Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Patiënt-afgeleide tumor explanteert als een "live" preklinisch platform voor het voorspellen van medicijnresistentie bij patiënten

5.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62130

⸱

7 februari 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Leicester Cancer Research Center, University of Leicester, 2MRC Toxicology Unit

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel beschrijft methoden voor het genereren, behandelen en analyseren van patiënt-afgeleide explantaten voor het beoordelen van tumorgeneesmiddelresponsen in een levend, patiëntrelevant, preklinisch modelsysteem.

Samenvatting

Een goed begrip van medicijnresistentie en de ontwikkeling van nieuwe strategieën om zeer resistente kankers te sensibiliseren, is afhankelijk van de beschikbaarheid van geschikte preklinische modellen die de reacties van patiënten nauwkeurig kunnen voorspellen. Een van de nadelen van bestaande preklinische modellen is het onvermogen om de menselijke tumormicro-omgeving (TME) contextueel te behouden en de intratumorale heterogeniteit nauwkeurig weer te geven, waardoor de klinische vertaling van gegevens wordt beperkt. Door daarentegen de cultuur van levende fragmenten van menselijke tumoren weer te geven, maakt het patient-derived explant (PDE) -platform het mogelijk om medicijnresponsen te onderzoeken in een driedimensionale (3D) context die de pathologische en architecturale kenmerken van de oorspronkelijke tumoren zo goed mogelijk weerspiegelt. Eerdere rapporten met PDE's hebben het vermogen van het platform gedocumenteerd om chemosensitief van chemoresistante tumoren te onderscheiden, en het is aangetoond dat deze segregatie voorspellend is voor de reacties van patiënten op dezelfde chemotherapieën. Tegelijkertijd bieden PDE's de mogelijkheid om moleculaire, genetische en histologische kenmerken van tumoren te ondervragen die medicijnresponsen voorspellen, waardoor biomarkers voor patiëntstratificatie worden geïdentificeerd, evenals nieuwe interventionele benaderingen om resistente tumoren te sensibiliseren. Dit artikel rapporteert de PDE-methodologie in detail, van het verzamelen van patiëntmonsters tot eindpuntanalyse. Het biedt een gedetailleerde beschrijving van explantatie-afleidings- en kweekmethoden, waarbij op maat gemaakte voorwaarden voor bepaalde tumoren, waar van toepassing, worden benadrukt. Voor eindpuntanalyse is er een focus op multiplexed immunofluorescentie en multispectrale beeldvorming voor de ruimtelijke profilering van belangrijke biomarkers binnen zowel tumorale als stromale regio's. Door deze methoden te combineren, is het mogelijk om kwantitatieve en kwalitatieve geneesmiddelresponsgegevens te genereren die kunnen worden gerelateerd aan verschillende clinicopathologische parameters en dus mogelijk kunnen worden gebruikt voor biomarkeridentificatie.

Inleiding

De ontwikkeling van effectieve en veilige middelen tegen kanker vereist geschikte preklinische modellen die ook inzicht kunnen geven in werkingsmechanismen die de identificatie van voorspellende en farmacodynamische biomarkers kunnen vergemakkelijken. Inter- en intratumor heterogeniteit1,2,3,4,5 en de TME6,7,8,9,10,11,12 zijn bekend om de antikankergeneesmiddelresponsen te beïnvloeden, en veel bestaande preklinische kankermodellen zoals cellijnen, organoïden en muismodellen zijn niet in staat om deze cruciale Functies. Een "ideaal" model is er een dat de complexe ruimtelijke interacties van kwaadaardige met niet-kwaadaardige cellen in tumoren kan samenvatten en de regionale verschillen binnen tumoren kan weerspiegelen. Dit artikel richt zich op PDE's als een opkomend platform dat aan veel van deze vereisten kan voldoen13.

Het eerste voorbeeld van het gebruik van menselijke PDE's, ook bekend als histoculturen, dateert uit de late jaren 1980 toen Hoffman et al. plakjes vers gereseceerde menselijke tumoren genereerden en ze kweekten in een collageenmatrix14,15. Dit omvatte het opzetten van een 3D-kweeksysteem dat de weefselarchitectuur bewaarde en zorgde voor het onderhoud van stromale componenten en celinteracties binnen de TME. Zonder de oorspronkelijke tumor te deconstrueren, kondigden Hoffman et al.16 een nieuwe benadering van translationeel onderzoek aan, en sinds deze tijd hebben veel groepen verschillende explantmethoden geoptimaliseerd met als doel de weefselintegriteit te behouden en nauwkeurige medicijnresponsgegevens te genereren17,18,19,20,21,22,23,24 , hoewel er duidelijke verschillen tussen protocollen zijn. Butler et al. kweekten explantaten in gelatinesponzen om de diffusie van voedingsstoffen en geneesmiddelen door het monster te helpen20,21,25, terwijl Majumder et al. een tumorecosysteem creëerden door explantaten te kweken bovenop een matrix bestaande uit tumor- en stromale eiwitten in aanwezigheid van autoloog serum afgeleid van dezelfde patiënt22, 23.

