Het Stroke Preclinical Assessment Network Multi-laboratoriummodel van trombo-embolische beroerte met trombolyse: TE-MCAo

Samenvatting

Om een trombo-embolische beroerte te simuleren, werden emboliën bereid uit heteroloog rattenbloed geïnjecteerd in de middenarteria cerebrale arterie, gevolgd door het toedienen van systemische trombolyse voor recanalisatie. Deze versie van het model is geoptimaliseerd voor gebruik in een multilaboratoriumnetwerk en ondersteunt het testen van meerdere kandidaat-therapieën.

Samenvatting

Huidige translationele knaagdierberoertemodellen induceren een occlusie van de middencerebrale arterie (MCAo) met behulp van nylonfilamenten, geïnjecteerde emboliën, intraluminale trombine of perivasculaire endotheline-1 om een menselijke beroerte te simuleren. Onder deze methoden bootst tromboemboli-injectie gevolgd door trombolyse het beste de neuro-inflammatoire gebeurtenissen na die bij menselijke patiënten worden waargenomen en kan het de voorkeur hebben boven de meest gebruikte inerte nylonfilamentmethode. De standaard trombo-embolische modellen, gebruikt in toonaangevende enkelvoudige laboratoria, kunnen echter tijdrovend zijn, variabele resultaten opleveren en aanzienlijke vaardigheid vereisen om te beheersen. Om deze beperkingen aan te pakken, hebben we een trombo-embolisch MCAo-model ontwikkeld dat zich richt op vatafsluiting en intraveneuze trombolyse gebruikt om recanalisatie te bereiken, parallel aan de systemische trombolyse die in klinische situaties wordt toegediend. Om het aantal dieren te verminderen, ontwikkelden we een methode om bloed van donordieren op te slaan voor latere emboli-bereiding voor meerdere proefpersonen. Ons gebruik van prefabriceerde Doccol-microkatheters vereenvoudigt de voorbereiding en injectie van trombussen door tromboemboli vooraf te laden in de microkatheters, die vervolgens in de interne halsslagader worden ingebracht. Om recanalisatie te bereiken, gaven we intraveneuze Tenecteplase een dosis van 1,5 mg/kg. Om reproduceerbaarheid te bevorderen, hebben we standaard werkprocedures, trainingsvideo's en praktische chirurgische trainingsworkshops voorbereid en getest. Het model gebruikt een standaard chirurgische aanpak die bekend zou moeten zijn bij alle onderzoekers die het algemeen geaccepteerde nylonfilamentmodel gebruiken. Het passeren van de microkatheter in de distale interne halsslagader, waarbij de pterygopalatina wordt vermeden, gebeurt op een manier die lijkt op het inbrengen van nylonfilament. Herstel- en post-beroertebeoordelingen kunnen worden uitgevoerd met typische gedrags-, röntgen- en histologische protocollen. Dit model biedt een praktische, reproduceerbare en toegankelijke aanpak voor onderzoekers die een trombo-embolisch MCAo-model met gecontroleerde recanalisatie zoeken.

