In kaart brengen van disfunctionele eiwit-eiwitinteracties bij ziekte

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om het vastleggen en identificeren van ziektespecifieke eiwit-eiwitinteracties van natuurlijke cellen en weefsels mogelijk te maken met behulp van chemische sondes en massaspectrometrie. De resulterende interactiedatasets worden geanalyseerd via een speciaal webgebaseerd platform om dynamische netwerkdisfuncties en routeveranderingen die verband houden met ziekte aan het licht te brengen.

Samenvatting

Eiwit-eiwitinteractie (PPI) -netwerken worden dynamisch gehermodelleerd bij ziekte, maar de meeste systeembiologische benaderingen richten zich op veranderingen in eiwitovervloed, waarbij kritieke disfunctie op interactieniveau over het hoofd wordt gezien. Hier presenteren we een robuuste, chemoproteomische methode - disfunctioneel eiwit-eiwitinteractoom (dfPPI) - die het mogelijk maakt om high-throughput, systematische, ziektecontextuele mapping van PPI-netwerkdisfuncties in cellen en primair menselijk weefsel mogelijk te maken. Deze methode integreert chemische biologische sondes die selectief op epichapelwerk gebaseerde interactoomassemblages vastleggen met labelvrije vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS) en netwerkgebaseerde computationele analyse, om de herbedrading van eiwitnetwerken bloot te leggen die niet alleen uit transcriptomische of proteomische gegevens blijkt. Het dfPPI-platform kan worden toegepast op ziektetoestanden, soorten en weefsels om bruikbare knooppunten van disfunctie te identificeren en inzichten op systeemniveau met hoge resolutie in ziekteprogressie mogelijk te maken. In dit protocol demonstreren we stapsgewijze procedures voor monstervoorbereiding, behandeling van chemische sondes, affiniteitsverrijking, labelvrije LC-MS/MS-analyse en bio-informaticaworkflows die worden gebruikt om dfPPI-datasets te genereren en te interpreteren. Dit artikel heeft tot doel de reproduceerbaarheid en toegankelijkheid van deze benadering te bevorderen en de acceptatie ervan door de bredere systeembiologie- en translationele onderzoeksgemeenschappen te ondersteunen.

Inleiding

De functie van cellen, en bij uitbreiding organismen, hangt af van de precieze coördinatie van eiwit-eiwitinteractie (PPI)-netwerken ^1,2. Deze netwerken zijn verantwoordelijk voor het organiseren en uitvoeren van bijna alle biologische processen. Hoewel PPI-netwerken inherent dynamisch zijn en reageren op stress, kunnen ze bij ziekte abnormaal opnieuw bedraad raken, wat leidt tot onaangepaste functies. Belangrijk is dat deze herbedrading niet noodzakelijkerwijs veranderingen in gen- of eiwitexpressie met zich meebrengt; Het komt eerder voort uit veranderde fysieke interacties tussen eiwitten die anders normaal tot expressie komen ^3,4,5. Traditionele benaderingen in de systeembiologie, zoals transcriptomics of proteomics, slagen er niet in om deze kritieke veranderingen op interactieniveau vast te leggen.

PPI-mappingtechnologieën zijn aanzienlijk geavanceerd en bieden inzicht in de organisatie en regulering van mobiele netwerken 6,7,8,9,10,11. Veelgebruikte benaderingen, waaronder affiniteitszuivering-massaspectrometrie (AP-MS), cross-linking (XL)-MS, nabijheidslabeling en co-fractionering, bieden elk specifieke voordelen, zoals hoge specificiteit, ruimtelijke resolutie of het vermogen om voorbijgaande complexen te detecteren 6,8,9,10,11 . Deze methoden vereisen echter vaak aaseiwitten, genetische manipulatie of complexe bio-informatica, en kunnen moeite hebben om de grootschalige, ziektegedreven herbedrading van eiwitnetwerken in inheemse biologische systemen vast te leggen 6,7,8,9,10,11 . De meeste zijn ook niet schaalbaar, waardoor ze onpraktisch zijn voor het analyseren van grote steekproefcohorten of het systematisch in kaart brengen van interactoomveranderingen onder verschillende omstandigheden, celtypen of tijdstippen 6,7,8,9,10,11 (Tabel 1).

Om deze kloof te dichten, hebben we het disfunctionele Protein-Protein Interactome (dfPPI)-platform ontwikkeld, een chemoproteomische methode die direct de PPI-netwerkdisfuncties identificeert die verantwoordelijk zijn voor ziektefenotypes¹². Het maakt gebruik van een belangrijk biologisch inzicht: in ziektetoestanden vormt een subset van moleculaire chaperonnes supramoleculaire steigers die epichaperomes 13,14,15 worden genoemd. Deze structuren werken niet bij het vouwen van eiwitten, maar fungeren in plaats daarvan als steigerinteractiehubs die de eiwitconnectiviteit reorganiseren³. Cruciaal is dat de eiwitten die in epichaperomes zijn afgezonderd niet willekeurig zijn; Zij zijn actief betrokken bij het in stand houden van de ziekte fenotype 16,17,18,19,20. Door deze epichaperome-gebonden eiwitten en hun interactoren vast te leggen, identificeert dfPPI de exacte netwerkveranderingen die specifieke ziektetoestanden aansturen. Epichaperome-gestuurde netwerkherbedrading komt veel voor bij ziekten, de meerderheid in cohorten van de ziekte van Alzheimer en ~70% in kankermonsters^16,20 - ter ondersteuning van de toepasbaarheid van dfPPI op grote, ziektegerichte studies.

Het dfPPI-platform omvat de volledige workflow, van monstervoorbereiding, het vastleggen van epichaperome-affiniteit en interactoomidentificatie door MS, tot stroomafwaartse bio-informaticaanalyses zoals routeverrijking en functionele eiwitnetwerkmodellering (Figuur 1). De methode maakt gebruik van epichaperome-specifieke chemische sondes die zijn geïmmobiliseerd op affiniteitsmatrices (PU-kralen of andere sondes)13,16,17 om het functionele interactoom te isoleren van cellen of weefsels. Deze sondes zijn al rigoureus gevalideerd in meerdere publicaties voor specificiteit voor epichaperomes en geschiktheid voor dfPPI 16,17,18,20,21,22. Gevangen complexen worden onderworpen aan MS, met behulp van zowel on-bead als in-gel digestieworkflows, gevolgd door labelvrije LC-MS/MS. De resulterende gegevens kunnen vervolgens worden geanalyseerd via een speciale bio-informaticapijplijn die disfunctie op interactieniveau definieert en koppelt aan biologische processen en fenotypes. Omdat epichaperomes contextspecifieke interactomen ondersteunen 17,18,20, onthult dfPPI hoe eiwitnetwerken worden gemodelleerd in een bepaalde ziekte, celtype of stadium, waardoor het een krachtig systeembiologisch hulpmiddel is voor nauwkeurige fenotypering.

De methode is zeer schaalbaar en is toegepast op honderden klinische en experimentele monsters, waaronder post-mortem menselijk weefsel en gekweekte cellen, bij diverse ziekten zoals kanker en neurodegeneratie 16,17,18,19,20,22,23. Door de PPI-veranderingen bloot te leggen die een pathologische toestand definiëren, maakt dfPPI zowel mechanistisch inzicht als de ontdekking van bruikbare therapeutische doelen mogelijk 16,17,18,19,20,22,23.

In dit protocol beschrijven we in detail de experimentele componenten van het dfPPI-platform, van het vastleggen van affiniteit van epichaperome-gebonden interactomen tot het voorbereiden van monsters voor LC-MS/MS tot het identificeren van interactomen via MS. De pijplijn voor computationele analyse - dat wil zeggen, wat er wordt gedaan met de lijst van eiwitten die door MS zijn geïdentificeerd om differentiële interacties en functionele gevolgen te definiëren - wordt hier niet behandeld vanwege ruimtebeperkingen. Het is echter vrij toegankelijk en uitgebreid gedocumenteerd via de dfPPI Shiny App op https://epichaperomics.mskcc.org (bijgewerkt naar https://dfppi.mskcc.org) en via de website van het Chiosis Lab op https://www.chiosislab.com/resources. Naast deze portalen zijn de volledige bio-informaticapijplijn en bijbehorende scripts opgenomen in verschillende publicaties die dfPPI toepassen op kanker 16,17,19 en de ziekte van Alzheimer ^18,20.

Protocol

Het protocol volgt de richtlijnen van de ethische commissie voor menselijk onderzoek en de commissie voor dierenverzorging en -gebruik van onze instelling. Apparatuur en reagentia die in het onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Monstervoorbereiding voor het vastleggen van affiniteit