Meer recent heeft onze groep een protocol opgezet waarbij explantaten worden gegenereerd door fragmentatie van tumoren in stukken van 2 - 3 mm3-grootte die vervolgens zonder extra componenten op permeabele membranen op het lucht-vloeistof grensvlak van een kweeksysteem worden geplaatst24. Alles bij elkaar hebben deze talrijke studies aangetoond dat PDE's de cultuur van intacte, levende fragmenten van menselijke tumoren mogelijk maken die de ruimtelijke architectuur en regionale heterogeniteit van de oorspronkelijke tumoren behouden. In oorspronkelijke experimenten werden explantaten of histoculturen meestal onderworpen aan homogenisatie na medicamenteuze behandeling, waarna verschillende levensvatbaarheidstests werden toegepast op de gehomogeniseerde monsters, zoals de histocultuurgeneesmiddelresponstest20,21,de MTT (3-(6)-2,5-difenyltetrazoliumbromide) test, de lactaatdehydrogenasetest of de op resazurine gebaseerde test26,27,28 . Recente vooruitgang in eindpuntanalysetechnieken, met name digitale pathologie, heeft nu het repertoire van eindpunttests en assays uitgebreid die kunnen worden uitgevoerd op explants29,30. Om deze nieuwe technologieën toe te passen, in plaats van homogenisatie, worden explantaten gefixeerd in formaline, ingebed in paraffine (FFPE) en vervolgens geanalyseerd met behulp van immunostainingtechnieken, waardoor ruimtelijke profilering mogelijk is. Voorbeelden van deze aanpak zijn gedocumenteerd voor niet-kleincellige longkanker (NSCLC), borstkanker, colorectale kanker en mesothelioom explantaten waarbij immunohistochemische kleuring voor de proliferatiemarker Ki67 en de apoptotische marker, gekloofd poly-ADP ribose polymerase (cPARP), werd gebruikt om veranderingen in celproliferatie en celdood te volgen24,31,32,33,34.

Multiplexed immunofluorescentie is bijzonder vatbaar voor ruimtelijke profilering van geneesmiddelresponsen in explantaten op eindpunt35. Het is bijvoorbeeld mogelijk om de herlokalisatie en ruimtelijke verdeling van specifieke klassen van immuuncellen, zoals macrofagen of T-cellen, binnen de TME te meten bij medicamenteuze behandeling13,36,37,38, en te onderzoeken of een therapeutisch middel de overgang van "koude tumor" naar "hete tumor" kan bevorderen39 . In de afgelopen jaren heeft deze groep zich gericht op de afleiding van PDE's van verschillende tumortypen (NSCLC, nierkanker, borstkanker, colorectale kanker, melanoom) en het testen van een reeks antikankermiddelen, waaronder chemotherapieën, kleinmolecuulremmers en immuuncheckpointremmers (ICI's). Eindpuntanalysemethoden zijn geoptimaliseerd om multiplexed immunofluorescentie op te nemen om ruimtelijke profilering van biomarkers voor levensvatbaarheid en biomarkers voor verschillende bestanddelen van de TME mogelijk te maken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Weefselverzameling

  1. Breng na de operatie vers gereseceerde menselijke tumormonsters over in een buis met 25 ml vers kweekmedium (Dulbecco's gemodificeerde Eagle-medium aangevuld met 4,5 g / L glucose en L-glutamine + 1% (v / v) foetaal kalfsserum + 1% penicilline-streptomycine) en opgeslagen op ijs. Verwerk de explant binnen 2 uur na de operatie in een steriele klasse II kap.

2. Explant voorbereiding

  1. Reinig alle chirurgische apparatuur (grafbladen/tandwasoppervlak/pincet) met 70% industriële methyled spiritus (IMS) oplossing.
  2. Vul een kweekschaal van 10 cm (zie de tabel met materialen)met ~ 25 ml vers medium en plaats deze op een bed van ijs.
  3. Breng het monster met een pincet over op een tandwasoppervlak (zie de tabel met materialen)en snijd het weefsel in fragmenten van ongeveer 2-3 mm3 met behulp van twee huidtransplantatiebladen.
    OPMERKING: Voor de beste prestaties begint u met het snijden van het weefsel om een individuele strook van 2-3 mm dikte te verkrijgen en snijdt u de strip vervolgens over de lengte om de uiteindelijke explantaties te verkrijgen. Herhaal het proces totdat het hele monster is gehakt.
  4. Breng de explants onmiddellijk over in het ijskoude kweekmedium in de schaal van 10 cm. Neem een deel van de explantaten (6-9 stuks), plaats ze in een buis van 1 ml met 10% niet-gebufferde formaline-oplossing en laat ze 24 uur bij kamertemperatuur (RT) staan.
    OPMERKING: Deze fragmenten vertegenwoordigen de controle-explantaten voor de "niet-gekweekte" toestand.
  5. Vul het gewenste aantal putten van 6-putplaten met 1,5 ml vers medium per put en plaats een organotypische cultuurinzetschijf (zie de tabel met materialen)in elke put, zodat deze bovenop het medium drijft, waarbij zorgvuldig luchtbellen op de media-insert-interface worden vermeden.
  6. Selecteer explantaten willekeurig en plaats ze één voor één op de inzetschijf. Om consistent te zijn met de "onbeschaafde" toestand, gebruikt u 6-9 explants per put. Plaats de multiwellplaat in een CO2-incubator bij 37 °C en 5% CO2en laat de explantaten gedurende 16 uur herstellen.
    OPMERKING: Om te voorkomen dat het weefsel wordt verbrijzeld, wordt een voorzichtige behandeling van het pincet ten zeerste aanbevolen.

3. Medicamenteuze behandeling

  1. Neem na 16 uur nieuwe 6-putplaten, voeg 1,5 ml vers medium toe aan elke put, voeg de relevante medicijnen toe in de gewenste concentraties en voeg een put toe voor de voertuigcontrole. Verplaats met behulp van het pincet elke insert met de explantaten naar de nieuw bereide 6-well platen met de medicijnen. Plaats de platen in de CO2-incubator bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 24-48 uur.
  2. Breng de niet-gekweekte explantaten die eerder in formaline waren gefixeerd over in een histologiecassette (zie rubriek 4 hieronder) en bewaar in 70% IMS tot het einde van het experiment.