Inleiding

Beroerte is wereldwijd een van de belangrijkste oorzaken van overlijden en invaliditeit¹. Veel patiënten profiteren van intraveneuze trombolyse, en geselecteerde patiënten profiteren van mechanische trombectomie. Omdat niet alle patiënten op tijd in het ziekenhuis aankomen voor trombolyse of trombectomie, en niet alle patiënten baat hebben bij volledig herstel, blijft er een aanzienlijke behoefte aan verdere ontwikkeling van aanvullende of aanvullende cerebroprotectieve therapieën. Het meest gebruikte model van knaagdieren ischemische beroerte is de monofilament-occlusie van de middelste cerebrale arteria (MCA), gevolgd door volledige reperfusie. Dit model simuleert large vessel occlusion (LVO), waarbij patiënten met grote beroertes worden gemodelleerd die een succesvolle volledige mechanische trombectomie ondergaan. Dit model omvat echter een klein percentage klinische beroertes. Daarentegen krijgen meer patiënten trombo-embolische beroertes secundair aan atherosclerose (in situ atherosclerotische plaque ruptuur of athero-emboli door systemische ziekte), en worden ze behandeld met alleen systemische trombolyse, wat het nylonmodel niet kan repliceren ^2,3. Daarnaast mist het nylonfilament MCAo-model de ontstekingscaskade die geassocieerd wordt met trombotische occlusie ^4,5. Diermodellen die gebruikmaken van tromboemboli gevolgd door systemische trombolytische toediening zouden de pathofysiologie en basisbiologie vertegenwoordigen die bij veel beroertepatiënten^{voorkomt 4,6}. Tot nu toe staan knaagdieren trombo-embolische stroke-modellen echter bekend als complex en moeilijk te reproduceren. In geïsoleerde laboratoria met toegewijde experts kan een trombo-embolisch model worden bereikt met redelijke reproduceerbaarheid. Zo'n model leent zich niet gemakkelijk voor breed gebruik, zoals nodig is bij multi-laboratoriumprojecten.

Hierin bieden we gedetailleerde protocollen voor een bijgewerkte en gestandaardiseerde trombo-embolische occlusie van de midden-cerebrale arterie (TE-MCAo) gevolgd door een systemisch trombolysemodel. Specifiek vereenvoudigden we de trombuspreparat, standaardiseerden we de trombusbelasting in katheters en valideerden we de schaalbaarheid van dit model voor multi-laboratoriumproeven. We hebben dit model ontwikkeld voor gebruik in het Stroke Preclinical Assessment Network (SPAN). We wilden echter dat het model nuttig zou zijn voor elk netwerk dat grote preklinische netwerkproeven van nieuwe, kandidaatbehandelingen wil uitvoeren. Met behulp van ons gestandaardiseerde model konden we TE-MCAo induceren bij 6 ratten per dag per studielocatie gedurende de studieperiode.

SPAN en vergelijkbare netwerken zijn gegroeid als reactie op herhaalde en voortdurende mislukkingen om veelbelovende cerebroprotectiva van preklinische setting naar succes in de klinische praktijk te vertalen⁷. In 2019 startte het National Institutes of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) SPAN⁸. SPAN streeft ernaar potentiële therapieën effectiever te screenen door bias te minimaliseren via gecentraliseerde maskering, randomisatie en geautomatiseerde gecentraliseerde uitkomstanalyse. SPAN 1 gebruikte het nylonfilamentmodel in zijn eerste twee versies omdat alle deelnemende laboratoria het al gebruikten, en het was eenvoudig om⁹ in te zetten. Om veel aspecten van trombo-embolie en trombolyse getrouwer te modelleren, probeerde SPAN het hier beschreven TE-MCAo-model te creëren. Dit model zou nuttig zijn voor preklinische chirurgen die overstappen van het nylonfilamentmodel naar het TE-MCAo-model. Wij adviseren dat preklinische laboratoria de aanwezigheid van een beroerte 24/48 uur na MCAo (of TE-MCAo) bevestigen met behulp van een beeldvormingstechniek, bijvoorbeeld magnetische resonantiebeeldvorming (MRI).

Het SPAN-netwerk is volledig beschreven in eerdere studies⁹, en alle SPAN Standard Operating Procedures (SOP's) zijn beschikbaar op de SPAN-website. Kort gezegd wordt het netwerk beheerd door een coördinerend centrum (CC) dat geneesmiddeldistributie, kwaliteitscontrole van gegevens, verificatie van protocolnaleving en netwerkcommunicatie verzorgt. Alle SOP's worden opgesteld door het CC en goedgekeurd door een stuurgroep na beoordeling. Bij SPAN krijgen alle knaagdieren bij aankomst in de onderzoekslaboratoria een MRI-compatibel barcode-oorlabel, en alle proefpersonen worden geregistreerd in de SPAN Research Electronic Data Capture (REDCap) Database. Dieren worden door de CC gerandomiseerd met behulp van randomisatietabellen die gestratificeerd zijn op locatie en geslacht. In SPAN 1 en SPAN 2 werden veronderstelde therapieën onderzocht op effectiviteit in zes deelnemende onderzoekslaboratoria. Alle testmedicijnen werden verpakt in identiek uitziende flesjes, gelabeld bij het coördinatiecentrum en aan het begin van het project naar onderzoekslaboratoria verzonden.

