Methodenartikel

Een open-source normothermisch perfusiesysteem ontworpen voor onderzoekswetenschappers

DOI:

10.3791/68722

⸱

18 juli 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Surgical Oncology Program, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2Instrumentation Development and Engineering Application Solutions, National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health, 3Radiology and Imaging Sciences, Department of Interventional Radiology, National Institutes of Health, 4Histopathology and Autopsy Pathology, Laboratory of Pathology, National Institutes of Health, 5Division of Cancer Treatment and Diagnosis, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 6Department of Perioperative Medicine, National Institutes of Health, 7Blood Services Section, Department of Transfusion Medicine, National Institutes of Health, 8Translational Hepatology Section, Liver Disease Branch, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, National Institutes of Health, 9Center for Immuno-Oncology, National Cancer Institute, National Institutes of Health

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol voor een open-source, aanpasbaar normotherm ex vivo perfusiesysteem dat is ontworpen om de hoge kosten en beperkte flexibiliteit van bestaande platforms te overwinnen, waardoor een toegankelijker, kostenefficiënter en iteratiever gebruik in preklinisch biomedisch onderzoek mogelijk wordt.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De integratie van ex vivo perfusiemachines voor menselijke organen voorafgaand aan transplantatie heeft de resultaten voor de ontvangers verbeterd en de beschikbaarheid van organen vergroot, terwijl nieuwe onderzoeksmogelijkheden voor translationele geneeskunde aan het licht zijn gekomen. Deze machines zijn echter beperkt beschikbaar voor experimentele aanpassingen, terwijl ze een aanzienlijke initiële kosteninvestering en onbetaalbare kosten per gebruik voor de onderzoekswetenschapper met zich meebrengen. Bovendien is er een grote behoefte aan verbeterde preklinische modellen in biomedisch onderzoek die authentieke ondervraging van cellulaire processen in de multicellulaire orgaansetting mogelijk maken.

Om toegang te bieden tot vergelijkbare technologie voor de grotere onderzoeksgemeenschap, hebben we een kosteneffectieve modulaire normotherme perfusiemachine gebouwd die volledig bestaat uit gemakkelijk te verkrijgen onderdelen die worden uitgevoerd met door de gebruiker aanpasbare Python-code. Aangezien het systeem geen aangepaste hardware bevat, kunnen onderzoekers het systeem bouwen en uitbreiden zoals vereist voor geïndividualiseerde onderzoekstoepassingen.

Hierin beschrijven we de instelling en het perfusieproces van de machine in detail, brengen we onze ervaring met varkens en menselijke organen over en geven we vroege proof-of-concept experimentele resultaten. Deze studies tonen het potentieel aan om pathofysiologie en complexe cellulaire processen te ondervragen met behulp van intact menselijk weefsel.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hoewel kortdurende (<12 uur) normotherme machineperfusie eerder is toegepast voor nieren en levers voorafgaand aan transplantatie 1,2,3,4,5, werd langdurige normotherme ex vivo leverperfusie in 2020 een realiteit met de Liver4Life-machine 6. De bedoeling van deze technologie was gericht op de uitbreiding van levensvatbare donororganen, maar de mogelijke translationele toepassingen waren duidelijk voor de onderzoeksgemeenschap 7,8,9,10,11,12. Voor benchwetenschappers en conventionele onderzoekslaboratoria zijn deze klinische hulpmiddelen bijna zeker onbereikbaar vanwege de aanzienlijke initiële en terugkerende kosten12,13. Klinische normotherme perfusiemachines kosten meer dan $ 250.000 USD, met wegwerpartikelen voor eenmalig gebruik variërend van $ 9.500 - $ 60.000 USD per run 13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23. Bovendien maken eigendomsrechten en het onvermogen om de bestaande technologie aan te passen wetenschappelijke toepassingen uitdagend.

De grote behoefte aan verbeterde preklinische modellen 24,25,26 in biomedisch onderzoek, in combinatie met de bovengenoemde beperkingen, inspireerde de oprichting van een open-source, aanpasbaar perfusiesysteem (Figuur 1). Het ontwerp en de ontwikkeling van circuits werden geleid door de principes van kostenbenutting, laboratoriumruimtevereisten en mobiliteit voor translationele toepassingen. Het systeem kan worden gebouwd voor $ 48.000 - $ 66.000 USD, en elke perfusiekosten variëren van $ 1.000 - $ 2.300 USD, wat werd bereikt door de integratie van gemakkelijk verkregen individuele componenten die worden beheerd door gratis downloadbare code. Het systeem werd geoptimaliseerd door middel van een iteratief proces waarbij gebruik werd gemaakt van donorbloed van varkens en verlopen menselijk bloed, varkenslevers en gedeeltelijke menselijke leversegmenten uit de operatiekamer (aanvullende tabel 1, aanvullende tabel 2 en aanvullende tabel 3). Organen zijn gehuisvest in een afgesloten bassin dat het monster optimaal positioneert om druknecrose te minimaliseren, een ideaal canulatietraject mogelijk te maken, afvoer af te voeren en normothermie te garanderen. Het reservoir bevat ongeveer 2-3 liter perfusaat voordat het naar instroomcircuits wordt geleid. Hemodialyse, die van cruciaal belang is voor de homeostase van elektrolyten en de hemoconcentratie in leverperfusies 6,27,28,29, werd geïntegreerd via een zijcircuit met een onafhankelijke rolpomp. Farmacologische infusies ondersteunen fysiologische functies (bijv. totale parenterale voeding (TPN), galzouten, enz.30), versterken de vasculaire tonus (epoprostenol, fenylefrine), voorkomen stolling (enoxaparine) en infectie (piperacilline-tazobactam, amfotericine). Fysiologische perfusieparameters worden gegarandeerd met behulp van real-time in-line sensoren om bloedgas-, druk- en stroomwaarden te verkrijgen. Het systeem zorgt voor een maximaal aanpassingsvermogen van de gebruiker, zodat de integratie van hardwarecomponenten op elk punt in het circuit kan plaatsvinden. Bovendien kan elk van de afzonderlijke componenten in het circuit worden uitgewisseld of gewijzigd om aanpassing aan specifieke onderzoeksvragen en experimentele behoeften mogelijk te maken. Het dubbele instroomcircuit kan bijvoorbeeld worden gewijzigd voor perfusie van organen met een enkele instroom (d.w.z. nieren of alvleesklier) door simpelweg de Y-connector vóór de pompkoppen te verwijderen, en claves voor infusie/bemonstering kunnen op elk punt binnen het circuit worden geïnstalleerd. Bovendien wordt het systeem uitgevoerd met Python-code die semi-geautomatiseerde perfusie mogelijk maakt op basis van een gespecificeerde set perfusieparameters die door de eindgebruiker worden gedicteerd (aanvullende figuur 1). Sensoren verwerven bijvoorbeeld continue arteriële bloedgassen (ABG), druk- en stroommetingen die fungeren als input om uitvoeropdrachten te implementeren om de gasstroom van de oxygenator, pompsnelheid, enz. automatisch aan te passen. De grafische gebruikersinterface (GUI) maakt het mogelijk om deze automatisering desgewenst handmatig op te heffen. De aanpasbaarheid van het circuit is het kenmerk ervan, en het verbreedt de algehele toepasbaarheid van dit systeem voor een breed scala aan experimentele onderzoeken.

Toegang tot het systeem in zijn geheel is vrij beschikbaar (https://github.com/CCR-SOP/OpenSourcePerfusionSystem.git) om samenwerking en innovatie aan te moedigen in een poging om nieuwe kennisdiepten te smeden op meerdere gebieden van translationele wetenschap.

figure-introduction-1
Figuur 1: Open-source perfusiesysteem. (A) Open-source perfusiesysteem schema voor dubbele instroomopstelling voor leverperfusie. (B) Driedimensionale (3D) weergave van het systeem tijdens orgaanperfusie met software-integratie zoals gedemonstreerd op schermen. (C) Foto van de perfusiemachine tijdens het experiment met varkensperfusie. De weergegeven configuratie in de afbeelding is alleen voor demonstratieve doeleinden. Tijdens de perfusie bedekt het steriele verwarmende laken het orgaan om een steriele omhulling te behouden. P/F-sensor: Druk- en debietsensoren. HA: Leverslagader. PV: Poortader. HV: Nervader. BD: Galwegen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol is uitgevoerd in overeenstemming met de ethische normen van de Human Research Ethics Committee van onze instelling en voldoet aan alle toepasselijke richtlijnen en voorschriften voor onderzoek met menselijke proefpersonen en weefsels.