4. Histologische verwerking

  1. Weefselfixatie
    1. Breng na medicamenteuze behandeling de insteekschijven met de explantaten over in nieuwe 6-well platen met 10% formaline en voeg een paar druppels 10% formaline toe aan de bovenkant van de explantaten om volledige dekking met het fixatief te garanderen.
      LET OP: Formaline is gevaarlijk. Vermijd elk contact met de huid en behandel het in een rookvoer om inademing te voorkomen.
    2. Laat de explantaten een nacht (20-24 uur) in de 10% formaline blijven.
    3. Week de volgende dag het relevante aantal kleine histologiesponzen in 70% IMS en plaats ze in histologiecassettes. Breng voorzichtig alle explants van een bepaalde medicamenteuze behandelingsconditie over op een enkele spons (behoud de oriëntatie van de explants zodat de zijkanten van de explants in contact komen met de insertschijven, en dus de met drugs behandelde gebieden, in contact worden gebracht met de spons). Plaats nog een voorgekookte spons bovenop de explantaten en bevestig deze in een histologiecassette (één cassette per put/behandeling).
    4. Dompel de cassettes onder in 70% IMS en laat 24 uur bij RT staan.
  2. Paraffine inbedding en weefselsectie
    1. Breng de volgende dag de histologiecassettes met de explantaten over in de monstermand van de weefselverwerker (zie de tabel met materialen)en bevestig het deksel. Plaats het mandje in de retort en sluit voorzichtig. Selecteer het gewenste programma en start de processor. Giet de retort af, open deze om de mand te verwijderen en breng de mand over in het wasbad in het midden van de inbouw.
    2. Breng na het insluiten de metalen cassettedeksels over in de mand en keer terug naar de retort van de weefselprocessor voor het reinigingsprogramma. Veeg de sensor af met een droog doekje, verwijder overtollige was van het retortdeksel en ga verder met het reinigingsprogramma.
    3. Plaats een paraffineblok in de roterende microtoom, snijd een paar secties op 4 μm en breng het blok terug naar ijs. Verplaats het blok en snijd meer secties van 4 μm. Breng de secties met een kleine verfkwast en tang over op een waterbad om vouwen en bubbels te verwijderen.
    4. Plaats de secties centraal op microscoopglaasjes, laat de glaasjes enkele minuten leeglopen en plaats ze in een schuifrek om 's nachts te drogen in een incubator bij 37 °C. Wanneer de secties droog zijn, bewaar ze dan bij RT in een diamap of doos ter bescherming tegen stof.

5. Hematoxyline en eosine (H & E) kleuring

  1. Vul de kleurstof (zie de tabel met materialen)met reagentia en stel het vereiste programma in voor H & E-kleuring: hematoxyline-incubatietijd: 5 min; eosine incubatietijd: 3 min.
  2. Bevestig het schuifrek aan de drager, plaats het in de eerste container met xyleen en start het programma. Verwijder de schuifdrager uit het rek en breng de container met het schuifrek naar het montagegebied.
  3. Monteer de platen met dibutylftalaat xyleen (DPX) onder de afzuigkap. Plaats DPX op elke coverslip en laat de schuif op de coverslip zakken met het gedeelte naar beneden, zodat de DPX zich kan verspreiden.
    OPMERKING: DPX is gevaarlijk. Vermijd elk contact met de huid en gebruik in een aangewezen zuurkast.

6. Immunostaining

OPMERKING: De volgende stappen moeten bij RT worden uitgevoerd, tenzij anders vermeld.

  1. Deparaffinisatie en rehydratatie
    1. Plaats de dia's in een schuifrek en verwarm gedurende 10 minuten op 65 °C voordat u de secties gedurende 3 minuten (2x) in xyleen deparaffiniseert. Minimaliseer de hoeveelheid carry-over oplossing.
      OPMERKING: Xyleen is ontvlambaar, gevaarlijk en irriterend. Hanteer de zuurkast in de zuurkast terwijl u dubbellaagse handschoenen gebruikt. Vermijd huid- en oogcontact. Gooi afval weg in een verzegelde container.
    2. Rehydrateer de dia's in een alcoholgradiënt als volgt: 99% IMS gedurende 1 min (2x) en 95% IMS gedurende 1 min. Minimaliseer de hoeveelheid carry-over oplossing.
      OPMERKING: IMS is licht ontvlambaar, vluchtig en irriterend. Hanteer de zuurkast en vermijd huid- en oogcontact.
    3. Dompel het schuifrek gedurende 5 minuten volledig onder in ultrapuur (UP) water.
  2. Antigeen ophalen
    1. Bereid antigeen ophaalbuffer voor volgens de richtlijnen van de fabrikant voor het specifieke gebruikte antilichaam.
      OPMERKING: Citraatbuffer 0,2 M, pH 6 of tris(hydroxymethyl)aminomethaan (Tris)-ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) 0,1 M, pH 9, zijn de gebruikelijke buffers die worden gebruikt voor respectievelijk zure of alkalische omstandigheden. Citroenzuurmonohydraat en Tris zijn irriterende stoffen. Bereid alle voorraadoplossingen in de zuurkast. Vermijd contact met huid en ogen.
    2. Dompel het rek met de glijders onder in de antigeenophaalbuffer en magnetron (zie de tabel met materialen)op vol vermogen (800 W) gedurende 20 minuten.
      OPMERKING: Houd de dia's gedurende het hele proces volledig ondergedompeld in de buffer. Om een overmatige vermindering van het buffervolume te voorkomen, plaatst u een deksel op de gebruikte container.
  3. Multiplex immunofluorescentie (mIF)
    OPMERKING: Dit proces duurt 1-2 dagen.
    1. Vul een schone container met 250 ml UP-water en dompel het schuifrek gedurende 2 minuten (2x) volledig onder. Ga verder met het samenvoegen van elke dia in een diadekplaat (zie de tabel met materialen).
      1. Om een dia op een afdekplaat te monteren, bereidt u een glazen trog voor met water. Dompel zowel de afdekplaat onder als schuif in het water en plaats de zijde van het weefselgedeelte naar de afdekplaat.
      2. Plaats de onderrand van de dia bovenop de uitsteeksels aan de onderkant van de afdekplaat en lijn de schuif ten slotte uit op de afdekplaat, zodat het water de opening ertussen kan vullen zonder dat er lucht ingesloten zit. Houd de afdekplaat vast en schuif ze tegen elkaar en plaats ze in een afdekplaatrek.
    2. Vul de afdekplaat met fosfaatbuffered saline (PBS) en wacht tot de buffer de glaasjes is gewassen, die door de zwaartekracht naar buiten stromen (2x). Pipetteer 110 μL blokkeerbuffer (zie de tabel met materialen) op elke afdekplaat en incubeer gedurende 10 minuten.
    3. Bereid de gewenste primaire antilichaamverdunning in PBS of blokkerende buffer volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Incubeer de dia's met primair antilichaam (110 μL elke dia) gedurende 30 minuten. Was de dia's met 5 ml PBS (2x), zoals beschreven in 6.3.2.
    4. Incubeer de dia's met 110 μL mierikswortelperoxidasepolymeer gedurende 30 minuten. Was de dia's met 5 ml PBS (2x), zoals beschreven in 6.3.2.
    5. Bereid fluorofoorverdunning in amplificatieverdunningsmiddel 1:100 (v/v) en incubeer de dia's met fluorofoor (110 μL elke dia) gedurende 10 minuten. Was de dia's met 5 ml PBS (2x), zoals beschreven in 6.3.2.
      OPMERKING: Volg voor het gebruik van fluorofoor 780 de richtlijnen van de fabrikant. Het experiment kan hier worden gepauzeerd als de dia's in de laatste wassing van PBS worden geïncubeerd en 's nachts bij 4 °C worden bewaard.
    6. Verwijder de dia's van de afdekplaten en ga terug naar de stap voor het ophalen van antigeen om de kleuring met een ander antilichaam te starten. Herhaal de kleuring voor het gewenste aantal te testen antilichamen.
    7. Volg stap 6.3.5 voor de laatste fluorofoor die in gebruik is, houd de dia's op de afdekplaten, bereid 6 μM-oplossing van 4'-6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) dilactaat met UP-water en counterstain de dia's gedurende 5 minuten (110 μL elke dia). Was de glijbanen met UP water (2x) en verwijder overtollig water door de randen van de glijbanen te drogen. Monteer de coverslips op de dia's met behulp van montagemedium en bewaar bij RT in het donker.