Protocol

Alle deelnemende SPAN-laboratoria, inclusief het coördinatiecentrum van USC, volgden de richtlijnen van NIH en AAALAC voor de humane en ethische behandeling van dieren. Goedkeuring van de lokale IACUC werd op alle locaties verkregen.

1. Trombusvoorbereiding

OPMERKING: Al het bloed en alle tromben moeten worden behandeld volgens alle lokale institutionele richtlijnen voor biohazards. Alle materialen die in contact komen met bloed moeten ofwel als biologisch gevaarlijk afval worden verwijderd of, in het geval van chirurgische instrumenten, grondig worden gereinigd en gedesinfecteerd door een autoclaaf. Om het gebruik van bloeddonordieren in deze studie te verminderen, hebben we een methode ontwikkeld om donorbloed op te slaan en vervolgens bloed te gebruiken om tromboemboli te maken indien nodig.

1. Neem vers donorbloed uit een slagader in een 1,5 mL microcentrifugebuis of pediatrische ethyleendiamine tetra-azijnzuur (EDTA) microbuisjes, waarbij je alleen vult tot het 500 μL-niveau.
   OPMERKING: Wij geven de voorkeur aan een femurarteriale canule voor onze bloedafnames, omdat de femurarteria een grote luminale diameter heeft die katheterisatie mogelijk maakt, deze bilateraal is en twee afzonderlijke bloedafnames mogelijk maakt, en een overlevingsoperatie is voor de knaagdieren. Bloed kan 4 weken lang bij 4 °C worden opgeslagen, naar onze ervaring.
2. Voeg 1 mL CaCl_2-oplossing (5 mg/mL) toe aan 500 μL van het opgeslagen, antistollingsbloed.
3. Direct na de omkering van de antistolling met CaCl₂ aspireer je bloed uit de microcentrifugebuis in een 100 cm lange PE-50 buis met zachte zuiging.
   OPMERKING: Vertraging zal leiden tot bloedstolling voordat het in de PE-50 buis kan worden gezogen.
4. Incubeer de opgerolde buis in voorverwarmde fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bij 37 °C gedurende 2 uur in een tafeloven.
   OPMERKING: Het plaatsen van de petrischaal op een open kookplaat resulteert in een inconsistent resultaat door een inconsistente warmteverdeling.
5. Aan het einde van de 2 uur durende incubatie wordt de met bloed gevulde PE-50-buis onmiddellijk overgebracht naar 4 °C voor opslag. Het blijft bruikbaar voor de volgende stappen tussen 20 en 72 uur.