1. Eiwitextractie uit weefsel
   OPMERKING: Dit protocol is geoptimaliseerd voor postmortale hersenweefselmonsters.
   1. Bereid een eiwitextractiebuffer voor met 20 mM Tris (pH 7,5), 20 mM KCl, 5 mM MgCl₂ en 0,01% NP-40 (natieve lysisbuffer). Voeg direct voor gebruik protease- en fosfataseremmers toe. Houd de buffer op ijs.
   2. Plaats het bevroren weefsel (doelvolume ongeveer 50 mm³) in een homogenisatorbuis voor microweefsel, die bestaat uit een gespecialiseerde microcentrifugebuis van 1,5 ml die is uitgerust met een stamper. Voeg 500-700 μL natuurlijke lysisbuffer toe en pas het volume aan op basis van de compactheid van het weefsel en het gemak van homogenisatie. Homogeniseer het monster op ijs door de stamper voorzichtig op en neer en tegen de schurende wanden van de homogenisatorbuis te bewegen totdat een homogene suspensie is gevormd.
      OPMERKING: Voer alle stappen op ijs uit om eiwitassemblages in hun oorspronkelijke configuratie te houden en om eiwitafbraak te voorkomen.
   3. Incubeer lysaten bij 4 °C gedurende 30 minuten door de injectieflacon op een rotatie-eenheid te plaatsen. Meng de monsters voorzichtig tijdens de incubatie met behulp van rotatie.
   4. Centrifugeer de monsters bij 13.000 g × g gedurende 10 minuten bij 4 °C met behulp van een tafelcentrifuge om vuil te verwijderen.
   5. Verzamel de supernatanten en breng ze over in doorzichtige microcentrifugebuisjes van 1,5 ml. Vermijd het verstoren van de pellet tijdens het overbrengen.
   6. Bepaal de totale eiwitconcentratie in het bovenstaande met behulp van de bicinchoninezuur (BCA)-testkit volgens de instructies van de fabrikant.
      OPMERKING: Eiwitlysaten kunnen tot gebruik bij -80 °C worden bewaard. Vermijd herhaalde vries-dooicycli. Raadpleeg een eerdere publicatie²⁴ voor de impact van herhaalde vries-dooicycli en opslagtemperatuur op de integriteit van eiwitassemblages.
2. Normalisatie van de steekproef
   OPMERKING: HSP90α en HSP90β zijn kerncomponenten van de epichaperome en zijn de directe bindingspartners van de chemische sonde die wordt gebruikt voor het vastleggen van interactoom 13,21,23. Het normaliseren van monsters op basis van HSP90α (of HSP90β) zorgt ervoor dat de hoeveelheid sonde-targetbare epichaperome wordt afgestemd op de monsters, wat essentieel is voor een nauwkeurige vergelijking van de vastgelegde interactomen. Monsters kunnen worden genormaliseerd op basis van HSP90-niveaus bepaald door Western blot, maar er kunnen ook andere methoden worden gebruikt. Als HSP90-niveaus vergelijkbaar zijn in verschillende monsters, slaat u dit gedeelte over en gaat u verder met stap 1.3. Het gebruik van HSP90α/β-blotting is hier alleen voor inputnormalisatie en mag niet worden geïnterpreteerd als een maatstaf voor de overvloed aan epichaperom.
   1. Bereid 2× Laemmli-monsterbuffer voor bestaande uit 4% natriumdodecylsulfaat (SDS), 20% glycerol, 10% 2-mercaptoethanol, 0,02% broomfenolblauw en 0,125 M Tris-HCl, pH ~6,8.
      LET OP: 2-mercaptoethanol is giftig en vluchtig en moet in een zuurkast worden behandeld.
   2. Combineer 5 μg van het totale herseneiwitextract (uit stap 1.1) 1:1 (v/v) met 2× Laemmli-monsterbuffer in een doorzichtige microcentrifugebuis van 1,5 ml.
   3. Verwarm de monsters 3-5 minuten bij 95 °C in een verwarmingseenheid om eiwitten te denatureren voordat ze op natriumdodecylsulfaatpolyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) worden geladen.
   4. Laad de monsters op geprefabriceerde 8% Tris-Glycine eiwitgels. U kunt ook met de hand gegoten gels gebruiken.
   5. Laad 5 μL voorgekleurde eiwitstandaard op elke gel, bijvoorbeeld in het eerste putje, om het molecuulgewicht van het eiwit te bepalen.
   6. Laat de gels in 1× TGS (Tris-Glycine-SDS) loopbuffer lopen bij RT. De typische looptijd is 1,5-2 uur bij 100 V.
   7. Bereid een overdrachtsbuffer voor met 25 mM Tris, 192 mM glycine en 20% methanol.
      LET OP: Methanol is ontvlambaar en moet worden gehanteerd volgens de veiligheidsrichtlijnen.
   8. Breng de eiwitten over op een nitrocellulosemembraan in een overdrachtsbuffer bij 4 °C gedurende 60 minuten bij constante spanning (100 V).
   9. Bereid een membraanwasoplossing (1× TBS-0,1% Tween-20) en blokkeeroplossing (5% melk in 1× TBS-0,1% Tween-20). Dit protocol maakt gebruik van magere droge melk in poedervorm van een commerciële bron.
   10. Plaats het membraan gedurende 1 uur in blokkeeroplossing bij kamertemperatuur (RT) met zacht roeren op een platformwip. Gebruik 10 ml blokkeeroplossing per minigel.
   11. Verwijder de blokkeeroplossing en incubeer het membraan met anti-HSP90α-antilichaam (1:6.000 verdunning in 10 ml blokkeeroplossing) 's nachts bij 4 °C op een platformwip.
   12. Verwijder de antilichaamoplossing en was het membraan drie keer gedurende 5 minuten elk met 10 ml wasoplossing.
   13. Voeg het HRP-geconjugeerde geitenanti-konijn secundair antilichaam toe (1:5.000 verdunning in 10 ml 1× TBS-0,1% Tween-20) en incubeer gedurende 1 uur bij RT op een platformwip.
   14. Verwijder het secundaire antilichaam en was het membraan vier keer met een wasoplossing (hetzelfde volume en dezelfde timing als hierboven).
   15. Detecteer het HSP90α-specifieke chemiluminescerende signaal met behulp van een verbeterde chemiluminescentie (ECL) kit volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik een chemoluminescentiebeeldvormingssysteem of autoradiografische film.
   16. Kwantificeer de HSP90α-niveaus in de monsters op basis van signaalintensiteit en bereken een normalisatiefactor voor downstream pull-down.
       OPMERKING: De intensiteit van het HSP90-signaal weerspiegelt de hoeveelheid sonde-targetbare epichaperome in elk monster. Door de signaalintensiteit tussen monsters te vergelijken en te normaliseren naar een referentiemonster dat op elke gel wordt uitgevoerd, kunnen de invoervolumes voor het vastleggen van interactomen dienovereenkomstig worden aangepast. Kwantificering kan worden uitgevoerd met behulp van densitometriesoftware. Voeg altijd een aliquoot van een referentiemonster toe aan elke gel om normalisatie over blots mogelijk te maken.
3. PU-parel voorbereiding
   OPMERKING: PU-kralen en controlekralen kunnen in eigen huis worden gesynthetiseerd zoals eerder gerapporteerd ^21,25 of worden aangevraagd bij het chioselaboratorium bij uitvoering van een materiaaloverdrachtsovereenkomst (MTA). Ze moeten worden bewaard bij -20 °C in isopropanol.
   1. Neem een hoeveelheid polyurethaan (PU)-korrels of controlekorrels rechtstreeks uit de isopropanolbouillon. Voeg ongeveer 30% eigen risico toe om rekening te houden met het verlies van parels tijdens het wassen en hanteren.
   2. Verwijder het bewaarmiddel: laat de parels bezinken en zuig vervolgens de isopropanol op. Voeg native lysisbuffer toe (1 ml voor een tube van 1,5 ml; 5 ml voor een conische buis van 15 ml) en resusureer volledig door voorzichtig pipetteren of inversie.
   3. Was en breng het evenwicht driemaal: voor elke wasbeurt, vortex om opnieuw te suspenderen, centrifugeren (1,5 ml buis: 10.000 × g, 1 min; 15 ml conisch: 3.000 × g, 5 min), zuig vervolgens het bovenstaande op met een vacuümleiding voorzien van een pipetpunt, waarbij u ervoor zorgt dat de pellet niet wordt verstoord.
   4. Voeg native lysisbuffer toe aan de gewassen kralen in een volumeverhouding van 1:1 (kralen:buffer) om een uniforme werkende kralenslurry te genereren.
   5. 40 μL PU-parel (of controleparel) suspensie (bv. 1:1 v/v kralen: buffer) per monster in microcentrifugebuisjes van 1,5 ml. Gebruik een pipetpunt waarvan het uiteinde is afgesneden om de kralen gemakkelijk te kunnen doseren.
      LET OP: PU-korrels zijn lichtgevoelig. Gebruik donkere of in folie verpakte tubes van 1,5 ml tijdens het neerklappen. Door hun hydrofobe oppervlaktecoating met het kleine molecuul epichaperome bindmiddel hebben PU-korrels de neiging om te klonteren en zich te hechten aan plastic oppervlakken. Pipetteer voorzichtig en meng grondig om een gelijkmatige resuspensie te garanderen. Het is van cruciaal belang om gelijke hoeveelheden kralenslurry in elk monster te doseren om variabiliteit in eiwitafvang te voorkomen, wat kan leiden tot inconsistente of niet-reproduceerbare resultaten.
   6. Was de kralen driemaal met natuurlijke lysisbuffer door 1 ml buffer aan elke buis toe te voegen, te vortexen, te centrifugeren op 10.000 g × g gedurende 1 minuut en het bovenstaande weg te gooien door aspiratie. Zorg ervoor dat de kralen tussen elke wasbeurt volledig opnieuw zijn gesuspendeerd.
      NOTITIE: Vermijd het aanraken van de kralen tijdens het afzuigen. Druk de pipetpunt voorzichtig tegen de wand van de buis terwijl u de vloeistof verwijdert.
   7. Verwijder na de laatste wasbeurt het grootste deel van de vloeistof uit de tubes en zorg ervoor dat de kralenkorrel niet wordt verstoord.
      LET OP: Gewassen kralen kunnen enkele dagen bij 4 °C worden bewaard. Meestal worden de kralen binnen 1-2 dagen na bereiding gebruikt.
4. Interactome pull-down
   OPMERKING: De eerste stap van de pull-down is een pre-clearing-stap met behulp van controlekralen, die zijn geconjugeerd aan een inert klein molecuul dat epichaperomes¹⁶ niet bindt. Deze stap verwijdert niet-specifiek interagerende eiwitten, aggregaten en onoplosbaar puin uit het lysaat, waardoor de specificiteit van de daaropvolgende PU-bead pull-down wordt verbeterd. Pre-clearing vermindert de achtergrondbinding en verbetert de detectie van specifieke epichaperome-geassocieerde eiwitten.
   Het interactoom dat door dit protocol wordt teruggewonnen, wordt geanalyseerd door MS, dat zeer gevoelig is voor experimentele verontreinigingen. Om een nauwkeurige eiwitidentificatie te garanderen en de gegevenskwaliteit te behouden, moet u altijd vers bereide buffers en reagentia gebruiken, de blootstelling aan stof en keratine tot een minimum beperken en schone, poedervrije handschoenen dragen bij het hanteren van monsters, verbruiksartikelen of apparatuur. Gebruik MS-speciaal glaswerk/verbruiksartikelen voor alle pull-down en in-gel spijsverteringsstappen, en houd alle items die worden gebruikt voor Western blotting fysiek gescheiden. Als glaswerk opnieuw wordt gebruikt, ontsmet dan door achtereenvolgens te spoelen met 100% methanol, ultrapuur water, 80% azijnzuur, ultrapuur water en vervolgens aan de lucht drogen. Gebruik geen wasmiddelen; zelfs sporenresten kunnen LC-kolommen en ionenbronnen vervuilen.
   1. Voeg de genormaliseerde eiwitextracten (volgens stap 1.2, berekend op basis van de HSP90-blotintensiteit) toe aan individuele microcentrifugebuisjes van 1,5 ml die 40 μl van de controlekorrelsuspensie bevatten (d.w.z. 20 μl-druppels + 20 μl-buffer), en pas het uiteindelijke volume aan op 250 μl door het juiste volume native lysisbuffer toe te voegen.
      OPMERKING: Om monsterspecifieke invoervolumes te bepalen, gebruikt u de formule A1 = (60 / C1) × X1, waarbij A1 het volume is van het genormaliseerde totale eiwit dat moet worden toegevoegd (μL), C1 is de gemeten eiwitconcentratie (μg/μL) en X1 is de normalisatiefactor afgeleid van HSP90-blotting (zoals beschreven in stap 1.2). Het volume van de extra buffer die moet worden toegevoegd, wordt berekend als 250 μL minus A1. Als normalisatie niet nodig is, gebruik dan 250 μg totaal eiwit in 250 μL.
   2. Incubeer de monsters gedurende 30 minuten bij 4 °C met rotatie op een end-over-end rotator (10-15 rpm).
   3. Centrifugeer de buisjes bij 10.000 g × g gedurende 1 minuut bij 4 °C om de controlekorrels samen met geaggregeerd of onoplosbaar eiwit te pelleteren.
   4. Verzamel het bovenstaande voorzichtig uit de controlekorrels met behulp van een pipet van 1 ml en breng het over in buisjes van 1,5 ml met 40 μl van de gewassen PU-korrelsuspensie.
   5. Incubeer de monsters bij 4 °C gedurende 3 uur met rotatie op een end-over-end rotator (10-15 rpm).
   6. Centrifugeer elke buis op 10.000 g × gedurende 1 minuut, zuig de supernatant op en was de kralen vier keer met 1 ml native lysisbuffer. Voor elke wasbeurt: vortex, centrifuge en aspireren, met behulp van de parameters beschreven in stap 1.3.
      OPMERKING: In dit stadium kunnen de monsters worden verwerkt voor LC-MS/MS met behulp van een van de twee workflows: (1) SDS-PAGE gevolgd door in-gel digestie, of (2) on-bead digestie van de gevangen eiwitten.
      Ga voor de in-gel spijsverteringsworkflow verder met het protocol zoals geschreven. Voor de vertering van de parels wast u de kralen nog twee keer met koude PBS en gaat u onmiddellijk verder met sectie 3. Vries de kralen niet in als u doorgaat met het verteren van kralen; De monsters moeten op dezelfde dag vers worden verwerkt. Het invriezen van kraalgebonden eiwitcomplexen kan de spijsverteringsefficiëntie aantasten door aggregatie of verlies van eiwitoplosbaarheid te bevorderen, wat leidt tot een lager peptideherstel en verhoogde variabiliteit. Op basis van de aanbevelingen van de MS-kern moeten monsters op dezelfde dag vers worden verwerkt om een consistente vertering van de parels te garanderen.
5. Monstervoorbereiding voor in-gel digestie
   1. Voeg 25 μl 2× Laemmli-monsterbuffer toe aan de in stap 1.4.6 voorbereide parelmonsters, die zich in microcentrifugebuisjes van 1,5 ml bevinden.
      OPMERKING: De monsters kunnen op dit punt maximaal 24 uur bij -80 °C worden bewaard. Laad altijd het volledige monstervolume in de SDS-PAGE-gel voor in-gel digestie om de proteoomdekking te maximaliseren en een volledige weergave van het interactoom te garanderen. Gedeeltelijk laden wordt niet aanbevolen. Als het monstervolume beperkt is en gedeeltelijke belasting onvermijdelijk is, moet het resterende materiaal in aliquots worden opgeslagen om vries-dooicycli te minimaliseren en de integriteit van het interactoom te behouden.
   2. Verwarm elk monster gedurende 3 minuten bij 95 °C (met de toegevoegde 2× Laemmli-monsterbuffer, zoals hierboven) om de eiwitcomplexen te denatureren en ze uit de kralen te elueren voordat ze op SDS-PAGE worden geladen. Het SDS en de reductiemiddelen in de buffer verstoren PPI's en maken eiwitten vrij uit de matrix.
   3. Centrifugeer elke buis bij 10.000 × g gedurende 1 minuut bij RT.
   4. Laad elk supernatans op 4-20% geprefabriceerde gradiënt SDS-PAGE-gels.
   5. Laat de gels in 1× TGS-loopbuffer op RT lopen en stop de run halverwege (~3,5-4 cm in de gel bij 100 V, meestal 30-60 minuten looptijd).
   6. Verwijder de gel uit de elektroforese-eenheid en ga verder met het kleuren met Coomassie brilliant blue volgens de instructies van de fabrikant.
      OPMERKING: De gekleurde gel, ondergedompeld in 5-7 ml ultrapuur water in een plastic container, kan naar de MS-faciliteit worden vervoerd voor eiwitidentificatie. Indien niet onmiddellijk verwerkt, bewaren bij 4 °C in ultrapuur water gedurende maximaal 1-2 weken. Er werden twee alternatieve proteomische workflows gebruikt, afhankelijk van de kernfaciliteit die het werk uitvoerde en de experimentele doelen: Sectie 2 beschrijft in-gel digestie gevolgd door data-onafhankelijke acquisitie (DIA)-MS-analyse met behulp van quadrupole orbitrap massaspectrometer; Sectie 3 beschrijft een protocol voor het verteren van kralen dat is geoptimaliseerd voor mobiliteitsspectrometrie van ingesloten ionen met parallelle accumulatie-seriële fragmentatie (diaPASEF)²⁶. Waar nodig kunnen er naar de stappen worden verwezen.