1. Instelling van de machine

  1. Tafel voorbereiding
    1. Steriliseer het tafelblad en de mobiele wagen met 70% alcoholspray en veeg grondig af. Plaats de mobiele kar loodrecht op de linkerkant van de tafel. Voorafgaand aan de aansluiting van alle slangen en hardware gedurende het protocol, spuit met 70% alcohol of autoclaaf, indien van toepassing, om te steriliseren.
      OPMERKING: Gebruik voorafgaand aan elke orgaanbehandeling of -interventie steriele handschoenen en alcoholspray om de steriliteit voorafgaand aan en tijdens de perfusie te vergemakkelijken.
    2. Bedek de werkplek met steriele blauwe gordijnen en vervolgens absorberende onderleggers.
    3. Bevestig de reservoirhouder aan de karpoot die zich het dichtst bij de bank bevindt met de ring naar buiten uitstekend, ongeveer 12 cm onder de onderkant van de bovenkant van het werkstation.
    4. Plaats de trommeltrechter aan de rechterkant van de werkplek met een tuit die over de voorkant van de tafel hangt. Snijd rond traagschuim uit om de basis van de trommel te vullen, zodat er een opening van 4 cm is voor uitstroom bij de tuit. Plaats het middenrif onder schuim dat is aangesloten op een gasmasker.
    5. Pak 2 waterverwarmingsdekens en plaats ze op het schuimrubberen inzetstuk met verbindingsslangen die linksboven op de deken zijn gericht. Knip witte klemmen uit de slang en steek een 3/16" mannelijke Luer-weerhaak in elke buis. Beveilig 1 instroom- en 1 uitstroomleiding van de Y'ed waterverwarmingstankleidingen naar elke deken.
    6. Zorg voor een steriel warmer laken en identificeer het middelste blauwe vierkant. Vouw twee keer dubbel en knip 2 mm van de hoek van de vouw af om een uitstroomgat te creëren. Plaats een steriel laken op de bovenkant van de trommel zodat het gesneden gat in lijn is met de uitstroomtuit.
    7. Pak de 3D-geprinte stopcontactconnector en plaats de magneet in de groef. Plaats onder drapering door uitstroomtuit en lijn het gesneden gat uit met het gat in de connector en magneet. Plaats een tweede magneet uitgelijnd met de uitstroom om het gordijn vast te zetten.
    8. Til het overtollige drapermiddel op om de hele drumtrechter te bedekken en zet vast met elastiek/elastische banden. Vouw het overtollige laken over de bovenkant om een steriele barrière te creëren. Plaats de tweede watermantel terug op het opgevouwen laken.
    9. Snijd een stuk 1/4" slang van ~30" af en bevestig het proximale aspect aan het uitlaatstuk vanaf de onderkant van de tuit van de drumtrechter en het distale aspect aan een weerhaak van de reservoirinstroom.
  2. Voorbereiding van pomp en oxygenator
    1. Plaats de pompen op de mobiele kar die zich het dichtst bij de rand van het werkstation bevindt met een standaard en twee klemmen direct achter de pompen, zodat de klemmen 6" boven de pompen staan.
    2. Zorg voor 2 pompkoppen en zet ze vast in de pompen.
    3. Verkrijg 2 oxygenatoren en plaats ze in klemmen die in een horizontale configuratie aan standaards zijn bevestigd. Richt oxygenatoren met weerhaak naar buiten gericht en zijdelingse weerhaak naar rechts.
      OPMERKING: Oxygenatoren met Luer-connectoren vereisen een alternatieve configuratie met het label naar buiten gericht en de binnenste uitsteeksels naar boven.
  3. Bereiding gasmenger
    1. Snijd twee (2) stukken van 4 '1/8" buis en steek een mannelijke 1/8" Luer in de uiteinden van elke buis. Sluit één buis aan op elke arteriële en veneuze gasinstroom.
    2. Knip twee (2) stukken van 2" 1/4" buis af en bevestig een 1/4" vrouwelijke Luer aan het ene uiteinde. Plaats elk van deze slangstukken op de weerhaken rechtsboven van elke oxygenator.
    3. Sluit de arteriële en veneuze 1/8" gasinstroomslang aan op de Luer-connector rechtsboven van hun respectievelijke oxygenatoren.
  4. Voorbereiding van het hemodialysecircuit
    1. Verwijder alle slangen uit de hemodialysekit, behalve de slang die rechtstreeks in het filter leidt (blauwe, rode, groene en gele lijnen). Bevestig het filter op het ophangbord aan de achterkant van het werkstation, ~12" rechts van de pompen, of in lijn met het reservoir.
    2. Plaats 1 grote rolpomp direct rechts van het filter voor bloedinstroom. Plaats 2 kleinere peristaltische pompjes rechts van de bloedrollerpomp.
      1. Verkrijg twee (2) 1/8eperistaltische slangen en plaats deze in de witte pomp clamp. Bevestig twee (2) vrouwelijke 1/8e Luer-weerhaken aan elk uiteinde van elke buis.
    3. Hang een zak dialysaat van 5 L aan de rechterkant van de werkplek.
      1. Sluit de dialysaatzak aan op de instroom van het hemodialysefilter door de 1/8eslang aan de Luer-connector van de zak te bevestigen. Bevestig de mannelijke 1/8e Luer aan het uiteinde van deze slang en bevestig deze aan de instroom peristaltische pompslang.
    4. Dialysaat instroom/uitstroom: Verkrijg 3 1/8e slang met elk uiteinde uitgerust met een mannelijke 1/8eLuer .
      1. Instroom: Sluit het proximale uiteinde aan op het distale aspect van de pompslang en het distale uiteinde op de gele instroomslang (met 1/8e vrouwelijke Luer) op het hemodialysefilter.
      2. Uitstroom: Sluit het proximale uiteinde aan op de groene uitstroomslang (met 1/8e vrouwelijke Luer) en het distale uiteinde op de uitstroom peristaltische pompslang. Sluit de 1/8e slang aan op het distale aspect van de slangenpomp en laat deze via Luer-connectoren in de afvalzak lopen.
  5. Creatie van proximale schakelingen
    1. Plaats het reservoir in de reservoirhouder met de buitennummers en de naar buiten gerichte connector met gele dop.
    2. Knip ~36" 5/16" slang af en sluit het proximale uiteinde aan op de uitstroompiket op de bodem van het reservoir. Sluit de 5/16" Y-connector aan op het distale uiteinde van deze slang.
    3. Knip twee (2) 4" lengtes van de 5/16" slang af en sluit deze aan op het uiteinde van de Y-connector. Bevestig elk van de uiteinden van deze 4" buizen op de horizontale pin van elk van de pompkoppen.
    4. Knip twee (2) 4" lengtes van 1/4" slang af en sluit 1 aan op elk van de verticale weerhaken van de pompkoppen. Sluit het distale aspect aan op de linker onderste pin van elke oxygenator.
    5. Knip twee (2) 2" lengtes van 1/4" slang af en sluit een vrouwelijke Luer aan op het ene uiteinde. Voeg een mannelijke Luer-dop toe en bevestig deze aan de rechter onderste pin van elke oxygenator.
  6. Creatie van veneuze circuits
    1. Knip een (1) 30" lengte van 5/16" slang af en bevestig het proximale uiteinde aan de uitstroom (rechts) weerhaak van de veneuze oxygenator. Snijd doormidden en plaats een 5/16" Y-connector over het distale gesneden uiteinde. Bevestig de andere helft weer aan de bovenste weerhaak van de Y-connector.
    2. Bemonsteringscircuit aan de zijkant: Snijd een (1) stuk 1/4" slang van 2 inch af en rek het proximale uiteinde uit met behulp van een naaldschroevendraaier. Sluit deze aan op de andere weerhaak van de 5/16" Y-connector.
      1. Zorg voor een cuvettensensor. Sluit de prikkelzijde aan op de 2"-slang die is aangesloten op de Y-connector. Knip 1-2" van de distale cuvettenslang af en sluit deze aan op de mannelijke 1/4" Luer. Bevestig aan het proximale uiteinde van de shuntsensor zodra deze is gekalibreerd, en sluit aan het distale aspect de mannelijke 1/8" Luer aan op de 1/8" slang.
      2. Sluit het horizontale aspect van de vrouwelijke T-connector aan op de 1/8" slang en de mannelijke Luer. Sluit aan op het loodrechte aspect een bemonsteringsclave. Sluit een 1/8" mannelijke Luer aan op het resterende horizontale aspect van de T-connector.
      3. Knip 12" 1/8" slang af, bevestig het proximale uiteinde aan de bemonsteringsclave en bevestig een 1/8" mannelijke Luer aan het distale uiteinde. Sluit deze aan op een andere vrouwelijke T-connector. Bevestig aan één kant van de vrouwelijke T-connector een 1/4" mannelijke Luer en sluit deze aan op een instroomkanaal met behulp van 2" 1/4" slang.
    3. Keer terug naar het distale uiteinde van de 5/16" slang en bevestig nog een 5/16" Y-connector. Verkrijg ~55" 1/4" slang en bevestig deze aan het bovenste uiteinde van de 5/16" Y-connector.
    4. Maken van hemodialysebloedcircuit: Bevestig een 1/4" mannelijke Luer aan het distale uiteinde van de 1/4" slang. Plaats de slang door de grote rolpomp. Sluit aan op de bloedinstroom aan de bovenkant van het hemodialysefilter (blauw beklede slang).
      1. Knip een (1) stuk 24" 1/4" slang af en sluit een mannelijke 1/4" Luer aan op het proximale aspect. Sluit deze slang aan op het bloeduitstroomhemodialysefilter (rood beklede slang). Sluit het distale aspect aan op een instroomweerhaak van het reservoir.
    5. Keer terug om het veneuze instroomcircuit dat naar het monster leidt te voltooien. Knip een (1) stuk 1/4" slang van 36" af en rek het uit om op de weerhaak van de 5/16" Y-connector te passen.
    6. Infusieplaats van het geneesmiddel: Verkrijg 3 vierwegkranen en sluit deze lineair aan. Sluit dit stuk aan op de loodrechte arm van een vrouwelijke T-connector. Bevestig aan de in-line armen van de vrouwelijke T-connector twee mannelijke 1/4" Luers. Plaats het stuk 12" vanaf het linker aspect van de slang.
    7. Bevestig de externe debietsensoren op de 1/4" slang na de infusieplaats van het geneesmiddel. Zorg voor een 1 9" houder en zet deze vast ter hoogte van de trommeltrechter. Maak een snede 2" distaal van het einde van de stromingssensoren en plaats druksensoren met weerhaken in de 1/4" slang. Plaats het distale aspect van de slang in het midden van de drumtrechter. Reserveer één (1) 1/4" mannelijke Luer voor veneuze cannulatie in het monster.
  7. Creatie van arteriële circuits
    1. Knip nog een stuk 5/16" slang van ~30" af en bevestig het proximale uiteinde van de rechter uitstroomweerhaak van de arteriële oxygenator. Knip deze slang ongeveer halverwege af en bevestig een 1 5/16" Y-connector.
    2. Bemonsteringscircuit aan de zijkant: Maak een duplicaat bemonsteringscircuit aan de zijkant zoals beschreven in stap 1.6.2 en bevestig dit aan het inferieure aspect van de Y-connector, waarbij de cuvet wordt weggelaten. Als u klaar bent, bevestigt u de uitstroom 1/8" Luer aan de T-connector.
    3. Knip een (1) stuk 1/4" slang van 36" af en plaats het op de weerhaak van de 5/16" Y-connector.
    4. Herhaal stap 1.6.7. Reserveer één (1) 1/4" mannelijke Luer voor arteriële canulatie in het monster.
  8. Creatie van veneuze uitstroom
    1. Knip ~30" 1/4" slang af en bevestig 1 mannelijke 1/4" Luer aan het proximale uiteinde om te bevestigen aan de inferieure vena cava (IVC) uitstroom van het monster. Bevestig het distale uiteinde aan een van de instroomweerhaken van het reservoir.
    2. Snijd deze slang ~6" uit het reservoir en bevestig 2 1/4" mannelijke Luers aan elk uiteinde. Breng een vrouwelijke T met een clave aan het loodrechte uiteinde in voor bemonstering.
  9. Breng perfusaat toe aan het circuit zoals beschreven in stap 4. Verwarm het preparaat opnieuw en sluit het aan zoals beschreven in stap 6.1.4. of stap 6.2.4. en beginnen met perfusie.