7. Scannen

OPMERKING: Diascanning werd uitgevoerd met behulp van een multispectraal geautomatiseerd beeldvormingssysteem (zie de tabel met materialen).

  1. Monteer de dia's in de drager en laad ze in de gewenste volgorde in de scanner.
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om een controleschuif op te nemen waarin geen fluorofoor of DAPI wordt gebruikt tijdens immunohistochemische kleuring. Deze dia zal worden gebruikt als controle voor intrinsieke florescentie (autofluorescentie (AF)) van het weefsel.
  2. Nadat u de diascannersoftware hebt gestart, selecteert u Protocol bewerken op de startpagina. Maak een nieuw protocol met betrekking tot de naam, beeldvormingsmodus,het type multispectrale scan dat moet worden uitgevoerd(4-7 kanalen)en studie(directory).
    OPMERKING: Om de standaardinstellingen van geanalyseerde banden te wijzigen, selecteert/deselecteert u de gewenste filters met behulp van de functie Scanbanden selecteren
  3. Ga verder met Scan Exposure en Load carrieren selecteer ten slotte de drager voor de protocolinstellingen. Selecteer Overzicht nemen om het weefsel op de dia te detecteren. Kies een dia die op de dragerwordt weergegeven en selecteer een specifiek gebied van het weefsel met de rode cursor om deze in liveweergave in het linkervenster van het scherm te brengen.
  4. Selecteer het DAPI-filteren klik op Autofocus of pas de schuifregelaar Werkgebiedhoogte handmatig aan om het interessegebied scherp te stellen. Klik op Autoexpose om het systeem in staat te stellen de beste belichting voor dat filter/die band te vinden.
    OPMERKING: De belichtingstijd voor elk filter is ingesteld op 12 ms. Nadat u het systeem automatisch hebt vergeleken, verfijnt u de belichtingstijd tot een betere schatting. Het is ook mogelijk om de waarde voor automatische belichting te overschrijven door handmatig een waarde in de gemarkeerde cel te typen.
  5. Herhaal de bovenstaande stappen voor alle filters in het protocol. Wijzig indien nodig de locaties en/of dia's om de beste signalen te vinden voor het instellen van de belichtingen.
    OPMERKING: Als het weefsel in live view rood wordt gemarkeerd, is het fluorescerende signaal van het geanalyseerde filter verzadigd en moet de automatische blootstelling worden herhaald.
  6. Zodra de belichtingsinstellingen zijn ingesteld, klikt u op de knop Terug en slaat u het protocol op. Selecteer op de startpagina van de software (zie de tabel met materialen)de optie Dia's scannen.
  7. Stapel alle dragers die moeten worden gescand in het Slide Carrier Hotelen noteer de volgorde van de dia's om hun ID aan het systeem toe te wijzen.
    OPMERKING: Op het softwarescherm wordt elke drager gerelateerd aan een sleuf met 4 dia's.
  8. Als u meerdere dia's met dezelfde parameters wilt configureren, klikt u op Taken configurerenen selecteert u een of meer slots met de optie Uzingt dezelfde regels voor dezelfde dia's. Zodra de dia's bewerken wordt geopend, configureert u: Taken, Studieen Protocolen klikt u op OK.
  9. Label elke dia door op het slotpictogram te klikken en typ een naam in de dia-id-cel. Klik op Scannen om het scannen te starten.
    OPMERKING: Zodra het slotpictogram blauw wordt en de dia's zijn gemarkeerd met een blauwe pijl, heeft de drager alle regels en is deze klaar om te worden gescand. Het is mogelijk om de dia-ID's, studies, protocollen en taken op te slaan door op de knop Setup opslaan te klikken.

8. Analyse

OPMERKING: Het onderstaande protocol illustreert de methode voor fenotypeanalyse.