2. Eiwitidentificatie door LC-MS/MS met in-gel eiwitvertering

1. In-gel reductie en alkylering van cysteïnyleerde eiwitten
   1. Snijd het bevlekte gebied van elke met Coomassie gekleurde gelbaan weg en snijd deze in ongeveer vijf plakjes gel van gelijke grootte. Ontkleur elke schijf door deze driemaal te incuberen in 500 μl 50% (v/v) methanol gedurende 1 minuut bij 37 °C met agitatie bij 700 tpm op een temperatuurgeregelde microbuisschudder.
      OPMERKING: Elke plakje gel mag niet groter zijn dan ~1 cm × 0,5 cm × 1 cm om een efficiënte diffusie van reagentia in de volgende stappen te garanderen, evenals een efficiënte vertering van trypsine in de gel 's nachts. Snijd het gelgebied dat overeenkomt met zwaar gekleurde eiwitten - zoals HSP90 en HSC70, die directe bindmiddelen van de chemische sonde en kerncomponenten van de epichaperome 15,16,23 vertegenwoordigen - afzonderlijk van de rest van de gel. Hun hoge abundantie kan anders interfereren met de detectie en kwantificering van interactoren met een lagere abundantie tijdens LC-MS/MS-analyse.
   2. Incubeer elk plakje gel in 500 μL 5 mM ammoniumbicarbonaat (ABC) bereid in 30% acetonitril (ACN) bij 37 °C met schudden bij 700 rpm op een temperatuurgeregelde microtube shaker gedurende 15 minuten om achtergebleven vlekken te verwijderen. Herhaal de incubatie totdat het plakje gel volledig is vastgeroest.
      OPMERKING: Elke resterende zichtbare eiwitvlek kan de peptidebinding aan de C18-matrix verstoren tijdens de stap van het opschonen van peptiden, waardoor het herstel en de stroomafwaartse MS-gevoeligheid worden verminderd.
   3. Verwijder de ABC/ACN-oplossing en gooi deze weg met behulp van een pipet met fijne punt, zorg ervoor dat de gelstukjes niet verloren gaan (d.w.z. zuig de gelstukjes niet samen met de vloeistof op). Voeg vervolgens 500 μL 100% ACN toe aan elke tube en zorg ervoor dat de gelstukjes volledig ondergedompeld zijn. Incubeer bij RT op een orbitale schudder bij 700 tpm gedurende 10 minuten, of totdat de gelstukjes doorschijnend worden, in omvang krimpen en het uiterlijk van wit papier krijgen.
      LET OP: ACN is ontvlambaar en moet in een zuurkast worden gehanteerd.
   4. Verwijder het ACN uit elke tube en gooi het weg met behulp van een pipet met fijne punt, waarbij u ervoor zorgt dat u geen gelstukjes aanzuigt. Centrifugeer kort bij 1.000 × g gedurende 10 s om resterende vloeistof op te vangen en zuig de resterende druppels voorzichtig op met een pipet met fijne punt. Plaats de open buizen in een vacuümcentrifuge bij RT gedurende 10-15 minuten, of totdat de gelschijfjes droog en stijf zijn.
      OPMERKING: Niet te droog maken. Controleer regelmatig om barsten of te veel krimpen van gelstukjes te voorkomen. Eenmaal gedroogd, bewaar de gelstukjes bij 4 °C in een afgesloten, laagbindende buis of microcentrifugebuis tot vertering; gelgebonden en gezuiverde eiwitten zijn tot enkele dagen stabiel bij 4 °C.
   5. Reductie: Voeg ~100 μL 10 mM Dithiothreitol (DTT) (vers bereid uit 500 mM bouillon in 50 mM ammoniumbicarbonaat) toe aan elke monsterbuis, zorg ervoor dat de gelstukjes volledig ondergedompeld zijn. Incubeer bij 56 °C gedurende 45 minuten onder roering bij 700 tpm op een temperatuurgeregelde microbuisschudder.
      LET OP: DTT is irriterend voor de huid en de luchtwegen. Handvat in een chemische zuurkast en draag handschoenen.
      NOTITIE: Zorg ervoor dat de buizen tijdens de incubatie goed gesloten zijn om verdamping te voorkomen en de DTT-concentratie te behouden.
   6. Alkylering: Verwijder de DTT-oplossing uit elke buis met behulp van een pipet met fijne punt en zorg ervoor dat de gelstukjes niet worden verstoord. Voeg onmiddellijk ~100 μL 55 mM jodoacetamide (IAZ) in 50 mM ABC toe om de plakjes gel volledig te bedekken. Incubeer bij RT met agitatie bij 700 tpm gedurende 30 minuten in het donker.
      LET OP: IAZ is giftig en lichtgevoelig. Voer alle handelingen uit in een zuurkast terwijl u handschoenen draagt.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat DTT volledig wordt verwijderd voordat u IAZ toevoegt om te voorkomen dat de alkyleringsreactie afschrikt. Wikkel de buisjes in aluminiumfolie of gebruik lichtblokkerende containers tijdens de incubatie om IAZ-afbraak te minimaliseren.
   7. Centrifugeer de buisjes kort bij 1.000 × g gedurende 5 s bij RT om restvloeistof op de bodem op te vangen. Verwijder het bovenstaande voorzichtig met behulp van een pipetpunt met fijne boring (bijv. P10-tip) om te voorkomen dat de gelstukjes worden verstoord. Kantel de tube iets en zuig vanaf de rand om het risico op het aanzuigen van gelfragmenten te minimaliseren.
   8. Evenwicht: Bedek de gelstukken met 500 μL 50 mM ABC in 30% ACN. Incubeer 10 minuten bij RT en roer bij 700 tpm op een verwarmde orbitale schudder. Deze stap helpt bij het verwijderen van overtollig alkyleringsreagens en brengt de gel in evenwicht voordat deze wordt uitgedroogd.
   9. Oplossing verwijderen: Draai kort rond op 1.000 × g gedurende 5 s en gooi het bovenstaande weg met behulp van een pipet met fijne punt, zoals hierboven beschreven.
   10. Opnieuw dehydrateren: Herhaal stap 2.1.3 en 2.1.4 om de gelstukjes opnieuw te dehydrateren met 100% ACN, gevolgd door vacuümcentrifugeren tot ze droog zijn. Deze stap zorgt voor een optimaal peptideherstel tijdens de enzymatische vertering.
2. In-gel proteolyse en peptide opruimen
   1. Verteer de gedroogde gelmonsters door trypsine van MS-kwaliteit toe te voegen in een eindconcentratie van 5 ng/μL in 50 mM ABC om de gelstukjes volledig te rehydrateren (meestal 50-100 μL totaal volume, of genoeg om de gelschijfjes te bedekken). Incubeer een nacht bij 37 °C in microcentrifugebuisjes van 1,5 ml en zorg ervoor dat de buisjes goed zijn afgesloten om verdamping te voorkomen. Schud indien mogelijk voorzichtig (bijv. 300 tpm op een temperatuurgeregelde microbuisschudder).
   2. Verzuur het monster na een nachtelijke vertering door druppelsgewijs 10% mierenzuur (FA) toe te voegen om een eindconcentratie van 1% (v/v) te bereiken (voeg bijv. 1 μL 10% FA toe aan 100 μL digest). Meng voorzichtig en sonificeer de buizen vervolgens gedurende 10 minuten in een RT-waterbadsonicator om de peptide-extractie te verbeteren.
   3. Verwijder het peptidehoudende supernatans voorzichtig met behulp van een pipet met fijne punt (bijv. P10 punt met smalle boring), en zorg ervoor dat u de gelmatrix niet verstoort of gelfragmenten opzuigt. Breng het verzamelde bovenstaande over in een buis van 500 μl met een lage binding en plaats deze op ijs.
   4. Voeg 5% FA/50% ACN (v/v) oplossing toe aan elke buis (meestal ~50-100 μL, of genoeg om de gelstukjes volledig te bedekken), en schud voorzichtig bij RT (bijv. op een shaker bij 70 rpm gedurende 10-15 min) om resterende peptiden te extraheren. Verzamel het bovenstaande voorzichtig en combineer het met de oorspronkelijke peptideoplossing uit stap 2.2.3.
   5. Concentreer het gecombineerde peptide-extract met behulp van vacuümcentrifugatie bij RT (bijv. 1.000 × g gedurende ~30 min) totdat er slechts een klein druppeltje overblijft. Laat het monster niet volledig drogen, omdat dit peptideverlies kan veroorzaken als gevolg van hechting aan de buiswanden. Gebruik het gedeeltelijk gedroogde extract onmiddellijk om te ontzouten of bewaar het bij -20 °C in een afgesloten, weinig bindende tube.
   6. Ontzout de peptiden met behulp van met de hand verpakte, kleinschalige C18-verpakte pipetpunten (d.w.z. StageTips) die zijn voorbereid met twee gestapelde C18-extractieschijven die in een pipetpunt van 200 μl worden ingebracht, zoals eerder beschreven²⁷, met de volgende wijzigingen:
   7. Activeer de C18-schijven door 40 μL methanol toe te voegen. Centrifugeer de pipetpunt met de schijven (ingebracht in een lege pipetpunt van 200 μl en in een buisje van 500 μl) met behulp van een tafelcentrifuge bij 1.500 × g gedurende 3 minuten.
      NOTITIE: Laat de C18-schijven bij alle stappen niet opdrogen. Drogen zal de binding en elutie van peptiden verstoren. De buitenste pipetpunt (sleeve) van 200 μl die de met de hand verpakte kleinschalige C18-pipetpunt bevat, moet mogelijk worden ingekort door ~ 1 cm vanaf het uiteinde af te knippen om ervoor te zorgen dat de twee-tip-in-tube-constructie goed in de centrifuge past.
   8. Breng de schijven in evenwicht door 0,1% FA toe te voegen en te centrifugeren zoals hierboven.
   9. Breng de peptideoplossing, gereconstitueerd in 20 μl 0,1% FA, rechtstreeks aan op de bovenkant van de gestapelde schijven.
   10. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 1.500 × g om de peptidebinding aan de C18-schijven te vergemakkelijken.
   11. Was de gebonden peptiden door 40 μL 0,1% FA door de kolom te leiden.
   12. Elute peptiden met 40 μL 70% ACN met 0,1% FA. Bewaar de geëlueerde peptiden in buisjes met een lage binding bij -80 °C tot LC-MS/MS analyse. Vermijd herhaalde vries-dooicycli.
3. Nano-LC gekoppeld aan MS-analyse met behulp van DIA
   1. Concentreer het ontzoute peptide eluaat met behulp van vacuümcentrifugatie (bijv. 20-30 minuten bij RT, 1.000 × g), waarbij een klein druppeltje overblijft. Reconstitueer de peptiden in 10 μl van 0,1% FA in water van LC-MS-kwaliteit door voorzichtig op en neer te pipetteren en kort te vortexen. Draai kort naar beneden om vloeistof op de bodem van de buis op te vangen voordat u verder gaat.
   2. Analyseer 4 μL aliquots van het gereconstitueerde peptidemonster met nano-LC-MS/MS. Scheid de peptiden op een zelfverpakte omgekeerde fasekolom (75 μm ID × 2 cm, C18-hars, deeltjesgrootte van 3 μm) die op 50 °C wordt gehouden. Bereid de kolom voor met behulp van een drukbom²⁸ door een slurry van C18-hars (in methanol, 1:3 v/v) in een capillair van gesmolten silica te verpakken met een geïntegreerde spuittip van 10 μm (360 μm OD × 75 μm ID × tip van 10 μm). Interface de kolom via nanospray-ionisatie met een hybride massaspectrometer met hoge resolutie (quadrupole-Orbitrap-type) die DIA-workflows ondersteunt.
      OPMERKING: Een kolomlengte van 20 cm wordt aanbevolen omdat deze een optimale scheiding biedt voor peptidemengsels die zijn gegenereerd uit SDS-PAGE-gelplakjes.
   3. Houd de analytische kolom op 50 °C met behulp van een kolomoven of verwarmingsblok om een consistente retentie en scheiding van peptiden te garanderen. Zorg voor een stabiele temperatuurregeling tijdens de hele run, aangezien fluctuaties de reproduceerbaarheid kunnen beïnvloeden.
   4. Elute peptiden met behulp van een lineaire gradiënt van 3-40% ACN in 0,1% FA gedurende 110 min, met een stroomsnelheid van 250 nL/min. Deze gradiënt zorgt voor een effectieve peptidescheiding voorafgaand aan MS-detectie. De totale analysetijd, inclusief kolomevenwicht, is 120 min.
   5. Verkrijg gegevens in DIA-modus met behulp van een MS met hoge resolutie, zoals eerder beschreven²⁹.
      1. Stel volledige MS1-enquêtescans in die in profielmodus moeten worden verkregen met een resolutie van 120.000 (bij m/z 200), over een scanbereik van 300-1650 m/z. Volg elke MS1-scan met MS2-fragmentatie van 30 sequentiële voorlopervensters (364-1370 Th) met behulp van een glijdend isolatievensterschema.
      2. Voer fragmentatie uit met behulp van getrapte genormaliseerde botsingsenergieën van 25,5, 27,0 en 30,0. De standaard maximale laadstatus van de voorloper is 4. Stel de vaste eerste massa in MS/MS-scans in op 200 Da en verkrijg MS2-spectra met een resolutie van 30.000.
      3. Gebruik een automatische injectietijd voor MS2 en een maximale injectietijd van 60 ms voor MS1. Stel voor zowel MS1- als MS2-scans het ionendoel (AGC) in op 3e6.
4. Relatieve kwantificering van affiniteit-vastgelegde interactomen
   OPMERKING: Om eiwitten te kwantificeren die zijn geïdentificeerd in DIA-MS-analyses van door affiniteit vastgelegde epichaperome-interactomen, gebruikt u een softwareplatform dat DIA-workflows ondersteunt en betrouwbare kwantificering biedt op basis van peptide-intensiteit of spectrale tellingen. Dit protocol gebruikte MaxQuant (bijv. versie 2.5.1.0) en zijn MaxDIA-workflow^20,29 voor peptide-/eiwitidentificatie en kwantificering op basis van labelvrije intensiteit. Zoekopdrachten gebruikten een lokstrategie met omgekeerde sequentie met 1% FDR op PSM/peptide- en eiwitniveaus; De vermeldingen "Omgekeerd" en "Potentiële verontreiniging" werden gefilterd vóór de bio-informatica. Er werden geen spike-ins gebruikt; de gereedheid van het instrument werd geverifieerd met 250 ng HeLa-digest (en intermitterende 10 fmol 6-eiwitmix) die voldeed aan interne ID- en RT-stabiliteitscriteria.
   1. Analyseer onbewerkte DIA-MS-gegevens met consistente parameters voor alle monsters. Neem maximaal twee gemiste splitsingen op en stel de volgende wijzigingen in: vaste carbamidomethylering van cysteïne; variabele, oxidatie van methionine en acetylering van het eiwit N-terminus.
   2. Gebruik een in silico-voorspelde spectrale bibliotheek op basis van de UniProt-database met menselijke eiwitten (bijv. ~20.000 vermeldingen), en zorg ervoor dat lok- en contaminantensequenties worden opgenomen voor een nauwkeurige schatting van het false discovery rate (FDR). Specificeer tryptische vertering, tenzij een alternatief enzym is gebruikt. Een gevalideerde menselijke spectrale bibliotheek (gebaseerd op de UniProt-release van 18-06-2020, 20.956 vermeldingen) is beschikbaar in de repository³⁰ van het Max Planck Institute of Biochemistry.
      OPMERKING: Als alternatief voor deze workflow met voorspelde bibliotheken illustreert stap 3.4 de bibliotheekvrije verwerking, die een vergelijkbare identificatie en kwantificering van deze datasets opleverde.
   3. Kwantificeer eiwitgehaltes met behulp van intensiteitswaarden (geen labelvrije kwantificering [LFQ]-intensiteiten), omdat deze geschikter zijn voor downstream PPI-netwerkanalyses. Zorg ervoor dat LFQ is gedeselecteerd om normalisatie-artefacten te voorkomen, die de gegevens over affiniteitsverrijking kunnen vervormen. Gebruik in plaats daarvan ruwe intensiteitswaarden die zijn afgeleid van peptidespectrale matches, die de interactiesterkte weerspiegelen in plaats van de globale eiwitexpressie. Pas de juiste filtercriteria toe (bijv. minimaal één uniek peptide per eiwitgroep) om de betrouwbaarheid van eiwitidentificatie en -kwantificering te verbeteren. Exporteer de resulterende eiwitintensiteitstabel voor daaropvolgende statistische en netwerkgebaseerde analyses.
      OPMERKING: In tegenstelling tot standaard proteomische workflows, waar LFQ-waarden helpen bij het normaliseren van eiwitbelasting over hele lysaten, worden eiwitten hier verrijkt door affiniteitsopname van epichaperomen. Deze verrijkingsstap introduceert biologische variantie die LFQ-normalisatie kan verdoezelen. Daarom hebben ruwe intensiteitswaarden de voorkeur, omdat deze de differentiële eiwit-epichaperome-interacties onder verschillende omstandigheden beter weerspiegelen en het signaal behouden dat nodig is voor analyse op stroomafwaarts netwerkniveau (bijv. dfPPI). In eerdere studies met behulp van op mascotte gebaseerde zoekopdrachten^16,18 werden MS/MS-spectrale tellingswaarden ook gebruikt in plaats van intensiteiten. In workflows voor het vastleggen van affiniteiten zoals deze weerspiegelen spectrale tellingen de interactiefrequentie en zijn ze zeer geschikt voor het identificeren van differentieel interagerende eiwitten onder verschillende omstandigheden. In tegenstelling tot LFQ-waarden gaan MS/MS-tellingen niet uit van wereldwijde normalisatie over het proteoom, waardoor biologisch betekenisvolle variantie van de epichaperome-verrijkingsstap behouden blijft.