2. Kalibratie van de CDI-sensor

  1. Zorg ervoor dat de gasflessen van de kalibrator vol zijn en zijn geïnstalleerd volgens de gebruiksaanwijzing van de gebruiker en dat de monitor is ingesteld op de kalibratiemodus. Kalibreer volgens de instructies van de fabrikant.
  2. Koppel het sensor-kabelkopapparaat los van de monitor zodra de kalibratie is voltooid en integreer het onmiddellijk in de respectievelijke veneuze en arteriële zijcircuits. Luer-verbindingen worden gemaakt in stap 1.6.2 en 1.7.2.

3. Initiatie van de code

  1. Download, installeer en open de Python-code in de GitHub-repository. Zorg voor een correcte installatie van Python- en PyCharm-software.
  2. Maak een unieke vertakking voor elke perfusierun voor nauwkeurige gegevensregistratie. Eenmaal gestart, wordt een GUI weergegeven met twee vensters. Oriënteer één venster per scherm voor eenvoudige bediening van hardware en weergave van perfusieparameters.
  3. Pas de perfusieparameters handmatig aan of automatiseer de perfusie via de respectieve knoppen die op de GUI worden weergegeven (aanvullende afbeelding 1).

4. Perfusate creatie en systeem priming

  1. Bereid het circuit ongeveer 2 uur voor op orgaanperfusie om correctie van metabole/elektrolytenstoornissen mogelijk te maken, opwarming tot normothermie en toediening van antistolling, antibiotica en andere geneesmiddelen.
  2. Perfusaat van varkens
    1. Verkrijg 2 l volbloed van het type OO en breng het in het reservoir door het af te tappen door een open spuit van 50-100 ml. Neem ongeveer 1 ml volbloed en meet de basislijn-pH, elektrolyten en hematocriet op een point-of-care-machine.
    2. Dien indien nodig aliquots van 8,4% natriumbicarbonaat toe om de zuurgraad als gevolg van conserveringsmiddelen in koud bloed tegen te gaan. Start hemodialyse om hyperkaliëmie en melkzuuracidemie indien nodig te normaliseren en titreer tot de gewenste hematocrietconcentratie. Pas de gasstroom aan om te titreren tot fysiologische pO2- en pCO2-niveaus.
    3. Dien geneesmiddelen toe zoals hieronder beschreven (rubriek 5).
    4. Bewaar 1-2 L type OO volbloed voor intermitterende bolussen indien nodig om de hematocriet tijdens het perfusie-experiment op ~30-40% te houden.
  3. Menselijk perfusaat
    1. Verkrijg type-gematchte bloedproducten van een bloedbank (bijna verlopen of gedoneerd voor onderzoeksdoeleinden).
      OPMERKING: Voor elk perfusie-experiment zijn ongeveer 4 eenheden verpakte rode bloedcellen (RBC's) en plasma vereist.
    2. Was pRBC's om conserveringsmiddelen te verwijderen en elektrolytverstoringen van de RBC-pellet te normaliseren voordat u deze voorbereidt. Was RBC's twee keer.
      1. RBC-wassen: Doe pRBC en 0,9% NaCl in een verhouding van 1:1 in een centrifugebuis. Centrifugeer bij 1300 × g gedurende 15 min. Verwijder het bovenstaande met een pipet en herhaal verse 0,9% NaCl in een verhouding van 1:1 ten opzichte van de RBC-pellet. Centrifugeer opnieuw zoals hierboven en verwijder het 2e bovenstaande voor de uiteindelijke gewassen RBC-pellet.
    3. Breng gewassen RBC-pellets in het reservoir met behulp van een open spuit van 50-100 ml. Plaats 4 eenheden plasma in het reservoir en begin met circuleren.
    4. Start dialyse, het opwarmen van dekens en de gasinstroom zodra het perfusaat circuleert.
    5. Bemonster, perfusaat en pas indien nodig farmacologische interventies toe om ervoor te zorgen dat de perfusaatniveaus bijna fysiologisch zijn voordat de organen worden geperfuseerd.
    6. Was en introduceer extra gewassen pRBC-pellets en titreer de volumestatus door middel van hemodialyse indien nodig om hematocrietniveaus van 30-40% te behouden.