2. Katheterbelasting

1. Verbind de opgerolde PE-50 buis (interne diameter: 0,58 mm) op een 3 of 5 cc spuit gevuld met zoutoplossing en stoot de trombus voorzichtig uit in een petrischaaltje met PBS.
   OPMERKING: Dit kan aanzienlijke kracht vereisen. Houd de tegendruk op de aansluitplaats om te voorkomen dat de katheter en spuit losraken bij extruderen. De PE-50 katheter kan indien nodig in kleinere segmenten (10-50 cm) worden gesneden om extrusie te vergemakkelijken.
2. Snijd delen van de trombus van ongeveer 6 cm lang af met een scheermesje.
3. Was elk trombussegment door het voorzichtig in een PE-50 katheter te trekken en het vijf keer volledig uit te laten.
4. Vervolgens was je de trombus door deze voorzichtig in een PE-10 katheter te trekken (interne diameter: 0,279 mm) en deze 15 keer volledig uit te stoten.
   OPMERKING: Als er tijdens deze stap vaak breuk optreedt, overweeg dan vergroting met een operatiemicroscoop of een chirurgische loep om te verzekeren dat de trombus in lijn met de katheteropening wordt ingeademd.
5. OPTIONEEL: Gebruik van Evan's Blue om trombi te visualiseren
   1. Maak 4% Evan's Blue in 1x PBS-oplossing.
   2. Voeg 200 μL van de 4% Evan's blue toe aan een petrischaaltje gevuld met 10 mL 1x PBS. Dit zal de meer geconcentreerde oplossing zijn = Evan's Blue Dilution # 1.
   3. Neem 400 μL van Evan's Blue Dilution #1 en meng het in een aparte petrischaal gevuld met 20 mL 1x PBS. Dit is een verdunde oplossing van Evan's Blue = Evan's Blue Dilution # 2.
   4. Doe het stolsel in de meer geconcentreerde Evan's Blue petrischaaloplossing (verdunning #1) gedurende 1 seconde en doe het daarna over in de verdunde Evan's Blue petrischaal (verdunning #2).
6. Laad één gewassen trombus in geprefabriceerde microkatheters (binnendiameter: 0,2 mm, buitendiameter: 0,360 mm, lengte: 300 mm, verbonden met vrouwelijke Luer-slot) zonder luchtemboli met de nat-naar-natte methode.
   OPMERKING: We raden aan om vergroting te gebruiken (bijvoorbeeld 2,5x loepen) voor deze stap.
7. Zodra de trombus volledig belast is, extrudeer je genoeg trombus zodat er precies 5,0 cm in de microkatheter overblijft. Knip het overtollige met een scheermesje.
   OPMERKING: De lengte van de belaste trombus kan worden aangepast aan verschillende toepassingen, afhankelijk van de gewenste slaggrootte.
8. Markeer de microkatheter 16 mm vanaf de punt om de omvang van de katheter aan te geven die intraluminaal voorbij de bifurcatie van de arteria halsslagader moet worden verplaatst.

3. Dierchirurgie en anesthesie

1. Induceer anesthesie met 4% isofluraan in een 30:70 zuurstof:lachgas mengsel en handhaaf de anesthesie met 1-2% isoflurane in hetzelfde gasmengsel.
2. Geef pijnstillers carprofen 5 mg/kg subcutaan en atropine 0,05 mg/kg intraperitoneal om het diercomfort tijdens de operatie te behouden.
   OPMERKING: Veel chirurgen infuseren de incisieplaats met 1,0 mL bupivacaïne (2,5 mg/mL).
3. Houd de lichaamstemperatuur gedurende de operatie op 37 ± 0,5 °C met een warmtekussen die wordt geregeld met een rectale temperatuursonde.