3. Eiwitidentificatie door LC-MS/MS met eiwitvertering op de hiel

1. Vertering op de parel
   OPMERKING: Om een optimaal eiwitherstel te garanderen en monsterverlies tijdens de eiwitvertering op de kraal voor MS-analyse te minimaliseren, is het essentieel om microcentrifugebuisjes met een lage eiwitbinding te gebruiken. Deze buisjes zijn ontworpen om de eiwitopname naar de buiswanden te verminderen, waardoor het monsterherstel wordt verbeterd. Alle reagentia die in dit gedeelte worden gebruikt, moeten vers worden bereid met water en chemicaliën van LC-MS-kwaliteit. Als u monsters naar een proteomics-kern stuurt, controleer dan het lokale beleid, aangezien sommige faciliteiten kunnen vereisen dat alle buffers vóór gebruik worden gefilterd.
   1. Verwijder eventuele resterende PBS in de buis uit stap 1.4.6. Resuspendeer de korrels in 80 μL 2 M ureum, vers bereid in 50 mM ABC, pH 8,5. Zorg voor volledige menging door pipetteren of kortstondig vortexen.
      NOTITIE: Pas het volume proportioneel aan op basis van de hoeveelheid en het type kralen. Dit protocol is geoptimaliseerd voor 40 μL PU-korrels slurry.
   2. Voeg DTT toe om een eindconcentratie van 1 mM te bereiken.
      OPMERKING: Bereid onmiddellijk voor gebruik een verse 10 mM DTT-oplossing uit een 1 M DTT-voorraadoplossing in LC-MS-water van kwaliteit, aangezien DTT gevoelig is voor oxidatie in de oplossing. Voeg het benodigde volume rechtstreeks toe aan het monster en meng voorzichtig door te pipetteren.
   3. Sluit de buis af en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C met schudden bij 1.100 tpm op een verwarmde orbitale schudder. Sluit de deksels goed af om verdamping tot een minimum te beperken.
   4. Voeg IAZ toe om een uiteindelijke concentratie van 3,67 mM te bereiken. Incubeer in het donker bij RT gedurende 45 minuten met schudden bij 1.100 tpm.
      OPMERKING: Bereid onmiddellijk voor gebruik een verse 10 mM IAZ-voorraad in water van LC-MS-kwaliteit. Voeg het vereiste volume toe aan het monster en meng voorzichtig door te pipetteren.
   5. Voeg extra DTT toe om niet-gereageerde IAZ te blussen, waardoor een uiteindelijke concentratie van 3,67 mM wordt bereikt. Meng voorzichtig door te pipetteren.
      OPMERKING: Het afschrikken van niet-gereageerde IAZ voorkomt overmatige alkylering, wat de proteaseactiviteit en de efficiëntie van de spijsvertering in gevaar kan brengen. Bereid DTT vers en bereken het volume op basis van het huidige monstervolume om de doelconcentratie te bereiken.
   6. Voeg 750 ng 0,5 mg/ml Lys-C-protease van MS-kwaliteit toe aan het monster. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C en schud bij 1.150 tpm.
      OPMERKING: Bereid Lys-C voor door op te lossen in water van LC-MS-kwaliteit. Bewaar enzymaliquots bij -80 °C en vermijd meerdere vries-dooi.
   7. Voeg 750 ng 0,5 mg/ml vers bereide trypsine van sequencingkwaliteit toe. Incubeer een nacht bij 37 °C met schudden bij 1.150 tpm. Incubeer niet langer dan 16-18 uur om oververtering en afbraak van peptiden te voorkomen.
   8. Centrifugeer het monster de volgende dag 1-5 minuten bij 1.000-5.000 ×g bij 1.000-5.000 g bij RT en breng het bovenstaande door pipetteren over in een verse microcentrifugebuis van 1,5 ml. Gooi de kralen weg.
   9. Pas de pH van het digestaat aan tot onder de 3 door druppelsgewijs 50% trifluorazijnzuur (TFA) toe te voegen. Controleer de pH met behulp van pH-indicatorstrips.
      OPMERKING: Het typische pH-bereik moet ~2,5-3,0 zijn en de monsters moeten worden aangezuurd voordat ze worden ontzout.
      LET OP: TFA is corrosief en vluchtig. Voeg een zuurkast toe en draag de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM).
2. Peptide ontzouten
   OPMERKING: Gebruik voor het ontzouten en opruimen van peptiden kleinschalige C18-verpakte pipetpunten (d.w.z. StageTips)³¹. Bereid C18 StageTips voor door drie lagen C18-materiaal (bijv. C18 vastefase-extractieschijven) in een pipetpunt van 200 μl te verpakken. Kant-en-klare, in de handel verkrijgbare C18-spinkolommen kunnen ook worden gebruikt. Volg het protocol van de fabrikant voor conditionering, het laden van monsters en peptide-elutie. Prestaties (bijv. retentie-efficiëntie, herstelrendement) kunnen variëren tussen zelfgemaakte en commerciële apparaten. Kleinschalige C18-verpakte pipetpunten moeten stevig worden verpakt om bypass-stroom te voorkomen.
   1. Conditioneer de kleinschalige C18-verpakte pipetpunten achtereenvolgens met: (1) 100 μL methanol. Centrifugeer bij 400 × g en gooi de doorstroming weg; (2) 100 μL 70% ACN/0,1% TFA. Centrifugeer bij 400 × g en gooi de doorstroming weg; (3) 100 μL van 0,1% TFA. Centrifugeer bij 400 × g en gooi de doorstroming weg. Herhaal deze stap twee keer.
      OPMERKING: Conditionering zorgt voor volledige bevochtiging van de hydrofobe C18-hars. Voor kant-en-klare, in de handel verkrijgbare C18-spinkolommen kunnen ook vacuümspruitstukken worden gebruikt. Gebruikers dienen de instructies van de fabrikant te raadplegen voor specifieke aanbevelingen voor gebruik.
   2. Laad het aangezuurde peptidedigestaat op de geconditioneerde, kleinschalige C18-verpakte pipetpunten door het monster langzaam rechtstreeks in de punt te pipetteren. Centrifugeer bij 300 × g om het digestaat door de hars te laten gaan en gooi de doorstroming weg. Als het monstervolume de capaciteit overschrijdt, laadt u deze in meerdere rondes.
      OPMERKING: Pipetteer het digestaat rechtstreeks op het verpakte harsbed en vermijd luchtbellen. Als u tips met een lage retentie gebruikt, raakt u de binnenwand van de kleinschalige C18-verpakte pipetpunten aan om de vloeistof langzaam en gelijkmatig te laten ontsnappen.
   3. Pipetteer 100 μL 0,1% FA rechtstreeks in de kleinschalige C18-verpakte pipetpunt, zodat de oplossing het C18-materiaal volledig verzadigt. Centrifugeer bij 400 × g en gooi de doorstroming weg. Herhaal deze stap twee keer om zouten en storende stoffen te verwijderen.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de vloeistof voor elke centrifuge volledig door het C18-materiaal stroomt. Voorkom dat luchtbellen opgesloten raken door de wasoplossing langzaam langs de wand van de pipetpunt te laten lopen.
   4. Elueer de gebonden peptiden door 50 μl 70% ACN/0,1% FA in de kleinschalige C18-pipetpunt te pipetteren. Centrifugeer bij 300 × g en vang het eluaat op in een schone, weinig bindende microcentrifugebuis. Herhaal deze stap twee keer om volledige eliatie te garanderen.
      OPMERKING: Er kunnen meerdere centrifugatierondes nodig zijn om het eluaat volledig te herstellen. Als er nog vloeistof achterblijft aan de basis van de punt, tik dan zachtjes op de kleine C18-gevulde pipetpunt of voer korte extra draaijes uit om het resterende volume op te vangen. Combineer eluates en controleer het uiteindelijke volume voordat u verder gaat.
   5. Vries en droog de geëlueerde peptiden met behulp van een vacuümconcentrator tot ze droog zijn. Zorg ervoor dat het deksel losjes is geplaatst om ventilatie mogelijk te maken, maar vermijd spatten.
   6. Reconstitueer de gedroogde peptiden door 12 μL 0,1% FA in water van LC-MS-kwaliteit rechtstreeks aan de bodem van de tube toe te voegen. Draai en sonificeer de buisjes voorzichtig om de peptiden volledig op te lossen.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de gehele pellet of gedroogde film volledig is gereconstitueerd. Oplossing op basis van pipetten brengt het risico met zich mee dat peptiden verloren gaan als gevolg van hechting aan de uiteinden van de tip.
   7. Sonificeer de gereconstitueerde peptiden gedurende 5 minuten in een badsonicator gevuld met koud water om volledige oplossing te garanderen en oververhitting te voorkomen.
   8. Centrifugeer de peptiden bij 20.000 g × g bij 4 °C gedurende 10 min. Breng het peptide-supernatans over in een geschikte autosampler-injectieflacon om op het LC-MS-systeem te worden geladen. Gebruik hoogwaardige, gaschromatografie (GC)-geteste polypropyleen flesjes met een laag volume en gebonden siliconen/polytetrafluorethyleen (PTFE) septumdoppen om monsterverlies te minimaliseren. Label de injectieflacons duidelijk met de monster-ID en de injectievolgorde.
   9. Schat de peptideconcentratie met behulp van een spectrofotometer bij 280 nm. Houd er rekening mee dat dit bij benadering is en kan worden beïnvloed door het gehalte aan aromatische residuen of verontreinigingen. U kunt ook colorimetrische peptidetesten gebruiken voor een nauwkeurigere kwantificering.
3. LC- en MS-parameters
   OPMERKING: De volgende LC- en MS-parameters zijn geoptimaliseerd voor het nano-LC-systeem in combinatie met de massaspectrometer die in het huidige protocol wordt gebruikt. Voor andere nano-LC-systemen en massaspectrometers moeten de parameters dienovereenkomstig worden aangepast.
   1. Bereid de mobiele fasen wekelijks voor om LC-MS-compatibiliteit te garanderen en verontreiniging tot een minimum te beperken: (1) Mobiele fase A: voeg 1 ml LC-MS klasse FA toe aan 1 l water van LC-MS-kwaliteit, en (2) Mobiele fase B: voeg 1 ml LC-MS klasse FA toe aan 1 l LC-MS klasse ACN.
      OPMERKING: Gebruik alleen oplosmiddelen en zuur van LC-MS-kwaliteit. Bereid beide fasen voor in schone glazen flessen en ontgas indien vereist door het LC-systeem. Gooi ongebruikte fasen wekelijks weg om microbiële groei of degradatie te voorkomen.
   2. Installeer een 25 cm lange capillaire kolom met een binnendiameter van 75 μm gesmolten silica gevuld met 1,7 μm C18 omgekeerde fasedeeltjes.
      OPMERKING: Ga voorzichtig om met kolommen om te voorkomen dat er luchtbellen ontstaan of het verpakkingsmateriaal wordt beschadigd. Volg de instructies van de fabrikant voor installatie en kolomequivalent.
   3. Conditioneer de kolom door het debiet geleidelijk te verhogen van 50 nL/min naar 300 nL/min met behulp van 3% Mobile Phase B.
      OPMERKING: Deze stap zorgt ervoor dat de stationaire fase goed wordt bevochtigd en in evenwicht wordt gebracht voordat het monster wordt geïnjecteerd. Bewaak de kolomdruk tijdens het aflopen van het debiet. Plotselinge drukpieken kunnen duiden op luchtbellen of verstopping van de kolom. Evenwicht kan als voltooid worden beschouwd wanneer de basisdruk stabiliseert.
   4. Houd de kolomtemperatuur op 50 °C om optimale chromatografische prestaties te garanderen.
   5. Injecteer 100 ng van een HeLa-cel-tryptische digest als kwaliteitscontrolestandaard (QC) om de systeemprestaties te beoordelen.
      OPMERKING: Deze QC-injectie dient als benchmark om de consistentie van de LC-retentietijd, de MS-gevoeligheid en de proteoomdekking tijdens runs te evalueren. Vergelijk het aantal eiwitidentificaties, de retentietijd, reproduceerbaarheid en signaalintensiteit met een QC-referentiedataset om de gereedheid van het systeem te bevestigen voordat experimentele monsters worden geanalyseerd. Gebruik commerciële HeLa-digestiestandaarden die in bekende concentraties zijn bereid voor reproduceerbaarheid in experimenten.
   6. Gebruik een gradiënt-elutie van 2% tot 35% mobiele fase B gedurende 90 minuten bij een debiet van 300 nL/min. De gradiënt van 90 minuten zorgt voor peptidescheiding met hoge resolutie die geschikt is voor complexe proteomen. Houd volgens de gradiënt 7 minuten op 95% Mobile Phase B om de kolom te wassen.
      OPMERKING: Neem een herbalanceringsstap op (bijv. keer terug naar 2% B gedurende 10-15 minuten) vóór de volgende injectie om de reproduceerbaarheid van de kolom over de runs te garanderen. Vermijd abrupte gradiëntveranderingen, die van invloed kunnen zijn op de stabiliteit van de retentietijd en de piekvorm.
   7. Voer MS-analyse uit met behulp van een massaspectrometer die is uitgerust met een nanoflow-compatibele elektrospray-ionisatiebron (bijv. CaptiveSpray-stijl).
      OPMERKING: De CaptiveSpray-ionenbron zorgt voor stabiele elektrospray bij lage nanoflowsnelheden, waardoor de ionisatie-efficiëntie en gevoeligheid worden verbeterd. Voor laboratoria die alternatieve massaspectrometers gebruiken, passen de acquisitie- en ionisatieparameters dienovereenkomstig aan. Zorg voor een goede afstemming en kalibratie vóór de analyse om de nauwkeurigheid en resolutie te behouden. Plaats de spuitzender op de juiste manier en controleer de spuitstabiliteit tijdens het draaien om signaaluitval te voorkomen.
   8. Gebruik een data-onafhankelijke acquisitie diaPASEF-methode³². Voor gebruikers die niet bekend zijn met diaPASEF, raadpleeg de technische documentatie van de fabrikant of recente protocollen die de TIMS-DIA-workflows (trapped ion mobility spectrometry)^{beschrijven 33} om te optimaliseren voor verschillende monstertypes of gradiëntlengtes.
      OPMERKING: diaPASEF combineert TIMS met DIA om de sequentiesnelheid en -gevoeligheid te verhogen door precursor- en fragmentionen in de mobiliteitsdimensie³⁴ op elkaar af te stemmen. Zorg ervoor dat het TIMS-apparaat correct is gekalibreerd en gesynchroniseerd met de quadrupool om verkeerde uitlijning van ionenmobiliteit en massavensters te voorkomen.
   9. Gebruik de volgende instrumentinstellingen: (1) Massabereik: 100 tot 1700 m/z; (2) Mobiliteitsbereik van ionen: 0,60-1,60 V·s/cm²; (3) Botsingsenergie: 20-59 eV, hellend; (4) Aanlooptijd: 100 ms; (5) Accumulatietijd: 100 ms; (6) Massabereik voor diaPASEF: 400-1201 Da; (7) Massa vensterbreedte: 26 Da met 1 Da overlapping; (8) Aantal massastappen per cyclus: 32; (9) Cyclustijd: ~1,8 s
      OPMERKING: Deze instellingen zijn geoptimaliseerd om de dekkingsdiepte en scansnelheid in evenwicht te brengen. Kleine aanpassingen (bijv. vensterbreedte of aantal stappen) kunnen nodig zijn, afhankelijk van de complexiteit van het monster, de gradiëntlengte en de prestaties van het LC-MS-systeem. Het bereiken van de identificatie van meer dan 7.500 eiwitten voor de HeLa-digest duidt op optimale systeemprestaties. Het aantal identificaties kan per instrument verschillen en moet dienovereenkomstig worden beoordeeld.
   10. Laad 300-400 ng peptidemonster per injectie om overbelasting van de analytische kolom te voorkomen. Overbelasting kan leiden tot piekverbreding, ionenonderdrukking en verminderde reproduceerbaarheid. Bevestig de peptideconcentratie vóór de injectie met behulp van een spectrofotometer of colorimetrische peptidetest om variabiliteit tussen runs te voorkomen.
   11. Voer blanco-injecties uit tussen monstergroepen om overdracht te voorkomen. Gebruik 100% mobiele fase A (water met 0,1% FA) als injectieblanco. Dit spoelt resterende peptiden uit de kolom en vermindert vervuiling tussen runs. Bewaak de basislijn en achtergrondionen om te bevestigen dat er voldoende schoon is.
4. DIA data analyse
   1. Gebruik geschikte software ter ondersteuning van data-analyse met behulp van de directDIA-workflow³⁵ en bibliotheekvrije verwerking van DIA-proteomics-gegevens. Voer eiwitidentificatie en kwantificering uit op basis van een UniProt FASTA-database³⁶, met standaard zoekparameters en standaard kwantificeringsinstellingen.
      OPMERKING: Alle parameters, inclusief enzymspecificiteit, modificatie-instellingen, FDR-drempels en resultaten na analyse, worden gedetailleerd beschreven in het aanvullende bestand 1. Alternatieve DIA-analyseplatforms zoals DIA-NN³⁷ kunnen ook worden gebruikt als ze vergelijkbare workflows en outputs ondersteunen.
   2. Voer bibliotheekvrije directDIA uit met afkapwaarden voor q-waarden die overeenkomen met 1% FDR op het niveau van de voorloper, peptide en eiwitgroep; Sluit lokidentificaties uit voorafgaand aan downstream-analyse.
      OPMERKING: Er zijn geen iRT-standaarden toegevoegd; de prestaties werden gebenchmarkt met HeLa digest-runs aan de hand van vooraf gedefinieerde identificatie- en retentietijdstabiliteitscriteria.