5. Farmacologische interventie en bereiding van infusies

  1. Toediening van antibiotica en antischimmelmiddelen
    1. Combineer twee injectieflacons van 2,5 g piperacilline/tazobactam in een steriel monsterkopje met 40 ml steriele zoutoplossing. Voeg 10 ml toe aan het reservoir als een "antibioticum prime".
      1. Verdun het resterende mengsel met 60 ml steriele zoutoplossing en verdeel over twee spuiten van 50 ml. Sluit één spuit aan op een spuitpomp en programmeer om continu 41 μl/min toe te dienen aan de infusieplaats van de poortader (stap 1.6.6).
      2. Bewaar het resterende antibioticum in een koelkast van 4 °C.
    2. Reconstitueer een injectieflacon amfotericine van 50 mg met 10 ml steriel water.
      1. Zuig 1 ml geconcentreerde amfotericine op en combineer dit met 9 ml steriele zoutoplossing. Dien het mengsel van 10 ml toe aan het reservoir om te dienen als een "antischimmelprimer" aan het begin van de perfusie.
      2. Dien elke 12 uur 1 ml geconcentreerd amfotericine toe aan het reservoir.
  2. Antistolling
    1. Combineer 1 ml (100 mg) enoxaparine met 49 ml steriele zoutoplossing. Dien aan het begin van de perfusie een mengsel van 5 ml perfusaat per liter toe voor een "antistollingsprime".
      1. Bewaar de resterende enoxaparineoplossing in een koelkast van 4 °C.
      2. Dien de enoxaparineoplossing (5 ml/1 l perfusaat) elke 12 uur toe aan het reservoir.
  3. Steroïden
    1. Reconstitueer 1 g methylprednisolon met 20 ml steriel water.
    2. Bereid het systeem voor volgens de doseringsspecificaties voordat de perfusie wordt gestart: Varkenslevers ontvangen 10 ml (500 mg) methylprednisolon. Gedeeltelijke menselijke levers krijgen 2 ml (100 mg) solumedrol.
    3. Verdun het resterende mengsel met 40 ml zoutoplossing in een spuit van 50 ml en plaats het in een spuitpomp om continu 33 μl/min toe te dienen aan de infusieplaats van de poortader (stap 1.6.6).
  4. Parenterale voeding en galzouten
    1. Reconstitueer 1,7 g taurocholiczuur met 50 ml 10% aminozuur + elektrolyt geconcentreerde parenterale voedingscomponent van TPN (onvermengd met dextrose) in een steriel monsterbekertje. Zuig op in een spuit van 50 ml en plaats deze in een spuitpomp om continu 83 μl/min toe te dienen aan de infusieplaats van de poortader (stap 1.6.6.)
  5. Vasculaire toonregeling
    1. Vaatverwijding: Reconstitueer 0,5 mg epoprostenol met 50 ml steriele zoutoplossing in een steriel kopje en plaats in een spuit van 50 ml. Plaats het in een spuitpomp en sluit het aan op de clave proximaal van de leverslagaderstroomsensor.
      1. Bolus of continu infuseren (10 μl/min) indien nodig om de gewenste gemiddelde arteriële druk te bereiken en/of vasospasmen tegen te gaan.
    2. Vasoconstrictie: Verdun 5 ml (50 mg) fenylefrine met 45 ml steriele zoutoplossing in een steriele beker en plaats deze in een spuit van 50 ml. Bewaar het mengsel in de koelkast van 4 °C en bolus indien nodig om de gewenste gemiddelde arteriële druk te behouden.
      OPMERKING: Dit is zelden vereist en reconstitutie kan worden weggelaten en alleen worden geïmplementeerd als dat nodig is.
  6. Kalibratie van druk- en debietsensoren
    1. Drukkalibratie: Kalibreer druksensoren zonder perfusaat te laten stromen. Sensoren die opnieuw nul zijn als de drukmeting niet nul is, weergegeven volgens de instructies van de fabrikant, terwijl het uiteinde van de slang open is voor lucht voor een druk van 0 mmHg. Zorg voor de juiste drukmetingen door zowel de proximale als de distale uiteinden van de slang voorzichtig te blokkeren om verhoogde druk te produceren.
    2. Stroomkalibratie: Kalibreer zodra het circuit perfusaat circuleert voorafgaand aan orgaanperfusie om een nauwkeurige meting te garanderen. Klem de slang distaal van de stromingssensoren vast om de stroom af te sluiten. Re-zero flowsensoren als een niet-zero debiet wordt weergegeven volgens de instructies van de fabrikant. Maak de slang los voor een debiet- en nauwkeurige debietmeting.

6. Verkrijging van lever

  1. Inkoop van varkens
    OPMERKING: Varkenslevers worden verkregen bij een plaatselijke slagerij in overeenstemming met de USDA-protocollen voor humane omgang met vee. De dissectie wordt geleid door het onderzoeksteam om infra- en suprahepatische vena cava en galwegen op te nemen.
    1. Steriliseer de lever met verdund jodium in een steriele zoutoplossing en plaats deze in een steriel bassin op ijs. Identificeer de poortader, de leverslagader, de superieure vena cava en de gemeenschappelijke galwegen, cannuleren en vastzetten met 4-0 zijden banden.
      OPMERKING: Het galkanaal wordt vaak gecannuleerd met een gefenestreerde angiokatheter vanwege de kleine diameter en om galobstructie van verschillende varkensgalsystemen te voorkomen.
    2. Spoel de gecanuleerde poortader en de leverslagader door met 3 l koude, steriele zoutoplossing (2 l PV: 1 l HA) gevolgd door 1 l oplossing voor het bewaren van koude organen (750 ml PV: 250 ml HA). Dompel de lever onder in de oplossing voor het bewaren van koude organen met ijs voor transport.
    3. Bereid het systeem voor zoals hierboven beschreven (stap 4.1) totdat aan de fysiologische parameters is voldaan.
    4. Dompel de gecanuleerde lever onder in verwarmde steriele zoutoplossing voor snelle opwarming en verwijdering van eventuele luchtembolieën. Sluit de juiste instroomslang aan op de poortader en de canules van de leverslagader. Titreer de pompsnelheid voor fysiologische debiet- en drukwaarden.
    5. Sluit de vena cava-canule aan op de uitstroomslang om de uitstroom naar het reservoir te vergemakkelijken om het circuit te voltooien.
    6. Laat de resterende gal van de galblaas leeglopen voordat u de slang van de spuit aansluit op de galkanaalcanule en een conische injectieflacon om deze op te vangen.
  2. Menselijke inkoop
    1. Bereid het systeem voor zoals hierboven beschreven (stap 4.1).
    2. Verkrijg menselijke monsters na geïndiceerde oncologische resecties volgens de standaardbehandeling. Meet in vivo debieten door middel van intraoperatieve echografie voor kalibratie op het ex vivo systeem. Identificeer de segmentale poortader, de leverslagader en de galwegen tijdens chirurgische dissectie. Transecteer de triade volgens de standaard chirurgische techniek en overhandig het monster van het operatieveld aan de steriele achtertafel.
    3. Identificeer en cannuleer de segmentale poortader, de leverslagader, de leverader en de galwegen, zet ze vast met 4-0 zijden banden of prolene-hechtdraad.
      OPMERKING: Laat de uitstroomcanulatie achterwege als het segment geen dominante uitstroomader heeft om congestieve hepatopathie te voorkomen. De uitstroom van het bekken fungeert dan als de leverader/IVC-uitstroomslang.
    4. Keer terug naar het ex vivo lab en weeg het monster. Dompel het monster onder in verwarmde steriele zoutoplossing en sluit de respectieve instroom-/uitstroomslangen aan. Sluit de galkanaalcanule aan op de slang van de spuit voor afvoer op de conische injectieflacon.
    5. Begin met de perfusie- en titreerpompstroom voor de gewenste debiet- en drukperfusieparameters.

7. Titratie van perfusieparameters

  1. Bemonstering van perfusaat uit prehepatische (HA- en PV-zijcircuits) en posthepatische (IVC of bekkenuitstroom) claven op verschillende tijdstippen voor titratie van perfusieparameters op basis van point-of-care bloedgas-, elektrolyt- en hematocriet- en hemoglobinewaarden.
  2. Kalibreer de CDI-sensoren tijdens de perfusie met behulp van de handmatige monsteranalyses.
  3. Pas de in- en uitstroom van hemodialyse dienovereenkomstig aan om de volumestatus en hematocrietconcentratie van 30-40% te behouden en eventuele metabole en elektrolytenstoornissen te corrigeren.
  4. Doseer handmatig aliquots van 5% dextrose, vrij water, 8,4% natriumbicarbonaat en 0,9% NaCl indien nodig om elektrolytafwijkingen te corrigeren.