  1. Beeldvoorbereiding
    1. Als u de afbeeldingen wilt voorbereiden voor analyse, opent u de viewersoftware (zie de tabel met materialen)en selecteert u Dia's laden. Selecteer de gewenste scans voor het trainingsproject aan de rechterkant van het scherm.
    2. Klik voor elke scan op Stempelen kies Project in het vak Selecteren voor: Definieer een stempel met grootte 1 x 1 in het afbeeldingsveld om later te worden gebruikt als sjabloon voor de trainingsanalyse. Merk op dat deze stempel wordt gemarkeerd als een rood vierkant.
      OPMERKING: Het aantal stempelannotaties voor het project is willekeurig. Het wordt aanbevolen om er een te genereren voor de intrinsieke fluorescentiescan en nog een paar die over het algemeen representatief zijn voor de signaalverdeling in het weefsel.
    3. Open ten slotte alle scans van het experiment. Klik voor elk op Stempelen kies deze keer de optie Batch in het vak Selecteren voor: Plaats een stempel die elke explant omschrijft.
      OPMERKING: Deze keer worden de stempels gemarkeerd als groene vierkanten en zijn ze vereist zodra de batchanalyse wordt gestart. Kies de juiste grootte voor de stempels (1 x 1, 2 x 2, 3 x 3) en vermijd overlapping van de stempels, waardoor dubbele gegevens in het geëxporteerde bestand worden gegenereerd.
  2. Trainingsanalyse
  3. Start de software voor analyse (zie de tabel met materialen)en maak een nieuw project: Selecteer Bestand | Nieuw | Project.
  4. Typ een naam in het vak Projectnaam en configureer het type project.
    OPMERKING: De experimenten werden uitgevoerd met behulp van de volgende specificaties: trainbare weefselsegmentatie; adaptieve celsegmentatie; fenotypering.
  5. Laad de scans met de stempels voor training: Bestand | Open | Afbeelding. Navigeer in de weergave in één modusdoor de afbeeldingen en selecteer de scans met intrinsieke fluorescentie.
  6. Klik op de knop Autofluorescentie (AF) en teken met de Autofluorescentiekiezerop een niet-gekleurd deel van het weefsel. Klik op Afbeeldingen voorbereiden om de software in staat te stellen de intensiteit van intrinsieke fluorescentie af te trekken van alle afbeeldingen die voor training zijn geüpload.
  7. Klik op de knop Markeringen en kleuren bewerken en voer de markeringsnamen in het vak in dat is gekoppeld aan hun fluorofoor. Klik op de stap Weefsel segmenteren boven aan het scherm om het venster Tissue Segmentation Training te openen.
  8. Typ in het venster Weefselcategorieën de naam van de weefselcategorieën waarin u de afbeeldingen wilt segmenteren (bijv. Tumor, Stroma, Achtergrond, Necrose).
  9. Klik in het venster Tissue Segmentation Training op de knop Tekenen en teken gebieden rond groepen cellen om een weefselcategorie van belang te definiëren. Als u bijvoorbeeld een tumorgebied wilt definiëren, tekent u een gebied rond een groep tumorcellen. Schakel over naar de volgende categorie en herhaal het tekenproces.
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om regio's te tekenen in de meeste afbeeldingen die zijn geüpload voor training. Het is ook mogelijk om de training te verfijnen door de patroonschaal en de segmentatieresolutie te bewerken waarvan de details beter worden beschreven in de gebruikershandleiding.
  10. Nadat u de trainingsregio's hebt gedefinieerd, gaat u verder met Train the Tissue Segmenter.
    OPMERKING: Tijdens het trainingsproces geeft de software het percentage nauwkeurigheid van weefselsegmentatie weer. Voor optimale resultaten wordt aanbevolen dat weefselsegmentatie ten minste 90% nauwkeurig is. Zodra de segmenter is gestabiliseerd, klikt u op de knop Gereed.
  11. Om het masker Weefselcategorie op alle afbeeldingen te zien, klikt u op de knop Alles segmenteren.
  12. Nadat de kwaliteit van weefselsegmentatie is geverifieerd, tekent u de trainingsgebieden opnieuw rond de gebieden die onjuist zijn geclassificeerd en traint u de tissuesegmenter opnieuw totdat het proces succesvol is.
  13. Klik op de stap Celsegmentatie in de stappenbalk bovenaan het venster om door te gaan met de analyse.
  14. Kies de cellulaire compartimenten om te segmenteren: kernen, cytoplasmaen / of membraan.
    OPMERKING: Aangezien adaptieve celsegmentatie alleen cellen met een nucleair signaal kan detecteren, moet u Kernen niet deselecteren. Hoewel het ook mogelijk is om cytoplasma en/of membraan te segmenteren, wordt aanbevolen om eerst de sterkste, meest voorkomende nucleaire component te kiezen (bijv. DAPI).
  15. Configureer de nucleaire component met de schuifregelaar Typische intensiteit om de drempelwaarde aan te passen die wordt gebruikt om nucleaire pixels te detecteren. Noteer het voorbeeldvenster dat wordt geopend en live feedback geeft wanneer de drempel wordt aangepast.
    OPMERKING: Deze drempel is adaptief en wordt gemeten ten opzichte van de omringende achtergrond. Verhoog deze waarde als te veel achtergrond als nucleair wordt gedetecteerd. Verlaag deze waarde als zwakke kernen worden gemist. Gebruik de knop Gebieden weergeven/verbergen om de segmentatiemaskers in en uit te schakelen en controleer of de juiste pixels als nucleair worden gedetecteerd.
  16. Als u clusters van nucleaire pixels wilt splitsen, gebruikt u het deelvenster Splitsen van nucleaire componenten. Kies de knop die de kleuringskwaliteit van de kernen het beste beschrijft. Gebruik vervolgens de schuifbalk om de splitsingsgevoeligheidaan te passen, rekening houdend met het feit dat lagere waarden zullen resulteren in meer splitsing.
  17. Klik op de knop Alles segmenteren om alle afbeeldingen te segmenteren. Als het resultaat niet nauwkeurig is, wijzigt u de instellingen en traint u de software opnieuw totdat een bevredigende segmentatie is bereikt.
  18. Ga verder met de laatste stap van de analyse: Fenotypering. Voeg in het deelvenster Fenotypen de lijst met te detecteren fenotypen toe en typ de naam in het bijbehorende tekstvak. Klik op de knop Fenotypen bewerken, selecteer een bepaalde cel om een vervolgkeuzemenu te openen en kies het bijbehorende fenotype.
    OPMERKING: Ten minste vijf cellen voor elk fenotype zijn nodig om de classificator te trainen. Het uitschakelen van de visualisatie van de kernen maakt een betere visualisatie mogelijk van het celfenotype dat moet worden toegewezen.
  19. Zodra de selectie voor training is voltooid, klikt u op de knop Train Classifier.
    OPMERKING: De software classificeert elke cel in de afbeelding en wanneer er fouten in de classificatie optreden, is het mogelijk om het fenotype van de cellen te bewerken en de training van de classifier te herhalen. Sla het project op voordat u doorgaat met batchanalyse en klik op Exporteren in de werkbalk bovenaan het scherm.
  20. Selecteer het tabblad Bathanalyse in het linkermenu en laad het project in het vak Batchalgoritme of Project.
  21. Klik op Exportopties om afzonderlijke mappen voor elke afbeelding te maken en navigeer met de knop Bladeren om de locatie te vinden om de gegevens te exporteren. Klik op alle opties van de afbeeldingen en tabellen om te exporteren.
  22. Klik aan de rechterkant van het scherm op Dia's toevoegen en laad alle afbeeldingen met stempels voor eerder voorbereide batches (stap 7.3). Klik op de knop Uitvoeren om de batchanalyse te starten en één stempel tegelijk te verwerken en de bijbehorende gegevens te exporteren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Multispectrale beeldvorming van mIF-gekleurde histologische secties maakt identificatie en fenotypering van individuele celpopulaties en identificatie van tumor- en stromale componenten in de explant TME mogelijk(figuur 2). Multispectrale beeldvorming is met name nuttig voor de analyse van weefsels met een hoge intrinsieke autofluorescentie, zoals weefsel met een hoog collageengehalte, omdat het autofluorescentiesignaal kan worden gedeconvolueerd van andere signalen en kan worden uitgesloten...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit artikel beschrijft de methoden voor generatie, medicamenteuze behandeling en analyse van PDE's en belicht de voordelen van het platform als een preklinisch modelsysteem. Ex vivo kweken van een vers gereseceerde tumor, die geen deconstructie ervan met zich meebrengt, maakt het behoud van de tumorarchitectuur13,24 en dus de ruimtelijke interacties van cellulaire componenten in de TME en intratumorale heterogeniteit mogelijk. Deze methode laat zien hoe het, met ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Niets bekend te maken