Resultaten

Na de succesvolle uitvoering van het protocol moeten gebruikers interactiedatasets van hoge kwaliteit verkrijgen die geschikt zijn voor downstream dfPPI-analyse. Eiwitidentificatie wordt uitgevoerd op basis van DIA-gegevens bij 1% FDR (PSM en eiwitniveaus), en kwantificering maakt gebruik van ruwe intensiteiten of MS/MS-spectrale tellingen (niet LFQ). Verwachte QC-signaturen zijn onder meer: nauwe clustering van technische replicaten door PCA, mediane precursor/eiwit CV's van ongeveer 10-12%, hiërarchische clustering gedreven door biologische oorsprong in plaats van replicatie, en robuuste verrijking op routeniveau op g:Profiler/Reactome.

Genereren van PU-kralensonde en validatie van de activiteit vóór gebruik

PU-korrels worden bereid door een epichaperome-bindend kleinmolecuul-analoog te koppelen aan NHS-geactiveerde agarose, zoals eerder beschreven²⁵. Een standaard harspakket van 25 ml levert ~25 ml PU-korrels op die worden opgeslagen als een 1:1 slurry in isopropanol. Verdeel in tubes met een lage binding en bewaar bij -20 °C, beschermd tegen licht (bijv. wikkel in aluminiumfolie). Onder deze omstandigheden blijft een batch ≥12 maanden stabiel. Verwijder voor gebruik isopropanol en breng de korrels in evenwicht in de native bindingsbuffer (stap 1.3). Elke partij wordt gekwalificeerd bij synthese en daarna periodiek met behulp van twee assays (Figuur 2): (i) Biologische specificiteit-voer gematchte pull-downs uit van een epichaperome-hoog lysaat (bijv. MDA-MB-468) en een epichaperome-laag lysaat (bijv. ASPC1) onder identieke omstandigheden (40 μL parelslurry met 250 μg totaal eiwit; 3 uur bij 4 °C; native washes), elute/denaturering en immunoblot voor HSP90, HSC70 en HOP. Acceptatie: sterke verrijking in de epichaperome-hoge steekproef met minimaal signaal in de lage steekproef; Band-intensiteitsverhoudingen vergelijkbaar met een referentiepartij (±20-30%). (ii) Parallelle vangsten van een epichapel-hoog lysaat met PU-kralen versus gematchte inerte controlekralen, laden gelijke volumes op SDS-PAGE en Coomassie-kleuring. Acceptatie: PU-kralen tonen een rijke, hoogmoleculaire lading met minimale achtergrond in de controle-hielbaan. Een batch van 25 ml ondersteunt ~600 opnames met 40 μL per monster; veel buiten gebruik stellen als de specificiteit of het ladingprofiel na herwassen/opnieuw in evenwicht brengen buiten de acceptatie valt.

Representatieve resultaten van in-gel en on-bead protocollen

In een pilot-onderlinge vergelijking op epichaperome-hoge MDA-MB-468-cellen, produceerden in-gel en on-bead workflows zeer concordante interactomen: 4.616 van de 6.333 eiwitten (73%) werden gedeeld op het niveau van de eiwitgroep, waarbij 1.275 (20%) alleen werden gedetecteerd door in-gel en 442 (7%) alleen door on-bead. De overeenkomst op trajectniveau was zelfs nog hoger: van de 860 Reactome-termen waren er 727 (85%) gebruikelijk, waarvan 81 (9%) uniek waren voor in-gel en 52 (6%) uniek voor on-bead. De mediane eiwitintensiteiten waren ~3× hoger voor in-gel dan voor on-bead, consistent met de gel-elutieconcentratie, maar dit had geen wezenlijke invloed op de concordantie van de route.

Voorbeeld op cohortschaal en QC-handtekeningen

Als voorbeeld analyseerden we twaalf biologische monsters (Figuur 3). Vier monsters werden geëlueerd en verwerkt door in-gel digestie; acht monsters ondergingen affiniteitszuivering van epichaperome-complexen, gevolgd door on-bead-digestie en nano-LC-MS/MS in technisch duplicaat. Verwachte QC-signaturen werden waargenomen: nauwe clustering van technische replicaten door PCA, mediane precursor/eiwit CV's van ~10-12%, hiërarchische clustering gedreven door biologische oorsprong in plaats van replicatie, en robuuste verrijking op routeniveau op g:Profiler/Reactome. Deze resultaten illustreren de reproduceerbaarheid tussen workflowcomponenten, brede detectie van epichaperome-geëngageerde eiwitten en duidelijke functionele interpreteerbaarheid van differentiële interactoren op routeniveau. Routeverrijkingen afgeleid van beide workflows kwamen overeen met onze gepubliceerde dfPPI-outputs voor deze lijn, gevalideerd door verschillende biochemische en functionele orthogonale assays¹⁷.

Kwaliteit van het inputmateriaal en de vergisting

Een representatieve met Coomassie gekleurde SDS-PAGE-gel wordt getoond voor vier van de monsters die zijn verwerkt door in-geldigestie (Figuur 3A). De gel illustreert reproduceerbare eiwitvangst en consistente verdeling van banding over rijstroken, wat een succesvolle verrijking van eiwitcomplexen uit natuurlijke lysaten bevestigt voorafgaand aan massaspectrometrie. Deze gedenatureerde interactoomprofielen tonen aan dat de stap voor het vastleggen van affiniteit voldoende en consistente eiwitinput oplevert voor downstream MS-analyse.

De gevangen interactomen vertonen een brede eiwitdekking over molecuulgewichten, wat een weerspiegeling is van succesvolle verrijking van eiwitassemblages uit natuurlijke lysaten. Van cruciaal belang is dat dit herstel niet beperkt is tot overvloedige eiwitten, maar ook interactoren met een lagere abundantie omvat, die de complexiteit en diepgang bieden die nodig zijn voor analyse op systeemniveau.

Controles en specificiteit op schaal

In deze workflow gebruiken we controlekralen alleen voor het voorklaren (zie stap 1.3 en 1.4); We voeren geen routinematige vergelijkende opnames met "inerte sondes" uit op elk biospecimen. Voor grote klinische cohorten verbruiken inerte vangsten kostbaar materiaal, maar voegen ze weinig interpretatieve waarde toe voor dfPPI omdat stroomafwaartse statistieken werken op netwerk-/routeniveau, niet op het niveau van een enkel eiwit. Willekeurige of harskleverige verontreinigingen verschijnen niet op een gecoördineerde manier tussen leden van dezelfde route en overleven daarom geen verrijkingstests op routeniveau of consistentiefilters op cohortniveau. In de praktijk wordt specificiteit gewaarborgd door (i) pre-clearing, (ii) nauwkeurige reproduceerbaarheid van replicaten (PCA/CV), en (iii) routestabiliteit over drempels heen en herbemonstering. Historisch gezien evalueerden we blokexperimenten met inerte vangst en oplosbare concurrent (PU-H71) en ontdekten dat ze de resultaten van de dfPPI-route niet veranderden 16,17,21, terwijl ze onvervangbaar klinisch materiaal consumeerden; Daarom reserveren we ze alleen voor verificatie door piloten. Voor groepen die de voorkeur geven aan expliciete controles op run-niveau, merken we op dat beide opties compatibel zijn met het protocol, maar niet vereist zijn voor dfPPI-analyses op cohortschaal.

Repliceer nummer

Pathway-inferentie in dfPPI is gebaseerd op sets en vereist geen vast replicatienummer. Met robuuste acquisities kan een enkele steekproef per aandoening verkennende trajectgesprekken opleveren. Voor bevestigende analyses raden we ≥3 biologische replicaten per aandoening aan voor gekweekte cellen (met dubbele LC-MS/MS-injecties indien mogelijk) en cohort-geschikte Ns voor menselijk weefsel (meestal ≥5-10 per groep voor ontdekking, groter indien gestratificeerd door covariaten). We beoordelen de stabiliteit door middel van replicate clustering (PCA), mediane precursor CV (doel ~10-15%) en bootstrap/resampling van verrijkingsresultaten.