8. Varianten van het perfusiecircuit

  1. Aanpassing van het vervoer
    1. Sluit de pompen tijdens de run aan op een mobiele stroombron om continue perfusie op weg naar het beeldvormingsapparaat te vergemakkelijken. Steek de mobiele stroombron in het stopcontact om de externe batterij tijdens perfusie op te laden.
    2. Haal de stekker van de mobiele stroombron uit het stopcontact zodra het perfusie-experiment is voltooid.
    3. Koppel de gastoevoer naar oxygenatoren los. Klem het hemodialyse-zijcircuit af en koppel de bloedtoevoer naar het filter los. Stop dialysepompen.
    4. Verwijder de debietsensoren uit de instroomslang. Koppel de infusies van medicijnen los en sluit de kranen af. Koppel de druksensoren los van de invoer-/uitvoerstekker.
    5. Verplaats de drumtrechter en slangen voorzichtig naar de mobiele wagen, die nu een onafhankelijke eenheid is en naar de beeldvormingssuite kan worden getransporteerd.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Representatieve varkensloopbanen
Hele varkenslevers werden verkregen van een plaatselijke slager voor kostenefficiëntie en geperfundeerd voor verschillende optimalisatie- en testfasen van machineontwikkeling (aanvullende tabel 1). De eerste 24 uur van drie representatieve leverruns worden hier geëvalueerd (Figuur 2). De gemiddelde arteriële leverdruk was 80 mmHg ± 11 mmHg en de gemiddelde portale veneuze druk was 7,1 mmHg ± 3,3 mmHg met debieten van respectievelijk 107 ml/min ± 102 ml/min en 501 ml/min ± 329 ml/min. De grote standaarddeviaties voor druk en stromingen correleren met het grote verschil in levergrootte, met varkens variërend van 50 lbs. tot 350 lbs. De dubbele instroomcircuits maken fysiologische zuurstofverschillen mogelijk met een gemiddelde arteriële verzadiging (SO2) van 95 ± 7,4% vergeleken met een gemiddelde portale veneuze SO2 van 85 ± 13% (p < 0,001). De SO2-uitstroom uit de leveraders was 74 ± 18%, indicatief voor zuurstofverbruik (p < 0,01), en perifere pH-metingen lagen binnen fysiologische bereiken van 7,2 ± 0,09. Aanvullende fysiologische parameters zoals totaal hemoglobine (9 ± 2,5 g/dl), hematocrietspiegels (28,3 ± 6,4%), glucosespiegel (477 ± 15 mg/dl) en veranderingen in lactaat (3,0 ± 2,5 mmol) en kalium (-0,77 ± 2,3 mmol) werden tijdens de perfusie gecontroleerd door middel van bemonstering met regelmatige tussenpozen. Voor varkensperfusies was de galproductie een indicatie van de levensvatbaarheid van organen. De galblaas werd handmatig geleegd zodra het orgaan normotherm werd en de gemeenschappelijke galwegen werden bevestigd aan een klein buisje voor verzameling. De totale galproductie tijdens de perfusie bedroeg 41 ± totaal van 6,9 ml, met een snelheid van 6,9 ± 4,0 ml/uur.

figure-results-1
Figuur 2: Perfusaatmetriek tijdens leverperfusie bij varkens (n = 3). (A) Gemiddelde bloedinstroomsnelheid (ml/min) van de leverslagader en poortader in de loop van de tijd. (B) Gemiddelde bloedinstroomdruk (mmHg) van de leverslagader en poortader in de loop van de tijd. (C) Vergelijking van het percentage RBC O 2-verzadiging tussen leverslagader, poortader en inferieure vena cava die zuurstofverschil aantonen tussen dubbele instroom en zuurstofverbruik in de uitstroom. Er werden statistisch significante verschillen vastgesteld tussen de poortader en de arteriële verzadiging (p < 0,0001), de poortader en IVC-verzadiging (p < 0,01) en de arteriële en IVC-verzadiging (p < 0,0001). (D) Evaluatie van de pH van het bloed tussen leverslagader, poortader en inferieure vena cava. (E) Hematocriet- (%) en hemoglobinespiegels (g/dL) (boven) tijdens perfusie, naast verandering in PV-kalium (mmol) (onder) als marker van hemolyse. (F) Reservoirglucosespiegels die de gemiddelde circuitglucose (mg/dL) gedurende perfusie weerspiegelen. (G) Verandering in lactaatspiegel (mg/dL) tijdens perfusie in vergelijking met tijd 0 lactaatwaarden in instroom van de leverslagader, IVC-uitstroom en systeemperfusaat. (H) Galproductie (ml) in de loop van de tijd tijdens perfusie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Representatieve menselijke runs
Drie tumordragende menselijke leversegmenten werden geperfundeerd, met een perfusieduur variërend van 48-72 uur, afhankelijk van de vereisten van het experiment (Figuur 3). Om de gegevens tussen representatieve applicatieruns te vergelijken, evalueerden we de eerste 48 uur van biochemische waarden. Perfusie benaderde in vivo parameters met continue lagedruk, portale veneuze instroom met hoog volume en pulserende arteriële instroom onder hoge druk en laag volume, die in realtime worden weergegeven om eenvoudige titratie mogelijk te maken. Als de lever binnen twee uur na perfusie geen fysiologische biochemische waarden bereikte, werd het experiment beëindigd. Voor succesvolle leverperfusies was de gemiddelde arteriële hepatische druk 84 mmHg ± 11 mmHg en de gemiddelde portale veneuze druk 9 mmHg ± 4 mmHg met debieten van respectievelijk 113 ml/min ± 66 ml/min en 317 ml/min ± 302 ml/min. De dubbele instroomcircuits maken fysiologische zuurstofverschillen mogelijk met een gemiddelde arteriële verzadiging (SO2) van 98% ± 3% vergeleken met een gemiddelde portale veneuze SO2 van 92% ± 7% (p < 0,0001). De SO2 van de uitstroom uit de leveraders was 86% ± 9%, indicatief voor zuurstofverbruik (p < 0,0001), en pH-metingen in het hele systeem lagen binnen fysiologische bereiken van 7,3 ± 0,09. Aanvullende fysiologische parameters zoals totaal hemoglobine (10,2 g/dL ± 1,6 g/dL), hematocrietspiegels (30,2% ± 5,5%), glucosespiegel (170 mg/dL ± 68 mg/dL) en veranderingen in lactaat (3,6 mmol/L ± 2,2 mmol/L) werden tijdens de perfusie gecontroleerd door bemonstering met regelmatige tussenpozen. In een representatieve run werd gemiddeld 1,4 ml/h gal geproduceerd. Voorafgaand aan en aan het einde van de perfusie-experimenten werden biopsieën afgenomen voor weefselanalyse. Representatieve weefselcoupes tonen leverparenchym, gemetastaseerde neuro-endocriene tumor en gemetastaseerd colorectaal adenocarcinoom na perfusie.

figure-results-2
Figuur 3: Perfusaat- en weefselmetriek tijdens perfusie van humane leversegmenten (n = 3). (A) Gemiddelde perfusaatinstroomsnelheid (ml/min) voor de leverslagader en poortader. (B) Gemiddelde perfusaatinstroomdruk (mmHg) voor de leverslagader en de poortader in de loop van de tijd. (C) Zuurstofverzadiging van rode bloedcellen (%) voor de instroom van de leverslagader, de instroom van de poortader en de uitstroom van de leverader. Er werden statistisch significante verschillen vastgesteld tussen de poortader en arteriële verzadiging (p < 0,0001), de poortader en IVC-verzadiging (p < 0,0001) en de arteriële en IVC-verzadiging (p < 0,0001). (D) Perfusaat pH voor de instroom van de leverslagader, de instroom van de poortader en de uitstroom van de leverader. (E) Metriek van rode bloedcellen tijdens perfusie, inclusief gemiddelde hematocriet (%) en hemoglobine (g/dL) perfusaatspiegels (boven) met verandering in perfusaatkalium (mmol) vanaf baseline in de loop van de tijd (onder). (F) Gemiddelde glucoseconcentratie (mg/dL) voor de instroom van de leverslagader, de instroom van de poortader en de uitstroom van de leverader in de loop van de tijd. (G) Verandering in perfusaatlactaatconcentratie (mg/dL) ten opzichte van baseline in de loop van de tijd voor de instroom van leverslagader, uitstroom leverader en systemisch perfusaat. (H) Galproductie (ml) in de loop van de tijd. (I) Menselijke leversegmenten (Couinaud II-IV) tijdens (links) en na perfusie (rechts) die een gebrek aan druknecrose aantonen na systeemoptimalisatie. Oppervlakkig gebied van cauterisatie aanwezig bovenaan de linker afbeelding als gevolg van intraoperatieve hemostase. (J) Weefselsectie na perfusie die leverparenchym aantoont (hematoxyline- en eosinekleuring, 10x, inzet 40x; schaalbalk 50 μM). (K) Weefselsectie na perfusie die gemetastaseerde neuro-endocriene tumor aantoont (hematoxyline- en eosinekleuring, 10x, inzet 40x; schaalbalk 250 μM). (L) Weefselsectie na perfusie die gemetastaseerd colorectaal adenocarcinoom aantoont (hematoxyline- en eosinekleuring, 10x, inzet 40x; schaalbalk 50 μM). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Representatieve toepassing: CT-beeldvorming van geperfundeerd monster
De mogelijkheid om klinische gegevensbronnen zoals computertomografie (CT) of magnetische resonantie (MR) beeldvorming te integreren met pathologie zal gepersonaliseerde diagnostiek en geneeskunde bevorderen. Pathologierapporten zijn echter samenvattende bevindingen en de heterogeniteit die inherent is aan solide tumoren overtreft ruimschoots de menselijke mogelijkheden voor afbakening. Een mogelijke oplossing is om ex vivo beeldvorming uit te voeren, gevolgd door onmiddellijke voorbereiding van weefselcoupes op macroschaal om radiomische integratie van ruimtelijk bewarende cellulaire gegevens mogelijk te maken (bijv. ruimtelijke transcriptomics, sterk multiplex-immunofluorescentie). Om conventionele beeldvorming op het systeem mogelijk te maken, werd een mobiele opstelling gebouwd, inclusief het overschakelen van pompen naar een externe batterijbron om ongestoorde stroom te leveren tijdens transport en beeldvorming (Figuur 4A). Met de lever op de CT-tafel werd jodiumhoudend contrast toegediend en werden beelden verkregen die consistente radiografische kenmerken vertonen met die verkregen in vivo (Figuur 4B).