Dankbetuigingen

We bedanken de chirurgen en pathologen van de Universitaire Ziekenhuizen van Leicester NHS Trust voor het leveren van chirurgisch gereseceerd tumorweefsel. Ook danken we de histologiefaciliteit binnen Core Biotechnology Services voor hulp bij weefselverwerking en sectioning van FFPE weefselblokken en Kees Straatman voor ondersteuning bij het gebruik van de Vectra Polaris. Dit onderzoek werd ondersteund en gefinancierd door het Explant Consortium bestaande uit vier partners: de Universiteit van Leicester, de MRC Toxicology Unit, Cancer Research UK Therapeutic Discovery Laboratories en LifeArc. Aanvullende ondersteuning werd geboden door het CRUK-NIHR Leicester Experimental Cancer Medicine Centre (C10604/A25151). Financiering voor GM, CD en NA werd verstrekt door het Catalyst Programme van Breast Cancer Now (2017NOVPCC1066), dat wordt ondersteund door financiering van Pfizer.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AzijnzuurSigma320099Kleurstof
Antibody Diluent / Block, 1xPerkin ElmerARD1001EAAntilichaam diluent/blokkeer buffer
Barnstead NANOpure DiamondBarnsteadUltra Pure (UP) H2O machine
Citroenzuur MonohydraatSigma-AldrichC7129Reagens voor citraat buffer
Costar Multiple Well Cell Culture PlatesCorning Incorporated35166 multiwell plate
DAPI DilactateLife TechnologiesD3571
100 x 17 mm Dish, Nunclon DeltaThermoFisher Scientific150350100 mm diameter dish voor weefselkweek
DMEM (1x) Dubelcco's Modified Eagle Medium + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/mL Sodium PyruvateGibco (Life Technologies)10569-010Weefselkweek medium (500 mL)
DPX mountantVWR360294HMonteermedium
DPX mountantMerck6522Monteermedium
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Sigma-Aldrich3609Reagens voor TE buffer
EosineCellPathRBC-0100-00AKleurstof
Foetaal RundserumGibco10500-064Voor gebruik in weefselkweek medium
37% FormaldehydeFisher (Acros)11969001010% Formaline
iGenix, magnetron IG2095iGenixIG2095Magnetron gebruikt voor antigeen retreviaal
Industriële gemethyleerde spirit (IMS)Genta Medical19905099% Gedenatureerde Industriële Alcohol (IDA)
InForm Advanced Image Analysis SoftwareAkoya BiosciencesInForm
Leica ASP3000 Tissue ProcessorLeica BiosystemsAutomatische Vacuüm Tissue Processor
Leica Arcadia H en CLeica BiosystemsInbeddingswasbad
Leica RM2125RTLeica BiosystemsRoterende microtoom
Leica ST4040 Lineair StainerLeica BiosystemsH&E kleuringsapparaat
Mayer's HaematoxylineSigmaGHS132-1LKleurstof
Millicell Cell Culture Inserts, 30 mm, hydrofiel PTFE, 0.4 µmMerck MiliporePICMORG50Organotypisch cultuur inzet disc
Novolink Polymer Detection SystemLeica BiosystemsRE7150-KDAB kleuringskit
OPAL 480Akoya BiosciencesFP1500001KTFluorofoor met Dimethyl Sulfoxide (DMSO) verdunningsmiddel
OPAL 520Akoya BiosciencesFP1487001KTFluorofoor met Dimethyl Sulfoxide (DMSO) verdunningsmiddel
OPAL 570Akoya BiosciencesFP1488001KTFluorofoor met Dimethyl Sulfoxide (DMSO) verdunningsmiddel
OPAL 620Akoya BiosciencesFP1495001KTFluorofoor met Dimethyl Sulfoxide (DMSO) verdunningsmiddel
OPAL 650Akoya BiosciencesFP1496001KTFluorofoor met Dimethyl Sulfoxide (DMSO) verdunningsmiddel
OPAL 690Akoya BiosciencesFP1497001KTFluorofoor met Dimethyl Sulfoxide (DMSO) verdunningsmiddel
OPAL 780 / OPAL TSA-DIG ReagentAkoya BiosciencesFP1501001KTFluorofoor met Dimethyl Sulfoxide (DMSO) verdunningsmiddel en TSA-DIG reagens
Opal Polymer HRP Ms Plus Rb, 1xPerkin ElmerARH1001EAHRP polymeer
Penicilline/streptomycine oplossingFisher Scientific11548876Voor gebruik in weefselkweek medium
PhenoChart Whole Slide Contextual ViewerAkoya BiosciencesPhenoChartViewer software voor gescande beelden
Phosphate Buffered Saline TabletsThermo Scientific OxoidBR0014GPBS
1x Plus Amplification DiluentPerkin ElmerFP1498Fluorofoor verdunningsmiddel
Prolong Diamond Antifade MountantInvitrogenP36961Monteermedium
Slide CarrierPerkin ElmerOm slides in Slide Carrier Hotel te laden voor scannen met Vectra Polaris
NatriumchlorideFisher ScientificS/3160/6310% Formaline
Natriumhydroxide pelletsFisher ScientificS/4920/53Reagens voor citraat buffer
Tenatex Verharde Was - Roze (500 g)KEMDENT1-601Tandheelkundig wasoppervlak
Thermo Scientific Shandon Sequenza Slide Rack voor Immunostaining CenterFisher Scientific10098889Houd voor slides en slide klemmen
Thermo Scientific Shandon Plastic CoverplatesFisher Scientific11927774Slide klemmen
Tris(hydroxymethyl)aminomethaan (Tris)Sigma-Aldrich252859Reagens voor TE buffer
VectaShieldVecta LaboratoriesH-1000-10Monteermedium
Vectra Polaris Slide ScannerPer