Technische reproduceerbaarheid over runs heen

De technische reproduceerbaarheid werd geëvalueerd met behulp van hoofdcomponentenanalyse (PCA) (Figuur 3B) van peptide-intensiteitsgegevens van door kralen verteerde monsters (acht muizenhersenen, in tweevoud uitgevoerd). Replicaten dicht geclusterd voor elk biologisch monster, terwijl verschillende monsters netjes gescheiden zijn langs de eerste twee hoofdcomponenten. De eerste twee hoofdcomponenten verklaarden respectievelijk 28,6% en 22,0% van de totale variantie en verdeelden de steekproeven op basis van biologische verschillen in plaats van technische ruis. Deze structuur weerspiegelt een hoge analytische consistentie en bevestigt dat de methode biologisch relevante verschillen behoudt, wat van cruciaal belang is om dfPPI in staat te stellen toestandsspecifieke netwerkherbedrading te detecteren.

Consistentie van detectie in verschillende monsters

Variatiecoëfficiënt (CV)-verdelingen voor precursorionenintensiteiten tonen aan dat de overgrote meerderheid van de kenmerken onder 20% CV valt, met mediaanwaarden variërend van 9,7% tot 11,9% onder alle omstandigheden (Figuur 3C). Deze resultaten bevestigen consistente MS-detectie en peptideherstel over replicaten.

Dynamisch bereik en proteoomdekking

Hiërarchische clustering van log-getransformeerde eiwitabundantiewaarden (Figuur 3D) toonde een sterke scheiding van monsters en behoud van variatie tussen monsters, terwijl het ook het brede dynamische bereik weerspiegelde dat werd vastgelegd in de MS-runs. Eiwitintensiteiten varieerden van interactoren met een lage abundantie tot hoogverrijkte eiwitgroepen, zoals gevisualiseerd door de blauw-naar-gele gradiënt. De gegevens bevestigen dat het protocol de detectie van diverse eiwitassemblages en interactoren mogelijk maakt, waarbij zowel kern- als perifere componenten worden vastgelegd.

Functionele interpretatie via dfPPI

Om de interpretatie en reproduceerbaarheid te ondersteunen, bieden we twee aanvullende bronnen voor dfPPI-datasetanalyses: (i) een interactieve Shiny-webapplicatie (https://epichaperomics.mskcc.org/ bijgewerkt naar https://dfppi.mskcc.org) en (ii) open, scriptbare workflows en Cytoscape-sessiebestanden die zijn vrijgegeven met eerdere dfPPI-onderzoeken (GitHub/Zenodo)38,39,40,41. De app neemt ruwe intensiteit of MS/MS-spectrale tellingstabellen op, voert kwaliteitscontrole uit (clustering repliceren, controles van ontbrekende waarden), optionele ruis-/batchverwerking (covariate regressie), identificeert differentieel betrokken eiwitten en levert route-/netwerkuitlezingen via interactieve plots en downloadbare rapporten - zonder dat codering nodig is.

dfPPI behandelt gemeten intensiteiten of spectrale tellingen als proxy's voor 'epichaperome engagement'. Gebruikers selecteren een differentiële connectiviteit (DC) model, variërend van een eenvoudige tweezijdige t-test (standaard) tot covariaatbewuste lineaire modellen; de DC-stap kan ook worden overgeslagen. Na DC stellen gebruikers drempels voor vouwverandering en p-waarde in (standaardinstellingen weerspiegelen eerder dfPPI-werk; bijv. FC > 1.0, nominale p ≤ 0,25) om kandidaten door te geven aan verrijking. Er zijn twee verrijkingsengines beschikbaar: GSEA op basis van rang (op basis van ondertekende statistieken) en oververtegenwoordiging (hypergeometrisch) via g:Profiler met meervoudige testcorrectie. Voor een chaperonne-centrische context biedt de pijplijn ook Interactome Enrichment Analysis (iEA) om te testen of directe interactoren van chaperonne-scaffold-eiwitten oververtegenwoordigd zijn tussen differentieel geëngageerde eiwitten. Netwerkweergaven wegen knooppunten/randen op effectgrootte en/of statistische ondersteuning, waardoor visualisatie van gecoördineerde herbedrading mogelijk is in plaats van effecten van één eiwit. Voor gebruikers die de voorkeur geven aan gescripte workflows, zijn de onderliggende R-code en Cytoscape-sessiebestanden die worden gebruikt om netwerkkaarten en -figuren samen te stellen, openbaar beschikbaar (bijv. GitHub/Zenodo)38,39,40,41 met de bijbehorende publicaties 17,18,19,20 en kunnen lokaal worden uitgevoerd of worden aangepast voor nieuwe datasets.

Een permissieve cutoff (fold-change > 1,0; nominale p ≤ 0,25) wordt aanbevolen om interactietoestandssignalen te behouden die worden geïntroduceerd door affiniteitsverrijking. Vervolgens verschuiven we de statistische controle naar het pathway-niveau: kandidaat-eiwitten worden getest op verrijking in gecureerde ontologieën (bijv. GO, Reactome) met behulp van g:Profiler, en multi-testing-adjusted pathway p-waarden bepalen de significantie en rangschikking. Dit ontwerp weerspiegelt het doel van dfPPI - het detecteren van gecoördineerde netwerkherbedrading, niet differentiële expressie van één eiwit - en vermijdt proteoombrede normalisatie die verrijkingssignalen in pull-down datasets kan verdoezelen. Zoals aangetoond in eerdere dfPPI-studies ^17,20, leveren mildere drempels op eiwitniveau stabiele, ziekterelevante route-oproepen op, terwijl andere modellen (bijv. lineaire modellen met empirische Bayes-krimp) kunnen worden gebruikt wanneer variantie of batchcovariaten dit rechtvaardigen, zonder de kernroute-centrische gevolgtrekking te wijzigen.

Het vastleggen van affiniteit is onvermijdelijk een co-verrijking van "kleverige" eiwitten (bijv. keratine, cytoskeletale eiwitten, ribosomale eiwitten), en PU-kralen kunnen ook algemene chaperonne-interactoren vangen. In dfPPI sturen deze om verschillende redenen de biologie niet aan. Ten eerste verwijderen de pre-clearing en strenge wasbeurten de meeste niet-specifieke bindmiddelen. Ten tweede vertonen generieke bindmiddelen, waaronder veel chaperonne-interactoren, vouwveranderingen in de buurt van 1,0 onder alle omstandigheden en/of inconsistente detectie en voldoen ze dus niet aan de FC/p-waardeschermen. Ten derde is de verrijking van de route set-based en achtergrondbewust: de significantie wordt berekend aan de hand van het experimentspecifieke gedetecteerde proteoom, en vereist dat meerdere leden van dezelfde route samen variëren. Willekeurige of overvloedige verontreinigingen zijn verspreid over vele termen en vormen daarom geen coherente, FDR-significante verrijkingen. Geen enkel eiwit - contaminant of anderszins - kan een route-oproep "maken". Ten vierde interpreteert dfPPI coherentie op netwerkniveau, niet afzonderlijke eiwitten; pathway-aanroepen moeten meervoudige testcorrectie overleven (bijv. g:Profiler aangepaste p-waarden), minimale gensetgroottes en replicatieconsistentie. Samen met gematchte preclears met inerte kralen en filtering van veelvoorkomende verontreinigingen, maakt dit raamwerk dfPPI robuust voor de achtergrond: zelfs als er honderden niet-informatieve eiwitten aanwezig zijn, veranderen ze de rangschikking van de route niet, omdat de verrijking afhangt van het aantal concordante eiwitten in een route, niet van de totale lengte van de eiwitlijst. Bovendien heeft elke tot nu toe gepubliceerde dfPPI-studie voorspellingen op route- en netwerkniveau bevestigd met uitgebreide experimentele validatie (bijv. gerichte biochemie, signaaluitlezingen, genetische of farmacologische verstoringen)16,17,18,19,20, wat aantoont dat dfPPI-outputs niet alleen luidruchtige eiwitlijsten zijn, maar reproduceerbare kaarten van ziekterelevante PPI-netwerkdisfunctie.

Om het functionele landschap te beoordelen dat is vastgelegd door de dfPPI-dataset uit Figuur 3D, hebben we een verrijkingsanalyse uitgevoerd met behulp van g:Profiler⁴² (Figuur 3E). De resultaten tonen een robuuste annotatiedekking aan in alle belangrijke functionele ontologieën, waaronder het biologische proces van de genontologie (GO-BP), de moleculaire functie (GO-MF) en de cellulaire component (GO-CC), evenals gecureerde routebronnen zoals Reactome, KEGG en WikiPathways. Deze representatieve analyse illustreert een belangrijk sterk punt van de dfPPI-benadering: het vermogen om biologisch betekenisvolle pathway-associaties te onthullen over verschillende annotatietypen, zelfs uit relatief kleine steekproefomvang. De brede Reactome-dekking die hier wordt waargenomen, weerspiegelt waarschijnlijk het feit dat dfPPI gebaseerd is op het opnieuw bedraden van eiwitnetwerken op interactieniveau, die rechtstreeks in kaart worden gebracht op multicomponentprocessen en signaalcascades, die goed vertegenwoordigd zijn in de structuur van Reactome. Omdat dfPPI gebruik maakt van veranderingen in connectiviteit in plaats van expressie, is het bijzonder geschikt om functionele verschuivingen op systeemniveau te detecteren die mogelijk worden gemist door transcriptomics of proteomics met alleen overvloed. Deze bevinding komt overeen met ander werk waarbij Reactome consequent de meest coherente en ziekterelevante verrijkingen opleverde van dfPPI-afgeleide eiwitsets 14,15,16,17,18,20,21.

Reactoom is georganiseerd rond multi-eiwit processen en complexen (signaaltransductiecascades, celcyclusmodules, metabole assemblages). Omdat dfPPI epichaperome-geëngageerde interactoren verrijkt - d.w.z. groepen eiwitten die functioneel worden gerekruteerd in ziektesteigers - bevat de output van nature samenhangende routemodules in plaats van geïsoleerde hits. Deze gecoördineerde vangst levert een brede, zeer significante Reactome-dekking op over gerelateerde subpaden en hiërarchieën. Daarentegen rapporteren abundantie-centrische omics (transcriptomics; globale proteomics) expressieveranderingen, geen interactietoestanden; single-bait AP-MS of nabijheidslabels bieden lokale buurten rond één gemanipuleerd aas tegelijk; En cross-linking/co-fractionatie levert vaak schaarse connectiviteit op. Geen van deze produceert op zichzelf routinematig de contextgeselecteerde sets op systeemniveau die dfPPI terugstuurt van een enkele, endogene vangst in cellen of weefsel. Het resultaat is een verrijking van de route die zowel breed is (meerdere Reactome-takken lichten op) als mechanistisch coherent (eiwitten verschuiven samen omdat hun interacties - niet alleen hun hoeveelheden - opnieuw worden bedraad door epichaperomes). We merken echter op dat dfPPI complementair is, geen vervanging: elke interactomics-methode heeft verschillende sterke punten en beperkingen, en de optimale keuze (of combinatie) moet worden bepaald door de biologische vraag, de beperkingen van de steekproef en de vereiste resolutie.

Samen bevestigen deze resultaten dat het protocol reproduceerbare, biologisch informatieve datasets oplevert die kunnen worden gebruikt om differentiële interactoom-remodellering over ziektetoestanden of experimentele verstoringen te ontdekken. De dfPPI-output is zeer geschikt voor integratie met padverrijkingsframeworks en maakt het mogelijk om functionele herbedradingsgebeurtenissen in kaart te brengen die niet kunnen worden gedetecteerd met standaard op overvloed gebaseerde methoden.