Representatieve toepassing: Perfusie van nieren en alvleesklier
Het systeem is aangeboren in zijn ontwerp en kan worden aangepast aan de perfusie van extra organen (Figuur 4C-F), waardoor dubbele instroom niet nodig is en daardoor de kosten per gebruik worden verlaagd. Om dit aan te tonen, hebben we het portale veneuze circuit voor een enkele arteriële instroom verwijderd (aanvullende figuur 2) en een menselijke nier (figuur 4C) en een menselijke gedeeltelijke alvleesklier geperfundeerd (figuur 4E). Representatieve weefselcoupes na perfusie tonen glomeruli (Figuur 4D) en eilandjes van Langerhans (Figuur 4F).

figure-results-3
Figuur 4 : Representatieve toepassing van perfusiemachines: CT-beeldvorming en orgaanmodulariteit. (A) Mobiele aanpassing van het systeem voor transport. (B) Representatieve CT-beelden van de lever met tumor na toediening van gejodeerd contrastmiddel in vivo (boven) en ex vivo na perfusie (onder). (C) Menselijke nierperfusie op de opnieuw geconfigureerde machine voor enkelvoudige instroom. (D) Weefselcoupe na perfusie toont nierglomeruli en verzamelkanalen (hematoxyline- en eosinekleuring, 8x; schaalbalk 250 μm). (E) Perfusie van de menselijke distale alvleesklier op de opnieuw geconfigureerde machine voor enkelvoudige instroom. (F) Weefseldoorsnede na perfusie toont pancreaseilandjes (hematoxyline- en eosinekleuring, 8x; schaalbalk 250 μm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Python-code-instellingen om semi-geautomatiseerde perfusie mogelijk te maken. Schema met de invoer- en uitvoerparameters die door de code worden gebruikt en die semi-automatisering mogelijk maken met de toevoeging van veelgebruikte handmatige aanpassingen (tabel). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Enkelvoudig instroomschema gebruikt voor nier- en pancreasperfusie. P/F-sensor: Druk- en debietsensoren. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 3: Optimalisatie van rode bloedcellen. (A) Een perfusie-experiment met alleen bloed toonde significant minder hemolyse aan bij lage RPM-omstandigheden in vergelijking met hoge RPM-omstandigheden (p < 0,01) met plasmavrij hemoglobine als surrogaat voor cellyse. (B) Kwalitatieve vergelijking van plasmahemolyse in de loop van de tijd toont visueel minder hemolyse aan in lage RPM-toestanden in vergelijking met hoge RPM-toestanden. (C-F) Evaluatie van hemolyse in systemen met verschillende niveaus van resistentie en bekkenintegratie met plasmasurrogaten: (C) Er werd een significant verschil in lactaatspiegels vastgesteld tussen de opstelling van het parallelle circuit en zowel de gesloten als de bekkenopstelling (respectievelijk p < 0,0001 en p < 0,0001). (D) Er werd een significant verschil in kaliumspiegels vastgesteld tussen de opstelling van het parallelle circuit en zowel de serie gesloten als de serie met bekkenopstelling (respectievelijk p < 0,0001 en p < 0,0001). (E) Er werd een significant verschil in hematocrietniveaus vastgesteld tussen de opstelling van het parallelle circuit en zowel de serie gesloten als de serie met bekkenopstelling (respectievelijk p < 0,0001 en p < 0,0001). (F) Er werd een significant verschil in hemoglobinegehalte vastgesteld tussen de opstelling van het parallelle circuit en de serie gesloten en de serie met een bekkenopstelling (respectievelijk p < 0,0001 en p < 0,0001). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 1: Perfusies voor optimalisatie van varkensorganen. Vijfendertig experimenten met varkensperfusie uitgevoerd tijdens optimalisatiefasen, waaronder 25 gedeeltelijke levers, 2 nieren en 8 hele levers. Inbegrepen zijn de duur van de perfusie en de reden van beëindiging. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 2: Validatie van de menselijke lever en toedieningsperfusies. Veertien menselijke gedeeltelijke leverperfusies, waaronder formele linker- en rechterhepatectomieën tot perfusie-experimenten met één segment. Inbegrepen zijn pathologie, experimenteel doel, perfusieduur en reden voor beëindiging. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 3: Optimalisatie met alleen parfumeren. Tweeëntwintig optimalisatieruns met alleen parfumeren, waaronder soorttype, experimenteel doel, duur van het experiment en reden voor beëindiging. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Normoederische perfusiemachines die vaak worden gebruikt voorafgaand aan transplantatie van vaste organen hebben aanzienlijke vooruitgang geboekt in ex vivo perfusie. Hoewel het gebruik ervan met gedeeltelijke organen in sommige gevallen technisch haalbaar is 7,8,9, blijven ze ontoegankelijk voor de onderzoeker vanwege de hoge kosten en beperkte beschikbaarheid. In dit werk hebben we geprobeerd een vergelijkbaar, open-source alternatief te bieden voor de grotere onderzoeksgemeenschap door het gebruik van gemakkelijk te verkrijgen componenten en vrij toegankelijke code om het systeem te laten draaien voor een breed scala aan onderzoekseindpunten.

Verschillende stappen binnen het protocol zijn essentieel voor het bereiken van een stabiele orgaanperfusie. Een van de meest kritische stappen is een effectieve drukontlasting om parenchymale collaps en sinusvormige dilatatie te voorkomen. Dit werd bereikt door traagschuim te implementeren dat werd ondersteund door een oscillerend diafragma om het orgaangewicht gelijkmatig te verdelen en de bijna-atmosferische poortdruk te behouden voor voldoende drainage. Het eerste gebruik van een metalen rooster om de lever te ondersteunen, resulteerde in parenchymale collaps en sinusvormige congestie, zoals waargenomen in histologische analyse en echografie tijdens perfusie. Dit werd gedeeltelijk opgelost door over te stappen op een geperforeerde siliconen hangmat. Hoewel de grove druknecrose was opgelost, was er nog steeds opmerkelijk bewijs van parenchymale collaps, zoals blijkt uit hoge poortaderdrukken en aanzienlijk overbelaste exemplaren na 48 uur perfusie. Er werd ook geprobeerd de lever onder te dompelen in zoutoplossing of bloed en dit was succesvol bij het verlichten van congestie en portale hypertensie; Het was echter niet haalbaar vanwege de grote hoeveelheid perfusaat die nodig was, de moeilijkheid om de steriliteit te handhaven en het gebrek aan efficiënte afvoer in het reservoir. In vergelijking met de drijftechniek zagen we dezelfde bijna-atmosferische poortdruk wanneer de lever op een traagschuimkussen met een oscillerend diafragma werd geplaatst om het gewicht gelijkmatiger te verdelen (Figuur 1B en Figuur 3I). Dit ontwerp resulteert in zachtere, beter doorbloede segmenten, terwijl de bloeduitstroom uit het monster nog steeds gemakkelijk en efficiënt kan worden afgevoerd.

