaten tijdens het gebruik lagen, weergegeven in figuur 1. De ratten werden willekeurig verdeeld in 5 groepen voor ischemie gedurende 15 minuten (I15-groep), 30 minuten (I30-groep), 45 minuten (I45-groep), 60 minuten (I60) en schijngroep, met 10 ratten in elke groep. De overlevingskans van elke groep werd 14 dagen na de operatie waargenomen. Alle ratten overleefden in de I15-groep, I30-groep...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
OLT bij ratten is een ideaal model voor het bestuderen van orgaanbehoud bij levertransplantatie, IRI, transplantatieafstoting, immuuntolerantie, transplantatiepathologie en farmacologie, homotransplantatie en xenotransplantatie. Op dit moment wordt het veel gebruikt in het experimentele onderzoek naar levertransplantatie.
Tijdens pilotstudies dienden we eerst pentobarbitale natrium intraperitoneale anesthesie toe en ontdekten dat dit leidde tot hoge postoperatieve mortaliteit en korte tolerant...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs van dit manuscript hebben geen belangenconflicten om openbaar te maken.
Dankbetuigingen
We willen graag de nuttige suggesties van Dr. Wen-tao Li en Dr. Ji-hua Wu van het Tweede Aangesloten Ziekenhuis van Guangxi Medical University erkennen. De auteurs willen onze teamgenoten bedanken voor nuttige opmerkingen en discussies. De auteurs willen ook de anonieme recensenten en redacteuren van JoVE bedanken voor hun opmerkingen. Speciale dank gaat uit naar dr. Yuan's ouders voor hun voortdurende steun en aanmoediging. Het werk werd ondersteund door Ningbo Natural Science Foundation (2014A610248).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 4% paraformaldehyde-oplossing | Shanghai Macklin Biochemical Co.,Ltd | P804536 | |
| luchtdroger | Shanghai Binglin Electronic Technology Co., Ltd. | BPG | |
| Alanine aminotransferase (ALT)Kit | Elabscience Biotechnology Co.,Ltd | E-BC-K235-S | |
| ammoniak | Sinopharm Chemical Reagents Co. Ltd | 10002118 | |
| amylase Kit | Elabscience Biotechnology Co.,Ltd | E-BC-K005-M | |
| watervrij ethanol | Sinopharm Chemical Reagents Co. Ltd | 100092183 | |
| Dierdier anesthesiemachine | Shenzhen Ruiwode Life Technology Co. Ltd | R640 | |
| aspartaataminotransferase (AST)kit | Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd. | S03040 | |
| automatische biochemische analyzer. | SIEMENS AG FWB:SIE, NYSE:SI Co., Ltd. | 2400 | |
| Biosystemen (wanneer noodzakelijk) | Chengdu Taimeng Electronics Co., Ltd. | BL-420F | |
| Centrifuge | Baiyang Medical Instrument Co., Ltd. | BY-600A | |
| dekglas | Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co. Ltd | 10212432C | |
| creatinine Kit | Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd. | S03076 | |
| ontwateringsmachine | Hungary 3DHISTECH Co.,Ltd | Donatello Series 2 | |
| inbeddingsmachine | Hubei Xiaogan Kuohai Medical Technology Co., Ltd. | KH-BL1 | |
| diepvriesmachine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
| hematoxyline-eosine kleuroplossing | Wuhan Saiwell Biotechnology Co., Ltd | G1005 | |
| hoogwaardige paraffinewas | Shanghai huayong paraffin wax co., Ltd | Q/YSQN40-91 | |
| zoutezuur | Sinopharm Chemical Reagents Co. Ltd | 10011018 | |
| intraoculaire lens (IOL)tang | Guangzhou Guangmei Medical Equipment Co., Ltd. | JTZRN | |
| Isofluran | Shenzhen Ruiwode Life Technology Co. Ltd | — | |
| microschaar (wanneer noodzakelijk) | Shanghai Surgical Instrument Factory | WA1010 | |
| naaldhouders | Shanghai Surgical Instrument Factory | J32010 | |
| neutrale gom | Shanghai Huashen Healing Equipment Co.,Ltd. | — | |
| normaal optisch microscoop | Nikon Instrument Shanghai Co., Ltd | Nikon Eclipse CI | |
| oftalmische tang | Shanghai Surgical Instrument Factory | J3CO30 | recht |
| oftalmische tang | Shanghai Surgical Instrument Factory | JD1060 | buigen |
| oftalmische schaar | Shanghai Surgical Instrument Factory | J1E0 | |
| pathologische snijmachine | Shanghai Leica Instrument Co., Ltd | RM2016 | |
| pipetten | Dragon Laboratory Instruments Co., Ltd. | 7010101008 | |
| retractors | Beijing Jinuotai Technology Development Co.,Ltd. | JNT-KXQ | |
| scanner | Hungary 3DHISTECH Co.,Ltd | Pannoramic 250 | |
| diapositiva | Wuhan Saiwell Biotechnology Co., Ltd | G6004 | |
| xyleen | Sinopharm Chemical Reagents Co. Ltd | 1330-20-7 |
Referenties
- Dar, W. A., Sullivan, E., Byon, J. S., Eltzschig, H., Ju, C. Ischaemia reperfusion injury in liver transplantation: Cellular and molecular mechanisms. Liver International. 39 (5), 788-801 (2019).