Figuur 1: Overzicht van het dfPPI-platform. (A) Het dfPPI-platform (dysfunctional Protein-Protein Interactome) maakt het mogelijk om ziektespecifieke PPI-netwerkdisfuncties te identificeren via een chemoproteomische workflow. Sectie 1 omvat monstervoorbereiding en interactoomverzameling met behulp van epichaperome-gerichte chemische sondes die zijn geïmmobiliseerd op affiniteitsmatrices (bijv. PU-kralen). Secties 2 en 3 schetsen twee compatibele spijsverteringsworkflows - op kraal of in-gel - gevolgd door labelvrije LC-MS/MS voor identificatie van interactoom. Computationele analyses, inclusief statistische modellering en routeverrijking, worden uitgevoerd met behulp van de dfPPI bio-informaticapijplijn, die niet in dit protocol wordt behandeld, maar vrij beschikbaar is op https://epichaperomics.mskcc.org/. (B) Principe van dfPPI. In ziekterelevante contexten vormen endogene epichaperomes supramoleculaire steigers die PPI-netwerken reorganiseren. Op epichapelème gerichte chemische sondes (bijv. PU-kralen of gelijkwaardig) vangen deze steigers samen met hun gebonden tussenactoren rechtstreeks van intacte cellen of van inheemse lysaten, wat een pull-down met meerdere aasjes oplevert in een enkel experiment. Op elkaar afgestemde besturingen (bijv. inerte rupscontrole en/of competitie met vrije sonde) kunnen parallel worden verwerkt. Gevangen materiaal wordt geëlueerd en verteerd op kralen of in gel, geanalyseerd door LC-MS/MS, en eiwitten worden gekwantificeerd (intensiteit of MS/MS-spectrale tellingen). Het resulterende interactoom wordt gebruikt om differentiële interactoren onder verschillende omstandigheden te berekenen en om pad-/netwerkverrijking uit te voeren, waardoor contextspecifieke PPI-disfunctie op systeemniveau aan het licht komt. De workflow vereist geen genetische tagging of overexpressie, is compatibel met zowel cellen als weefsels en schaalt naar cohortstudies. Omgekeerd concentreert traditionele affiniteit-zuivering-MS zich op één getagd aas tegelijk, waardoor een lokale buurt per construct wordt geproduceerd en er doorgaans veel constructen/runs nodig zijn om een netwerk te bemonsteren. Daarentegen gebruikt dfPPI endogene epichaperomes als aas, waarbij veel disfunctionele PPI's tegelijkertijd uit het oorspronkelijke systeem worden gevangen, wat de ontdekking van ziektespecifieke netwerkherbedrading versnelt en uitlezingen op padniveau biedt van een enkele opname. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Validatie van PU-kralenlot en capture-specificiteit. (A) Biologische specificiteit en consistentie van partij tot partij. MDA-MB-468 (epichaperome-hoog) en ASPC1 (epichaperome-laag) cellen werden gelyseerd in natieve buffer (20 mM Tris, pH 7,4; 20 mM KCl; 5 mM MgCl₂; 0,01% NP-40; protease/fosfataseremmers). Voor elke vangst werd 40 μL PU-parelslurry geïncubeerd met 250 μg totaal eiwit (1 μg/μL) gedurende 3 uur bij 4 °C met rotatie. Kralen werden gewassen in inheemse buffer; complexen werden gedenatureerd/geëlueerd in ~100 μL SDS-monsterbuffer. 5-10 μL van elk eluaat werd opgelost door SDS-PAGE en immunogedept voor HSP90, HSC70 en HOP. Invoerlysaten worden ter referentie weergegeven. Twee partijen PU-kralen (Batch 1, vers; Batch 2, verouderd) leveren een sterke verrijking op in MDA-MB-468 en een minimaal signaal in ASPC1, wat aantoont dat de specificiteit en partijconsistentie behouden blijven. (B) Wereldwijde vracht versus controleparels. MDA-MB-468-lysaten werden verwerkt zoals in (A) met PU-kralen of gematchte controlekralen. ~20 μL van elk eluaat werd geladen, gescheiden door SDS-PAGE, en Coomassie-gekleurd. PU-korrels herstellen een complexe, high-MW-lading die kenmerkend is voor epichaperome-gebonden assemblages, terwijl controlekralen een minimale achtergrond vertonen. Moleculair gewicht markers (kDa) worden aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Representatieve resultaten van dfPPI affiniteitsregistratie, interactoomidentificatie en bio-informaticaanalyses. (A) Coomassie-gekleurde SDS-PAGE-gel van eiwitten geëlueerd uit PU-bead-affiniteitsvangsten van epichaperome-gebonden interactomen van vier representatieve menselijke hersenmonsters (PT1-PT4). Kralengebonden eiwitassemblages werden gedenatureerd door te koken in SDS-monsterbuffer, opgelost door SDS-PAGE en gekleurd om het herstel van interactoom over molecuulgewichten te beoordelen. Elk monster werd in een aparte baan geladen, met een lege baan tussen de monsters om kruisbesmetting te minimaliseren; Een zwak signaal dat af en toe in deze lege rijstroken wordt waargenomen, weerspiegelt een kleine overloop van het monster tijdens de elektroforese. Deze gels zijn representatief voor monsters die zijn ingediend bij de MS-faciliteit, waar elke baan werd opgedeeld in vijf plakjes voor in-gel digestie en eiwitidentificatie door MS. (B) Hoofdcomponentenanalyse (PCA) van geïdentificeerde eiwitintensiteiten van door kralen verteerde epichaperome interactomen van acht representatieve muizenhersenmonsters (uitgevoerd in tweevoud) onthult nauwe clustering van technische replicaten en duidelijke biologische scheiding langs PC1 en PC2. Dit bevestigt een hoge technische reproduceerbaarheid en voldoende biologische variantie voor een robuuste dfPPI-analyse. De gegevensstructuur toont aan dat verschillen op interactieniveau - en niet technische artefacten - de scheiding van monsters aansturen, wat een sterke basis biedt voor downstream differentiële interactoommodellering zonder dat kunstmatige normalisatie nodig is. (C) Variatiecoëfficiënt (CV)-verdelingen voor precursorionenintensiteiten in de acht steekproefgroepen vertonen een consistent lage variantie, met mediane CV's variërend van 9,7% tot 11,9% (aangegeven door verticale stippellijnen). Deze lage CV's benadrukken de reproduceerbaarheid en robuustheid van de MS-detectie- en kwantificeringspijplijn. De consistentie ondersteunt het gebruik van ruwe intensiteit of MS/MS-waarden als betrouwbare input voor dfPPI-analyse, waarbij variantie in interactiesterkte - niet globale eiwitexpressie - het biologische signaal van belang is. (D) Hiërarchische clustering heatmap van log 2-getransformeerde eiwitintensiteitswaarden in alle monsters (met technische duplicaten weergegeven). Monsters clusteren op biologische oorsprong in plaats van te repliceren, wat een robuuste vangst van epichaperome-gebonden interactomen en het behoud van biologisch relevante variantie bevestigt. Een breed dynamisch bereik en consistente detectie van eiwitten ondersteunen de kwaliteit van de dataset voor dfPPI-analyse verder. De schaalbalk geeft log 2-getransformeerde eiwitintensiteitswaarden weer, variërend van 2 (blauw, lage abundantie) tot 14 (geel, hoge abundantie). (E) Manhattan-plot van routeverrijkingsanalyse uitgevoerd op differentieel interagerende eiwitten geïdentificeerd door dfPPI. De verrijking werd uitgevoerd met behulp van g:Profiler, en belangrijke termen worden uitgezet door -log₁₀(p-waarde), gekleurd door annotatiebron: GO Molecular Function (GO:MF), GO Biological Process (GO:BP), GO Cellular Component (GO:CC), KEGG, Reactome, WikiPathways en Human Phenotype Ontology (HP). Deze output vertegenwoordigt het kernnut van dfPPI: het blootleggen van biologisch betekenisvolle functionele routes die verstoord zijn door epichaperome-gedreven interactoomremodellering. De brede annotatiedekking onderstreept het inzicht op systeemniveau dat met deze aanpak kan worden bereikt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Methode	Wat het vastlegt	Grote troeven	Belangrijkste beperkingen	Typisch gebruik	Schaalbaarheid (cohorten)
AP-MS (affiniteitszuivering-MS)	Directe/bijna-directe interactoren van een enkel aas	Hoge specificiteit; kwantitatief; Goed voor complexe compositie	Vereist aas/tag/antilichaam; één aas per keer; Kan missen van voorbijgaande aard / zwak	Definieer partners van een eiwit van belang	Laag-matig (veel aas nodig)
Nabijheidslabeling (bijv. BioID/APEX-varianten)	Eiwitten in de buurt van een aas op nanoschaal in de loop van de tijd	Vangt voorbijgaande/zwakke buren; Werkt in levende cellen	Genetische manipulatie; off-target etikettering; parameter-zwaar	Lokale buurtkaarten; dynamica	Laag-matig (techniek per aas)
XL-MS (vernetting MS)	Ruimtelijke nabijheid/contacten binnen/tussen eiwitten	Structurele beperkingen; Legt voorbijgaande contacten vast	Complexe analyse; onderste proteoom breedte; Steekproef-specifiek	Structurele/contextuele topologie	Laag (gespecialiseerd)
Co-fractionering/MS (CF-MS)	Co-elutie van inheemse vergaderingen	Geen tagging; inheemse vergaderingen	Arbeidsintensief; complexe gevolgtrekking; beperkte gevoeligheid	Wereldwijd complex landschap	Gematigd
CETSA/TPP	Co-stabiliteit/co-aggregatie profielen	Label-vrij; Inheemse omstandigheden	Indirect voor PPI's; Oplosbaarheid beperkingen	Streef naar betrokkenheid; Thermische verschuivingen	Gematigd
dfPPI (epichaperomics)	Interactie op netwerkniveau herbedrading vastgelegd door endogene epichaperomes als multiplex-aas	Endogeen; geen tagging; één vangst ondervraagt duizenden disfunctionele PPI's; uitlezingen van trajecten/netwerken; weefsel-compatibel; cohort-vriendelijk	Alleen van toepassing op de context van de ziekte; gespecialiseerde sondes (PU-kralen, YK5-B); Niet bedoeld voor generieke complexe ontdekkingen	Remodellering van ziekte-context interactoom, prioritering van routes, vorming van hypothesen	Hoog (honderden monsters haalbaar)

Tabel 1: Vergelijking van PPI-mapping-benaderingen en dfPPI. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullend bestand 1: Volledige parameterinstellingen van Spectronaut. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Het hier beschreven protocol maakt het mogelijk om disfunctionele PPI's in inheemse biologische monsters in kaart te brengen met behulp van het dfPPI-platform. In tegenstelling tot traditionele methoden die disfunctie afleiden uit overvloed of expressieveranderingen, legt dit platform netwerkherbedrading op structureel niveau vast door ziektespecifieke interactoren te isoleren door affiniteitszuivering met epichaperome-gerichte sondes, gevolgd door labelvrije intensiteit op intensiteit gebaseerde kwantitatieve MS. Hoewel de huidige toepassing zich richt op postmortaal hersenweefsel, is de methode breed toepasbaar op andere soorten monsters en ziektemodellen, waaronder gekweekte cellen en weefsels uit modellen van kanker, neurodegeneratie en immuundisfunctie 16,17,18,19,20,22,23.

dfPPI vertrouwt op sondes die kinetisch epichaperomes selecteren en de assemblages vangen met hun gebonden interactoren. PU-kralen (afgeleid van epichaperome-bindende chemotypes zoals PU-H71/PU-AD) grijpen HSP90-nucleated epichaperomes niet-covalent maar met een lange verblijftijd aan, een kenmerk van kinetische selectiviteit voor de epichaperome conformatie ten opzichte van conventionele chaperonnecomplexen²³. YK5-B is een gebiotinyleerde, covalente sonde gericht op HSC70 in epichaperomes, waardoor in-cell capture voorafgaand aan lysis mogelijk is en endogene PPI's¹⁷ behouden blijven. Selectiviteit komt voort uit ziekte-geassocieerde PTM's die HSP90/HSC70-conformaties en pocketchemie hermodelleren en epichaperome-assemblages stabiliseren 14,23,43,44; deze veranderingen resulteren in een hoge affiniteit, langzame_{k-off-binding} voor niet-covalente sondes van het PU-type⁴⁵ (en maken covalente vangst mogelijk met HSC70-gerichte YK5-B), waardoor epichaperome-complexen kinetisch behouden blijven en hun directe en indirecte interactoren voor LC-MS/MS worden geco-geïsoleerd. In de praktijk zijn PU-korrels optimaal voor lysaat/homogenaatworkflows, terwijl YK5-B het vastleggen van levende cellen ondersteunt; beide behouden contextafhankelijke assemblages die kunnen worden geïdentificeerd door LC-MS/MS en kunnen worden gebruikt voor downstream dfPPI-analyse.

Voor dfPPI is gespecialiseerde expertise in chemie vereist om de opnamesondes te synthetiseren. Deze vereiste is echter niet uniek voor dfPPI: veelgebruikte PPI-methoden (AP-MS, proximity labeling, XL-MS) zijn ook afhankelijk van gespecialiseerde vaardigheden, bijv. klonen/engineering van getagd aas, het genereren van stabiele cellijnen, optimalisatie van labeling/crosslinking en complexe bio-informaticapijplijnen. Daarentegen vermijdt dfPPI genetische manipulatie en overexpressie van aas, werkt het rechtstreeks op inheemse cellen of weefsels (inclusief schaarse klinische biospecimens) en maakt het gebruik van standaard affiniteitsvangst- en LC-MS-workflows die al routine zijn in proteomics-kernen. Om de adoptiebarrières te verlagen, zijn gevalideerde PU-beads en gematchte controlebeads beschikbaar via MTA van het chioselaboratorium, en de handling/QA-stappen zijn volledig gespecificeerd in stap 1.3 en 1.4. Ten slotte wordt de analyse ondersteund door een webgebaseerde dfPPI-app die de vereiste statistieken en uitlezingen van trajecten/netwerken implementeert, waardoor de bio-informaticalast wordt verminderd (d.w.z. voor gebruikers zonder codeerachtergrond en alleen basisvaardigheden op het gebied van bio-informatica).

AP-MS, XL-MS, nabijheidslabeling, co-fractionering en CETSA/TPP beantwoorden elk verschillende vragen (directe bindmiddelen, ruimtelijke nabijheid, buurtlabeling, co-assemblage of thermische co-stabiliteit). dfPPI is de methode bij uitstek wanneer het doel is om endogene, contextafhankelijke herbedrading in ziekte in kaart te brengen, vooral in natuurlijke weefsels of grote klinische cohorten waar genetische tagging niet haalbaar is, en wanneer uitlezingen op route-/netwerkniveau van een enkele opname gewenst zijn. dfPPI gebruikt epichaperomes als multiplex-aas om gecoördineerde interactieveranderingen tussen veel eiwitten in één pull-down vast te leggen, waardoor schaalbare LC-MS/MS-identificatie en routegerichte analyse van primair materiaal mogelijk is. In de praktijk kan dfPPI downstream, op aas gerichte validatie zaaien (bijv. AP-MS op specifieke knooppunten), terwijl traditionele methoden de topologie (directe contacten, ruimtelijke beperkingen) kunnen verfijnen voor complexen die door dfPPI worden gemarkeerd. Zie Tabel 1 voor een zij-aan-zij vergelijking.

Verschillende cruciale stappen zijn van invloed op het succes van de workflow. Ten eerste zijn hoogwaardige eiwitextracten essentieel. Dit vereist een zorgvuldige behandeling van weefsels of cellen - idealiter ingevroren en bewaard bij -80 °C - om proteolyse te minimaliseren en inheemse complexen te behouden. Over de opname van zowel protease- als fosfataseremmers kan niet worden onderhandeld: de integriteit van epichaperome, die in deze test als het functionele "lokaas" fungeert, hangt af van specifieke posttranslationele modificaties van kerncomponenten zoals HSP90^23,43. Fosforylering van Ser226 en Ser255 is bijvoorbeeld essentieel voor het stabiliseren van de epichaperome conformatie en het behoud van de steigerfunctie²³. Het weglaten van fosfataseremmers riskeert structurele ineenstorting en verlies van biologische specificiteit.