Een tweede cruciale stap is het minimaliseren van de circuitweerstand die schuifspanning op rode bloedcellen geeft om hemolyse te voorkomen. Dit werd bereikt door de introductie van zijcircuits met beperkende componenten om de fysiologische stroming te vergemakkelijken zonder het perfusaat aan onnodige druk bloot te stellen. Hemolyse is een onvermijdelijk en continu proces tijdens machineperfusie. In vroege iteraties van het systeem leverde uitgebreide hemolyse een belangrijke bijdrage aan vroegtijdige beëindiging. De schuifspanning die het systeem op de rode bloedcellen uitoefent, is voornamelijk afkomstig van de pompen als gevolg van perfusaatstasis en recirculatie, naast smalle diameters van buizen en membranen. De pompen die momenteel worden gebruikt, veroorzaken een zekere mate van hemolyse, die in de loop van de tijd toeneemt. Pompefficiëntie is een belangrijke factor bij hemolyse, aangezien hogere debieten gunstig kunnen zijn als gevolg van lagere bloedrecyclingsnelheden en secundaire debiet, verzacht door een groter volume perfusaat en/of lagere pompsnelheden. Omdat grote hoeveelheden pRBC's vaak moeilijk te verkrijgen zijn, hebben we onze inspanningen gericht op het herontwerpen van het systeem om fysiologische debieten te leveren bij lagere pompsnelheden, waardoor de weerstand in het circuit in totaal lager is31. Om de intrinsieke weerstand van het circuit verder te verminderen, hebben we zijcircuits parallel geïntegreerd, wat resulteerde in lagere lactaat- en kaliumspiegels en hogere hematocriet- en hemoglobinespiegels in de loop van de tijd (aanvullende figuur 3). Ten slotte is de huidige hemofilter geïntegreerd in het zijcircuit van de poortader met bloed dat wordt aangedreven door een peristaltische pomp die een aanzienlijke hoeveelheid hemolyse verleent als gevolg van opmerkelijke weerstand en schuifspanning die wordt veroorzaakt door zowel het filter als de pomp. Een van onze huidige optimalisatie-inspanningen is gericht op het verwijderen van dit zijcircuit door de mogelijke implementatie van hemodialyseslangen in het reservoir te onderzoeken. Verwijdering van de hemofilters van klinische kwaliteit zou het mogelijk maken om de peristaltische pomp vervolgens te verwijderen, de hemolyse verder te minimaliseren en de totale kosten van het systeem te verlagen.

Ondanks het nut en het aanpassingsvermogen van het hier beschreven systeem, moeten beperkingen worden erkend. Met name de duur van levensvatbare perfusie reproduceerbaar 3-4 dagen. Hemolyse blijft een centrale factor die de levensduur van perfusie beperkt, zoals hierboven besproken. We ontdekten echter dat een aanzienlijk groter totaal perfusaatvolume de perfusieduur aanzienlijk kan verlengen als langere perfusietijden nodig zijn, maar dit verhoogt het gebruik van hulpbronnen verder dan wat we hier beschrijven. De optimale perfusieduur zal uiteindelijk afhangen van de specifieke experimentele vraag die aan het systeem wordt gesteld. Studies naar de kinetiek van de medicijnafgifte of remming van de route kunnen bijvoorbeeld effectief worden uitgevoerd gedurende 2-12 uur, terwijl vragen met betrekking tot celrekrutering in de micro-omgeving van de tumor 48 uuren 32 uur kunnen vereisen. Het verlengen van de levensvatbaarheid buiten het huidige venster kan belangrijk zijn voor toepassingen zoals extracellulaire matrixremodellering (d.w.z. fibrose), maar we zijn van mening dat de meeste kankergerelateerde toepassingen de extra uitgaven niet zullen vereisen. De primaire focus lag op oncologie-georiënteerde translationele toepassingen, gericht op het handhaven van menselijke tumoren in een gecontroleerde ex vivo omgeving waarin therapie kan worden toegediend via intact parenchym en tumorvasculatuur, aandoeningen die de complexiteit van in vivo scenario's beter repliceren25. In dit scenario pakt het systeem al lang bestaande problemen aan in de huidige preklinische oncologiemodellen met betrekking tot medicijnafgifte, tumorheterogeniteit en geneesmiddelmetabolisme, wat het frequente falen kan verklaren om preklinisch succes te vertalen in klinische werkzaamheid33,34.

In vergelijking met bestaande commerciële machines biedt het systeem aanzienlijke kostenvoordelen, modulaire schaalbaarheid en experimentele flexibiliteit. Commerciële apparaten zijn vaak gepatenteerd, kostbaar en geoptimaliseerd voor volledige orgaanperfusie in transplantatieomgevingen. Het systeem is schaalbaar op een manier die commerciële machines niet zijn, zodat we ons de toepasbaarheid ervan breed kunnen voorstellen. Het systeem dat hierin wordt gepresenteerd, is geen eindproduct, maar eerder een blauwdruk, die kan worden gewijzigd, aangepast en hergebruikt om te passen bij een breed scala aan onderzoeksinteresses en experimentele vragen, en een leegte opvult voor wetenschappers in vele disciplines.

Toekomstige richtingen voor dit platform zijn onder meer het verkleinen naar subsegmentale leversegmenten en perfusaatvolume om het gebruik van autologe bloedproducten mogelijk te maken ter ondersteuning van immuno-oncologische toepassingen. We werken ook aan de integratie van multi-omics-platforms en real-time beeldvorming om dynamische monitoring van de behandelingsrespons te bieden, wat de weg vrijmaakt voor gedetailleerde farmacologische studies. We hopen dat het systeem samenwerking en innovatie zal aanmoedigen in een poging om nieuwe diepten van kennis te smeden op meerdere gebieden van de translationele wetenschap.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs rapporteren geen belangenconflicten in deze studie en de bevindingen. Het onderzoek dat in deze publicatie wordt gerapporteerd, werd ondersteund door het intramurale onderzoeksprogramma van de National Institutes of Health. Financieringsbron voor de beeldvorming van het monster en voorlopige radiomics ondersteund door de Research Award for Staff Clinicians Proposal ID 231145 aan Elliot Levy.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen graag hun waardering uitspreken voor de ondersteuning van dit project aan de volgende groepen: NIH Department of Transfusion Medicine, NIH Department of Perioperative Medicine, NIH Department of Pathology, Wagner's Meats.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" Wall Versilon  C-219-A Flexible PVC TubingUS Plastic Corp57682
10 cc Syringes with BD Luer-Lock TipBD302995
1cc Syringes with BD Luer-Lock TipBD309628
25 Fr Portal CannulaXVIVO11.01.520
3D Printed Flow Sensor Holdern/an/azie GitHub voor SDL-bestanden
3D Printed Magnet Holdern/an/azie GitHub voor SDL-bestanden
48 in. H x 24 in. W White PegboardHome Depot109099
4-Way Stopcock, Yellow, 2 Female Luer Locks, Male Luer with Spin LockWorld Precision Instruments14057-10
50 cc Syringes with BD Luer-Lock TipBD309653
ACF00023 Tygon S3  by Saint Gobain | 5/16" I.D. x 1/2" O.D. x 3/32" Wall | E-3603 Non-DEHP | Phthalate-Free Lab Tubing | 50' Package LengthHose WarehouseACF00023
AmphotericinVeterinary Pharmacyn/ahttps://mms.mckesson.com/product/505635/Xgen-Pharmaceuticals-39822105505
Barbed fitting, Y-connector, 3/8" Tube ID, PP, 5/PKVWRMFLX06368-24materiaaltype niet kritiek
CDI 540 CalibratorTerumo540CL
CDI Cable Head BracketTerumoCDI519CL
CDI MonitorTerumo500AVHCTCL
CDI Pole ClampTerumoCDI517CL
Clave IV Tubing Connector Needleless 100/CaHenry Schein Dental1097422
Clinimix with ElectrolytesBaxter2B7721gebruik alleen de aminozuurkant, niet mengen met de dextrosekant
CO2 USP Grade 50 LBRobert's OxygenR25
Computer Monitors for GUI n/an/aelke soort scherm voor GUI-weergave
Data Acquisition DeviceMeasurement ComputingUSB-2022 of 3 nodig, afhankelijk van hoe de machines zijn aangesloten
Desktop Power Supply for PumpLevitronix100-400152 nodig, een voor HA en een voor PV
Eagle 1662 Drum Funnel with Brass Screen, 18" Diameter x 7" Height, YellowGlobal IndustrialWB440139
EpoprostenolVeterinary Pharmacyn/ahttps://mms.mckesson.com/product/1239813/Sun-Pharmaceuticals-62756005940
Female Luer ¼" barb in natural nylon cleanroom manufactured; 10 packVWRMFLX40314-26materiaaltype niet kritiek
Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hosebarb Adapters, 1/8" ID; 25/PKVWRMFLX30800-08materiaaltype niet kritiek
Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Hosebarb Adapter, 1/8" ID; 25/PKVWRMFLX30800-18materiaaltype niet kritiek
Fitting, PVDF, Straight, Hose Barb Reducer, 5/16" ID x ¼" ID; 10/PKVWRMFLX40614-62materiaaltype niet kritiek
Flow Mounts n/an/azie GitHub voor SDL-bestanden
Flow Sensor ClampKeyenceFD-XC20R1
Flow Sensor ControllerKeyenceFD-XA1
Flow Sensor HeadKeyenceFD-XS20
Flow Sensor Power SupplyKeyenceMS2-H50
Gas Blender MCQGB100+22 nodig, een voor HA en een voor PV
Gas Bottle A, CDI 500TerumoCDI506
Gas Bottle B, CDI 500TerumoCDI507
Glucagon Kit, Glucagon 1 mg, Sterile Water 1 mL, VialFresenius0593-03
H/S CUVETTE 1/4x1/4 W/6" EXT 1CA=10EA 70-2006-4298-4Terumo6934
Hardshell Reservoir with 150 µm filterHaemonetics Corporation00205-00
Heat Cold Pad, Mul-T-Pad, TP12E Pad Size 13" x 18" for Gaymar TP700 PumpMul-T-Pad8002-062-012https://www.amazon.com/Heat-Cold-Mul-T-Pad-Gaymar-TP700/dp/B00HFF7876. Of  opmerking, stryker levert ook soortgelijke verwarmde watermantels naar de "Mul-T-Pad C2Dx 8002-062-012"
InsulinVeterinary Pharmacyhttps://mms.mckesson.com/product/294668/Novo-Nordisk-Pharmaceutical-00169183311
Ismatec Model Ecoline Pump VC-280 IIIsmatecISM1078B-115
LTV 1200 Pediatric VentilatorCarefusionhttps://coastbiomed.com/product/carefusion-ltv-1200-ventilator/?srsltid=AfmBOopSCKwTLmKhZXcI
CgGQHfiKwj__78jNWxVaznJCS
aq3RjXw2E-H.
Deze modelpediatrische ventilator is herbestemd vanuit ziekenhuisoverschot en is niet aangeschaft. Elke commerciële intermitterende pomp of beluchtingsmachine is een geschikte vervanging.
Main Pump CableLevitronix190-103312 nodig, een voor