Referenties

  1. Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. The New England Journal of Medicine. 366 (10), 883-892 (2012).
  2. Jamal-Hanjani, M., et al. Tracking the evolution of non-small-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine. 376 (22), 2109-2121 (2017).
  3. McGranahan, N., Swanton, C. Biological and therapeutic impact of intratumor heterogeneity in cancer evolution. Cancer Cell. 27 (1), 15-26 (2015).
  4. Casey, T., et al. Molecular signatures suggest a major role for stromal cells in development of invasive breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 114 (1), 47-62 (2009).
  5. Gerdes, M. J., et al. Emerging understanding of multiscale tumor heterogeneity. Frontiers in Oncology. 4, 366(2014).
  6. Komohara, Y., Takeya, M. CAFs and TAMs: maestros of the tumour microenvironment. The Journal of Pathology. 241 (3), 313-315 (2017).
  7. Miyake, M., et al. CXCL1-mediated interaction of cancer cells with tumor-associated macrophages and cancer-associated fibroblasts promotes tumor progression in human bladder cancer. Neoplasia. 18 (10), 636-646 (2016).
  8. Hisamitsu, S., et al. Interaction between cancer cells and cancer-associated fibroblasts after cisplatin treatment promotes cancer cell regrowth. Human Cell. 32 (4), 453-464 (2019).
  9. Witz, I. P. The tumor microenvironment: the making of a paradigm. Cancer Microenvironment. 2, Suppl 1 9-17 (2009).
  10. Fu, X. T., et al. Tumor-associated macrophages modulate resistance to oxaliplatin via inducing autophagy in hepatocellular carcinoma. Cancer Cell International. 19, 71(2019).
  11. Chen, D., Zhang, X. Tipping tumor microenvironment against drug resistance. Journal of Oncology Translational Research. 1 (1), 106(2015).
  12. Roma-Rodrigues, C., Mendes, R., Baptista, P. V., Fernandes, A. R. Targeting tumor microenvironment for cancer therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (4), 840(2019).
  13. Powley, I. R., et al. Patient-derived explants (PDEs) as a powerful preclinical platform for anti-cancer drug and biomarker discovery. British Journal of Cancer. 122 (6), 735-744 (2020).
  14. Freeman, A. E., Hoffman, R. M. In vivo-like growth of human tumors in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 83 (8), 2694-2698 (1986).
  15. Vescio, R., et al. A. al. In vivo-like drug responses of human tumors growing in three-dimensional gel-supported primary culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 84 (14), 5029-5033 (1987).
  16. Hoffman, R. M. 3D Sponge-matrix histoculture: an overview. Methods in Molecular Biology. 1760, 11-17 (2018).
  17. Vescio, R. A., Connors, K. M., Kubota, T., Hoffman, R. M. Correlation of histology and drug response of human tumors grown in native-state three-dimensional histoculture and in nude mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 88 (12), 5163-5166 (1991).
  18. Furukawa, T., Kubota, T., Hoffman, R. M. Clinical applications of the histoculture drug response assay. Clinical Cancer Research. 1 (3), 305-311 (1995).
  19. Centenera, M. M., Raj, G. V., Knudsen, K. E., Tilley, W. D., Butler, L. M. Ex vivo culture of human prostate tissue and drug development. Nature Reviews Urology. 10 (8), 483-487 (2013).
  20. Centenera, M. M., et al. Evidence for efficacy of new Hsp90 inhibitors revealed by ex vivo culture of human prostate tumors. Clinical Cancer Research. 18 (13), 3562-3570 (2012).
  21. Dean, J. L., et al. Therapeutic response to CDK4/6 inhibition in breast cancer defined by ex vivo analyses of human tumors. Cell Cycle. 11 (14), 2756-2761 (2012).
  22. Majumder, B., et al. Predicting clinical response to anticancer drugs using an ex vivo platform that captures tumour heterogeneity. Nature Communications. 6, 6169(2015).
  23. Goldman, A., et al. Temporally sequenced anticancer drugs overcome adaptive resistance by targeting a vulnerable chemotherapy-induced phenotypic transition. Nature Communications. 6, 6139(2015).
  24. Karekla, E., et al. Ex vivo explant cultures of non-small cell lung carcinoma enable evaluation of primary tumor responses to anticancer therapy. Cancer Research. 77 (8), 2029-2039 (2017).
  25. Ricciardelli, C., et al. Novel ex vivo ovarian cancer tissue explant assay for prediction of chemosensitivity and response to novel therapeutics. Cancer Letters. 421, 51-58 (2018).
  26. Yoshimasu, T., et al. Histoculture drug response assay (HDRA) guided induction concurrent chemoradiotherapy for mediastinal node-positive non-small cell lung cancer. Gan To Kagaku Ryoho. Cancer and chemotherapy. 30 (2), 231-235 (2003).