Een andere belangrijke bepalende factor is de kwaliteit en behandeling van de PU-beads affiniteitsmatrix. Kralen moeten worden bewaard in 100% isopropanol bij -20 °C en worden gebruikt binnen een bepaald activiteitsvenster, idealiter binnen 1-2 jaar. Activiteit moet worden gevalideerd voorafgaand aan kritische experimenten, aangezien verouderde kralen een verminderd bindingsvermogen of verhoogde niet-specifieke interacties kunnen vertonen. De incubatietijd en eiwitinput moeten ook worden geoptimaliseerd: overincubatie kan de achtergrond verhogen, terwijl onvoldoende eiwitinput de detectiediepte in gevaar kan brengen. We raden incubaties van 3 uur en pilot-pulldowns aan om de juiste invoer voor elk monstertype te kalibreren.

Twee spijsverteringsstrategieën zijn compatibel met dit protocol: on-bead en in-ling. Hoewel beide workflows reproduceerbare resultaten opleveren, biedt elk compromissen. In-gel digestie kan verontreinigingen zoals keratine introduceren en vereist extra behandelingsstappen. On-bead-digestie stroomlijnt de workflow en heeft over het algemeen de voorkeur wanneer de doorvoer van monsters of de invoerhoeveelheid beperkt is. De hoeveelheden protease moeten echter worden gekalibreerd op basis van de totale eiwitinput: hoewel de methode is ontworpen voor 750 ng trypsine, kan onvolledige spijsvertering optreden als het eiwitgehalte hoog is, wat leidt tot gemiste splitsingen en verminderd peptideherstel. Het is raadzaam om de efficiëntie van de spijsvertering te beoordelen en de enzyminput dienovereenkomstig aan te passen. Alle verteringsstappen moeten worden uitgevoerd in buizen met een lage binding met behulp van vers bereide, contaminatievrije reagentia om consistentie te garanderen en achtergrond te minimaliseren.

De eiwitbelasting per LC-MS-injectie is afhankelijk van de afvangworkflow, de peptideopbrengst en de kolomcapaciteit. Voor on-bead-digesten geanalyseerd op standaard nano-LC C18-kolommen (~50-75 μm ID, ~15-25 cm), laden we doorgaans 300-500 ng per injectie; We hebben geen prestatieverbeteringen waargenomen boven ~400-500 ng, terwijl hogere belastingen ionenonderdrukking en piekverbreding riskeren. Voor in-gel workflows (bijv. vijf plakjes per baan) injecteren we over het algemeen ~25% van het ontzoute materiaal per plakje per replicaat en behouden we ~50% als back-up voor herinjectie indien nodig. Meet in alle gevallen de peptideconcentratie voorafgaand aan de injectie, controleer de lineaire respons met een QC-digest en stem de belasting af zodat de chromatografische piekvorm en identificatiediepte behouden blijven zonder overbelasting.

Labelvrije kwantificering via DIA wordt veel gebruikt in proteomics vanwege de reproduceerbaarheid en diepte⁴⁶. In de context van experimenten met het vastleggen van affiniteiten zoals deze - waarbij het doel is om eiwitten te identificeren die interageren met epichaperome steigers in plaats van het meten van wereldwijde eiwitovervloed - zijn normalisatiestrategieën zoals MaxLFQ echter niet geschikt. Deze benaderingen gaan uit van uniforme input en proteoombrede gelijkenis, die worden geschonden door de verrijkingsstap die inherent is aan dit protocol. In plaats daarvan bieden intensiteitswaarden of MS/MS-spectrale tellingen voldoende en biologisch zinvolle kwantificering voor stroomafwaartse functionele analyse. Deze metrieken weerspiegelen de relatieve interactie, sterkte of frequentie van eiwitten met epichaperomes onder verschillende omstandigheden. Zoals aangetoond in eerdere studies 16,17,18,20, zijn deze waarden zeer geschikt voor interactoomanalyses op systeemniveau, zoals dfPPI, die veranderde biologische routes identificeren zonder te vertrouwen op proteoombrede normalisatie. Door de werkelijke biologische variantie te behouden die door ziekte of behandeling wordt geïntroduceerd, maakt kwantificering op basis van intensiteit of MS/MS het mogelijk om disfuncties van PPI-netwerken nauwkeurig en robuust in kaart te brengen.

Hoewel affiniteitsopname de zoekruimte verkleint ten opzichte van het hele lysaat, bevatten dfPPI-pulldowns nog steeds honderden tot duizenden eiwitten met een breed dynamisch bereik, plus een verrijkte achtergrond. Voor vergelijkingen op cohortschaal leidt de stochastische precursorselectie van DDA tot run-to-run ontbrekende waarden en variabele steekproeven van interactoren met een lage abundantie¹⁸. DIA fragmenteert systematisch alle ionen in vooraf gedefinieerde vensters, wat zorgt voor een grotere diepte, minder ontbrekende waarden en hogere run-to-run reproduceerbaarheidseigenschappen die cruciaal zijn wanneer downstream-inferentie op route-/netwerkniveau is in plaats van enkelvoudig eiwit. Daarom standaardiseren we op DIA voor dfPPI.

Zoals bij alle methoden voor het vastleggen van affiniteit, is niet-specifieke eiwitbinding een inherente overweging. Eiwitten kunnen worden vastgehouden door plakkerigheid aan de hars, hoge overvloed of aggregatie. Hoewel dergelijke niet-specifieke interactoren in het pull-down-eluaat kunnen voorkomen, ondermijnt hun aanwezigheid de downstream-analytische doelstelling van dit protocol niet¹⁷. De dfPPI-workflow is niet ontworpen om binaire interacties te definiëren, maar eerder om patronen van PPI-herbedrading op systeemniveau te extraheren. Functionele verrijkingsanalyses worden uitgevoerd op differentiële interactoren en maken gebruik van netwerkgebaseerde statistieken om gecoördineerde veranderingen op padniveau aan het licht te brengen. Zoals aangetoond in eerder werk¹⁷, minimaliseert deze benadering op systeemniveau de impact van geïsoleerde niet-specifieke eiwitten en maakt het mogelijk om robuuste biologische conclusies te trekken uit gegevens op cohortniveau.

Vergeleken met conventionele benaderingen voor het in kaart brengen van interactomen, zoals co-immunoprecipitatie, nabijheidslabeling of cross-linking, biedt het dfPPI-platform een duidelijk voordeel: het legt functionele interactoomremodellering vast onder ziekterelevante omstandigheden zonder dat aastechniek of overexpressie nodig is. Omdat de methode eiwitcomplexen isoleert die rond supramoleculaire epichaperomes zijn gevormd, detecteert het opkomende eiwitassemblages die niet aanwezig zijn in gezonde systemen, waardoor nieuwe ziekteverwekkers kunnen worden ontdekt. De aanpak is schaalbaar en aanpasbaar in weefsels, soorten en ziektetoestanden, en heeft al unieke inzichten opgeleverd in de hermodellering van proteoom bij kanker en neurodegeneratie. Als zodanig biedt deze methode een krachtig hulpmiddel voor het blootleggen van functionele netwerken die verstoord zijn bij ziekten bij de mens.

Naast de voorbeelden hier, is dfPPI goed gepositioneerd voor (i) grote klinische cohorten om patiënten te stratificeren op basis van netwerkdisfunctie en om farmacodynamische biomarkers te ontdekken die rapporteren over doelbetrokkenheid en routecorrectie; (ii) longitudinale bemonstering (bijv. pre-/posttherapie, ziektestadiëring) om herbedradingstrajecten te volgen en responders te voorspellen; (iii) integratie met fosfoproteomics en andere PTM-bewuste omics om veranderingen in de interactietoestand te koppelen aan stroomopwaartse signalering; (iv) ruimtelijk opgeloste vangsten uit microontlede regio's (tumor-normale interfaces, hersensubregio's) om de pathobiologie van lokale netwerken in kaart te brengen; (v) verstoringsschermen (genetisch of samengesteld) waarbij dfPPI-uitlezingen bruikbare knooppunten en werkingsmechanismen benoemen; en (vi) grafiek-/AI-modellering die ziektespecifieke netwerkkenmerken leert van dfPPI-kaarten voor prognose en therapeutisch ontwerp. Methodologisch gezien zullen miniaturisatie, automatisering (bijv. 96-well-formaten) en gestandaardiseerde QC pijplijnen met hoge doorvoer mogelijk maken voor translationele studies en klinische onderzoeken. Ten slotte kunnen dfPPI-outputs gerichte follow-ups - AP-MS, XL-MS of nabijheidslabeling - zaaien om de topologie van geprioriteerde modules op te lossen, wat de complementariteit van de methode binnen de interactomics-toolkit onderstreept.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250	Giftig, Ontvlambaar
Acetonitrile (ACN) Optima	Fisher Scientific	A955-1	LC/MS grade (Ontvlambaar)
Affi-Gel 10 activated affinity chromatography media	Bio-Rad	1536099	Wordt gebruikt om PU-beads en controlebeads te maken (Ontvlambaar)
Ammonium Bicarbonate (ABC)	Sigma-Aldrich	09830-500G
Aurora Ultimate 25x75 C18 UHPLC column	IonOpticks	AUR3-25075C18-CSI
Autoradiographic film	EWEN-PARKER X-RAY CORP	EBA45	Alternatief voor chemiluminescente signaaldetectie na Western blot
Biomasher micro tissue homogenizer	DWK Life Sciences Kimble	7496250010	Wordt gebruikt voor het homogeniseren van bevroren hersenweefsel voor eiwitextractie
Bromophenol blue	Fisher Bioreagent	BP115-25
Centrifuge for 1.5 mL tubes	Eppendorf	5424
Centrifuge for 1.5 mL tubes	Eppendorf	5417R	Met temperatuurregeling
Centrifuge for 15-50 mL tubes	Eppendorf	5810R	Wordt gebruikt voor conische buisjes
ChemiDoc MP imaging system	Bio-Rad	17001402	Wordt gebruikt voor gel/blot densitometrie
Column oven	Sonation GmBH, Germany	ES071/ES072	Houdt de nanoLC kolom op 50 °C voor consistente retentie
Conical tubes (15 mL)	Fisher Scientific	352096
Control-beads	Chiosis Lab	N/A	Taldone et al. (PMID: 21459002)
Coomassie G-250 stain (Bio-safe)	Bio-Rad	1610786
Dark Eppendorf tubes (1.5 mL)	USA Scientific	1415-2507
Dithiothreitol (DTT)	Roche	10197777001	Prikkend
Easy nLC 1000	Thermo Fisher Scientific	Easy nLC 1000	LC systeem gebruikt met Q Exactive HF
Empore Solid Phase Extraction Disks	3M Company	2215-C18 (Octadecyl)	Wordt gebruikt om StageTips voor peptide desalting voor te bereiden; Geactiveerd met 100% Methanol
Enhanced chemiluminescence (ECL) kit	Thermo Fisher Scientific	32209
Eppendorf tubes (1.5 mL)	Fisher Scientific	05-408-129
Formic Acid (FA) Optima	Fisher Scientific	A117-10X1AMP	LC/MS-grade
g:Profiler (e111_eg58_p18_f463989d)	BIIT Group-Tartu Ülikool	https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost	Pathway verrijking
Glycerol	Fisher Bioreagent	BP229-1	Moleculaire biologie kwaliteit
Glycine	Fisher Bioreagent	BP381-5	Kristalline poeder
Goat anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody (RRID: AB_2619742)	Sothern Biotech	1030-05	Secundair voor de H90-10 antistof
Goat anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibody (RRID: AB_2632593)	Sothern Biotech	4010-05	Secundair voor de HSP90α en HOP antistoffen
Goat anti-rat HRP-conjugated secondary antibody (RRID: AB_2716837)	Sothern Biotech	3030-05	Secundair voor de HSC70 antistof
Heated orbital shaker	Eppendorf	ThermoMixer C (2231001127)
HeLa protein digest standard-Pierce	Thermo Fisher Scientific	88329	Wordt gebruikt voor LC-MS QC beoordeling
HOP antibody (RRID: AB_10828378)	Cell Signaling	5670	Voor PU-beads QC
HSC70 antibody (RRID: AB_10617277)	Enzo	SPA-815	Voor PU-beads QC
HSP90 (H90-10) antibody (RRID: AB_854214)	StressMarq	SMC-107	Voor PU-beads QC
HSP90 alpha antibody (RRID: AB_303423)	Abcam	Ab2928	Voor normalisatie zoals in sectie 1.2
Human cell line: ASPC1 (RRID:CVCL_0152)	ATCC	CRL-1682	Controle cel lijn, epichaperome laag/chaperone hoog
Human cell line: MDA-MB-468 (RRID: CVCL_0419)	ATCC	HTB-132	Controle cel lijn, epichaperome hoog/chaperone hoog
ImageJ (v1.54p)	Wayne Rasband	https://imagej.net/ij/	Densitometrie
Iodoacetamide (IAA)	Sigma-Aldrich	I1149-5G	Giftig
Low-protein binding microcentrifuge tubes	Sarstedt	72.706.600
Lys-C protease	Promega	VA1170	LC/MS-grade
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	63068	Moleculaire biologie kwaliteit
MaxQuant (v2.1.1.0)	Max-Planck-Institute of Biochemistry	https://www.maxquant.org/	MaxDIA workflow voor peptide/eiwit identificatie en label-free intensiteit-gebaseerde kwantificering
Methanol	Fisher Chemical	A454-4	HPLC grade, ontvlambaar, giftig
Mini Protease Inhibitor Cocktail tablet (Complete)	Roche	4693124001
Mini Trans Blot Electrophoretic Transfer Cell	Bio-Rad	1703930
Mini-gel electrophoresis tank	Thermo Fisher Scientific	A25977	Wordt gebruikt voor Novex precast gels
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell	Bio-Rad	1658004	Wordt gebruikt voor Mini-PROTEAN Precast Protein Gels of hand gegoten gels
Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels (4&