- Qiao, P. F., Yao, L., Zhang, X. C., Li, G. D., Wu, D. Q. Heat shock pretreatment improves stem cell repair following ischemia-reperfusion injury via autophagy. World Journal of Gastroenterology. 21 (45), 12822-12834 (2015).
- Liu, Y., et al. Activation of YAP attenuates hepatic damage and fibrosis in liver ischemia-reperfusion injury. Journal of Hepatology. 71 (4), 719-730 (2019).
- Hirao, H., Dery, K. J., Kageyama, S., Nakamura, K., Kupiec-Weglinski, J. W. Heme Oxygenase-1 in liver transplant ischemia-reperfusion injury: From bench-to-bedside. Free Radical Biology and Medicine. 157, 75-82 (2020).
- Motiño, O., et al. Protective role of hepatocyte cyclooxygenase-2 expression against liver ischemia-reperfusion injury in mice. Hepatology. 70 (2), 650-665 (2019).
- Guo, W. A. The search for a magic bullet to fight multiple organ failure secondary to ischemia/reperfusion injury and abdominal compartment syndrome. Journal of Surgical Research. 184 (2), 792-793 (2013).
- Elham, M., Mahmoudi, M., Nassiri-Toosi, M., Baghfalaki, T., Zeraati, H. Post liver transplantation survival and related prognostic factors among adult recipients in tehran liver transplant center; 2002-2019. Archives of Iranian Medicine. 1 (23), 326-334 (2020).
- Kim, E. H., Ko, J. S., Gwak, M. S., Lee, S. K., Kim, G. S. Incidence and clinical significance of hyperfibrinolysis during living donor liver transplantation. Blood Coagulation and Fibrinolysis. 29 (3), 322-326 (2018).
- Czigány, Z. Improving research practice in rat orthotopic and partial orthotopic liver transplantation: a review, recommendation, and publication guide. European Surgical Research. 55 (1-2), 119-138 (2015).
- Kamada, N., Calne, R. Y. Orthotopic liver transplantation in the rat. Technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage. Transplantation. 28 (1), 47-50 (1979).
- Zimmermann, F. A., et al. Techniques for orthotopic liver transplantation in the rat and some studies of the immunologic responses to fully allogeneic liver grafts. Transplantation Proceedings. 11 (1), 571-577 (1979).
- Miyata, M., Fischer, J. H., Fuhs, M., Isselhard, W., Kasai, Y. A simple method for orthotopic liver transplantation in the rat. Cuff technique for three vascular anastomoses. Transplantation. 30 (5), 335-338 (1980).
- Kamada, N. A., Calne, R. Y. Surgical experience with five hundred thirty liver transplants in the rat. Surgery. 93 (1), 64-69 (1983).
- Yang, L. F., et al. A rat model of orthotopic liver transplantation using a novel magnetic anastomosis technique for suprahepatic vena cava reconstruction. Journal of Visualized Experiments. 19 (133), e56933(2018).
- Liu, L. X., He, C., Huang, T., Gu, J. Development of a new technique for reconstruction of hepatic artery during liver transplantation in sprague-dawley rat. PLoS One. 10 (12), 0145662(2015).
- Paller, M. S., Hoidal, J. R., Ferris, T. F. Oxygen free radicals in ischemic acute renal failure In the rat. Journal of Clinical Investigation. 74 (4), 1156-1164 (1984).
- Schmidt, J., Lewandrowsi, K., Warshaw, A. L., Compton, C. C., Rattner, D. W. Morphometric characteristics and homogeneity of a new model of acute pancreatitis in the rat. International Journal of Pancreatology. 12 (1), 41-51 (1992).
- Chui, C. J., McArdle, A. H., Brown, R., Scott, H. J., Gurd, F. N. Intestinal mucosal lesion in low-flow states. I. A morphological, hemodynamic, and metabolic reappraisal. Archives of Surgery. 101 (4), 478-483 (1970).
- Kozian, A., et al. One-lung ventilation induces hyperfusion and alveolar damage in the ventilated lung:an experimental study. British Journal of Anaesthesia. 100 (4), 549-559 (2008).
- Shimada, S., et al. Heavy water (D2O) containing preservation solution reduces hepatic cold preservation and reperfusion injury in an isolated perfused rat liver (IPRL) model. Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1818(2019).
- Nakamura, K. Sirtuin 1 attenuates inflammation and hepatocellular damage in liver transplant ischemia/reperfusion: from mouse to human. Liver Transplantation. 23 (10), 1282-1293 (2017).
- Blaire, A., et al. Surgical Considerations of Hilar Cholangiocarcinoma. Surgical Oncology Clinics of North America. 28 (4), 601-617 (2019).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