  27. Pirnia, F., et al. Ex vivo assessment of chemotherapy-induced apoptosis and associated molecular changes in patient tumor samples. Anticancer Research. 26, 1765-1772 (2006).
  28. Maund, S. L., Nolley, R., Peehl, D. M. Optimization and comprehensive characterization of a faithful tissue culture model of the benign and malignant human prostate. Laboratory Investigation. 94 (2), 208-221 (2014).
  29. Vasaturo, A., Galon, J. Multiplexed immunohistochemistry for immune cell phenotyping, quantification and spatial distribution in situ. Methods in Enzymology. 635, 51-66 (2020).
  30. Fuhrman, K., et al. Molecularly guided digital spatial profiling for multiplexed analysis of gene expression with spatial and single cell resolution. Journal of Biomolecular Techniques. 31, 14-15 (2020).
  31. Twiddy, D., et al. A TRAIL-R1-specific ligand in combination with doxorubicin selectively targets primary breast tumour cells for apoptosis. Breast Cancer Research. 12 (1), 58(2010).
  32. Cai, H., et al. Cancer chemoprevention: Evidence of a nonlinear dose response for the protective effects of resveratrol in humans and mice. Science Translational Medicine. 7 (298), (2015).
  33. Busacca, S., et al. Resistance to HSP90 inhibition involving loss of MCL1 addiction. Oncogene. 35 (12), 1483-1492 (2016).
  34. Kolluri, K. K., et al. Loss of functional BAP1 augments sensitivity to TRAIL in cancer cells. Elife. 7, 30224(2018).
  35. Toki, M. I., et al. High-plex predictive marker discovery for melanoma immunotherapy-treated patients using digital spatial profiling. Clinical Cancer Research. 25 (18), 5503-5512 (2019).
  36. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380(2017).
  37. Park, I. J., et al. Prediction of radio-responsiveness with immune-profiling in patients with rectal cancer. Oncotarget. 8 (45), 79793-79802 (2017).
  38. Mezheyeuski, A., et al. Multispectral imaging for quantitative and compartment-specific immune infiltrates reveals distinct immune profiles that classify lung cancer patients. The Journal of Pathology. 244 (4), 421-431 (2018).
  39. Kather, J. N., et al. Topography of cancer-associated immune cells in human solid tumors. Elife. 7, 36967(2018).
  40. Zollinger, D. R., Lingle, S. E., Sorg, K., Beechem, J. M., Merritt, C. R. GeoMx™ RNA assay: high multiplex, digital, spatial analysis of RNA in FFPE tissue. Methods in Molecular Biology. 2148, 331-345 (2020).
  41. Zugazagoitia, J., et al. Biomarkers associated with beneficial PD-1 checkpoint blockade in non-small cell lung cancer (NSCLC) identified using high-plex digital spatial profiling. Clinical Cancer Research. 26 (16), 4360-4368 (2020).
  42. Allo, B., Lou, X., Bouzekri, A., Ornatsky, O. Clickable and high-sensitivity metal-containing tags for mass cytometry. Bioconjugate Chemistry. 29 (6), 2028-2038 (2018).
  43. Gerdtsson, E., et al. Multiplex protein detection on circulating tumor cells from liquid biopsies using imaging mass cytometry. Convergent Science Physical Oncology. 4 (1), 015002(2018).
  44. Reck, M., et al. Pembrolizumab versus chemotherapy for PD-L1-positive non-small-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine. 375 (19), 1823-1833 (2016).
  45. Le, D. T., et al. KEYNOTE-164: Phase 2 study of pembrolizumab for patients with previously treated, microsatellite instability-high advanced colorectal carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 34, 15_suppl 3631(2016).
  46. Diaz, L. A., et al. KEYNOTE-177: Randomized phase III study of pembrolizumab versus investigator-choice chemotherapy for mismatch repair-deficient or microsatellite instability-high metastatic colorectal carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 35, 4_suppl 815(2017).
  47. Long, G. V., et al. Impact of baseline serum lactate dehydrogenase concentration on the efficacy of pembrolizumab and ipilimumab in patients with advanced melanoma: data from KEYNOTE-006. European Journal of Cancer. 72, 122-123 (2017).
  48. Voong, K. R., Feliciano, J., Becker, D., Levy, B. Beyond PD-L1 testing-emerging biomarkers for immunotherapy in non-small cell lung cancer. Annals of Translational Medicine. 5 (18), 376(2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Pati nt afgeleide explantatentumor micro omgevingvoorspelling van geneesmiddelresistentiedriedimensionale cultuurgemultiplexte immunofluorescentiemultispectrale beeldvormingcelsegmentatieidentificatie van biomarkerstumorheterogeniteitimmuuncheckpointremmers
Patiënt-afgeleide tumor explanteert als een "live" preklinisch platform voor het voorspellen van medicijnresistentie bij patiënten
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.