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Akateh, C., Beal, E. W., Whitson, B. A., Black, S. M. Normothermic ex-vivo liver perfusion and the clinical implications for liver transplantation. J Clin Transl Hepatol. 6 (3), 276-282 (2018).
  2. Eymard, C., Markmann, J. Normothermic ex vivo liver perfusion: Platform for liver graft assessment and therapeutic modification. Organogenesis. 14 (4), 169-171 (2018).
  3. Weissenbacher, A., Vrakas, G., Nasralla, D., Ceresa, C. D. L. The future of organ perfusion and re-conditioning. Transpl Int. 32 (6), 586-597 (2019).
  4. Rijkse, E., Jn, I. J., Minnee, R. C. Machine perfusion in abdominal organ transplantation: Current use in the netherlands. World J Transplant. 10 (1), 15-28 (2020).
  5. Hameed, A. M., Pleass, H. C., Wong, G., Hawthorne, W. J. Maximizing kidneys for transplantation using machine perfusion: From the past to the future: A comprehensive systematic review and meta-analysis. Medicine (Baltimore). 95 (40), e5083(2016).
  6. Eshmuminov, D., et al. An integrated perfusion machine preserves injured human livers for 1 week. Nat Biotechnol. 38 (2), 189-198 (2020).
  7. Mueller, M., et al. Long-term normothermic machine preservation of partial livers: First experience with 21 human hemi-livers. Ann Surg. 274 (5), 836-842 (2021).
  8. Lau, N. S., et al. Prolonged ex vivo normothermic perfusion of a split liver: An innovative approach to increase the number of available grafts. Transplant Direct. 7 (10), e763(2021).
  9. Hoffman, J., et al. innovative models to study ischemia/reperfusion-related redox damage in organ transplantation. Antioxidants. 12 (1), 31(2023).
  10. Kanani, T., et al. Development of a novel ex vivo porcine hepatic segmental perfusion proof-of-concept model towards more ethical translational research. Cureus. 15 (2), e35143(2023).
  11. Kanani, T., et al. A narrative review of the applications of ex-vivo human liver perfusion. Cureus. 15 (2), e34804(2023).
  12. Magbagbeola, M., et al. An adaptable research platform for ex vivo normothermic machine perfusion of the liver. Int J Comput Assist Radiol Surg. 18, 1101-1108 (2023).
  13. Riveros, S., et al. Implementation and design of customized ex vivo machine perfusion. Analysis of its first results. Artif Organs. 46 (2), 210-218 (2021).
  14. Raigani, S., et al. Viability testing of discarded livers with normothermic machine perfusion: Alleviating the organ shortage outweighs the cost. Clin Transplant. 34 (11), e1469(2020).
  15. Martins, P. N., et al. analysis, and pitfalls of clinical trials using ex situ liver machine perfusion: The international liver transplantation society consensus guidelines. Transplantation. 105 (4), 796-815 (2021).
  16. Yeh, H., Uygun, K. Increasing donor liver utilization through machine perfusion. Hepatology. 70 (1), 431-433 (2019).
  17. Wehrle, C., et al. Impact of back-to-base normothermic machine perfusion on complications and costs: A multi-center, real-world risk-matched analysis. Ann Surg. 280 (2), 300-310 (2024).
  18. Handley, T. J., Arnow, K. D., Melcher, M. L. Despite increasing costs, perfusion machines expand the donor pool of livers and could save lives. J Surg Res. 283, 42-51 (2023).
  19. Pettit, S. J., Petrie, M. C. Transplantation of hearts donated after circulatory-determined death a song of fire and ice. Circ Heart Fail. 12 (4), e005991(2019).
  20. Zimmerman, J., Carter, A. W. Cost-utility analysis of normothermic and hypothermic ex-situ machine perfusion in liver transplantation. Br J Surg. 109, e31-e32 (2022).
  21. Javanbakht, M., Mashayekhi, A., Trevor, M., Branagan-Harris, M., Atkinson, J. Cost-utility analysis of normothermic liver perfusion with the organox metra compared to static cold storage in the United Kingdom. J Med Econ. 23 (11), 1284-1292 (2020).
  22. Webb, A. N., Izquierdo, D. L., Eurich, D. T., Shapiro, A. M. J., Bigam, D. L. The actual operative costs of liver transplantation and normothermic machine perfusion in a Canadian setting. Pharmacoecon Open. 5, 311-318 (2021).
  23. Webb, A. N., Lester, E. L. W., Shapiro, A. M. J., Eurich, D. T., Bigam, D. L. Cost-utility analysis of normothermic machine perfusion compared to static cold storage in liver transplantation in the canadian setting. Am J Transplant. 22 (2), 541-551 (2022).
  24. Marshall, L. J., Bailey, J., Cassotta, M., Herrmann, K., Pistollato, F. Poor translatability of biomedical research using animals - a narrative review. Altern Lab Anim. 51 (2), 102-135 (2023).
  25. Loewa, A., Feng, J. J., Hedtrich, S. Human disease models in drug development. Nat Rev Bioeng. , (2023).
  26. S.5002 - FDA Modernization Act 2.0. , Food and Drug Administration. At https://www.congress.gov/bill/117th-congress/senate-bill/5002 (2022).
  27. Eshmuminov, D., Clavien, P. A. Long-term dynamic ex vivo organ preservation. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 20 (5), 267-268 (2023).
  28. Lascaris, B., Hoffmann, R. F., Nijsten, M. W. N., Porte, R. J., De Meijer, V. E. Continuous renal replacement therapy during long-term normothermic machine perfusion of human donor livers for up to 7 D. Transplant Direct. 10 (2), e1568(2024).
  29. Huang, J., et al. Incorporating a hemodialysis filter into a commercial normothermic perfusion system to facilitate long-term preservation of human split-livers. Artif Organs. 48 (9), 1008-1017 (2024).
  30. Clarke, G., et al. A reproducible extended ex-vivo normothermic machine liver perfusion protocol utilising improved nutrition and targeted vascular flows. Commun Med (Lond). 4 (1), 214(2024).
  31. Gross-Hardt, S., et al. Low-flow assessment of current ECMO/ECCO2R rotary blood pumps and the potential effect on hemocompatibility. Crit Care. 23 (1), 348(2019).
  32. Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. (73), e50088(2013).
  33. Gutmann, D. H., et al. Precision pre-clinical modeling to advance cancer treatment. J Natl Cancer Inst. 117 (4), 586-594 (2025).
  34. Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. Estimation of clinical trial success rates and related parameters. Biostatistics. 20 (2), 273-286 (2019).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Ex vivo perfusieOrgaanperfusieOnderzoek naar menselijke organenTumormicro omgevingInstallatie van perfusiemachinePerfusie van varkensleverHemodialysesysteemCT beeldvorming

Gerelateerde artikelen