4. Afname van donorbloed

1. Verzamel bloed van de donor via femorale arteriële katheterisatie. Stem het biologische geslacht van de donor en de ontvangers af.
2. Als bloed op dezelfde dag wordt gebruikt:
   1. Maak drie centrifugebuizen van 1,5 mL klaar. Markeer elke buis op het 500 μL-punt met een onuitwisbare laboratoriumpen.
   2. Bereid drie sets PE-50 buizen voor, elk 100 cm lang, bevestigd aan een 1,0 mL spuit via een 23-gauge stompe naald.
3. Als bloed wordt opgeslagen voor later gebruik, bereid dan zes pediatrische EDTA-microbuisjes voor. Maak de doppen los voor makkelijker gebruik later.
4. Bereid een 10,0 cm lange PE-50 buis voor, aan één uiteinde vastgeklemd met een rubberen klemme en aan het andere uiteinde met een stomp afgeschuin.
   1. Om een rubberen beklede klem te maken, steek je één tand van een standaard hemostatische klem in de PE-100 buis en trim je het passend. Herhaal aan de andere kant.
   2. Om de PE-50 bot afgeschuind te maken, zag je eerst het uiteinde onder een afgeschuinde hoek door. Knip vervolgens de punt van de afschuiningspunt af met een microschaar.
      OPMERKING: Het is belangrijk dat de punt wordt verwijderd om te voorkomen dat de achterwand van de slagader wordt doorboord na het plaatsen, maar als te veel van de tip wordt verwijderd, wordt het verlies van het afschuivende effect het zeer moeilijk om de katheter intraluminaal in te brengen.
5. Voer een standaard snede uit op de arteria femoralis.
6. Bereid het dier voor (scheer het binnenste dijgebied), plaats het in dorsale liggeving op de operatietafel. Steriliseer de huid met 3 wasbeurten van 70% ethanol, gevolgd door 1 wasbeurt met betadine of een andere antiseptische oplossing.
7. Maak de achterpoten gespreid vast met zachte boeien.
8. Maak een verticale incisie op de binnenkant van het dijbeen van ongeveer 1,5-2 cm lang langs de natuurlijke plooi van de lieskruising met het been. Deze incisie zal orthogonaal zijn op het verwachte anatomische verloop van de femorale slagader.
9. Met een stomp dissectie ontleed je voorzichtig tot aan de femorale vaten. Scheid voorzichtig de arteria femoralis van de ader en zenuw die in hetzelfde bundel lopen.
10. Sluit distaal de femorale arterie af met een 5-0 zijden ligatuur en gebruik de staarten van de hechting om distaal lichte spanning te geven met hemostaten.
11. Skeletiseer de femorale arterie zo ver mogelijk proximaal, waarbij de arterie wordt gevolgd naar de retroperitoneale oorsprong. Plaats losjes een lus van 5-0 zijde rond de femorale arterie en gebruik de staarten opnieuw om zachte spanning te leggen aan het proximale uiteinde van de slagader. Trek de zijden knoop op dit punt niet strakker aan. Deze spanning zorgt voor hemostase nadat de arteriotomie is uitgevoerd.
    OPMERKING: De lus kan verder proximaal worden verplaatst met een aneurysmaklem.
12. Ongeveer tweederde van de afstand vanaf de proximale hechtinglus plaats je een stuk zijden hechting onder de slagader en maak je een kleine arteriotomie distaal van de losse hechting met een microschaar. De losse hechting wordt vastgebonden om de intraluminale katheter na cannulatie vast te zetten.
13. Met scherpe pincetten tilt u de bovenste opening van de arteriotomie op en brengt u de stompe afgeschuinde katheter in de opening. Schuif de katheter zo ver mogelijk proximaal naar voren.
    OPMERKING: Er kan wrijving zijn tussen de katheter en de binnenkant van de vatwand. Twee dingen kunnen hierbij helpen: 1) het bedekken van de buitenkant van het uiteinde van de katheter met sereuze vloeistof van de binnenkant van het been vlak voordat het in het vat wordt gebracht, en 2) met stompe, gegroefde pincetten de buitenkant van het vat vasthouden terwijl de katheter tegelijkertijd wordt verplaatst. Dit voorkomt dat het vat gewoon samen met de katheter voortbeweegt.
14. Zodra de punt van de katheter bijna tot aan het punt van de proximale lus is verplaatst, laat je de spanning los uit de uiteinden van die hechting. Bloeding moet worden voorkomen door de strakke pasvorm van de katheter in het vat.
15. Schuif de katheter genoeg naar voren zodat de losse lus, wanneer aangedraaid, de katheter omvat. Draai de hechting voorzichtig aan, zodat de hechting niet zo strak wordt gespannen dat de katheter verstopt raakt. Zorg er ook voor dat de hechting niet op de afschuining van de katheter zit, gezien de taps toelopende aard van dit kathetersegment.
16. Maak de rubberen beklede klem los. De katheter moet onmiddellijk gevuld worden met bloed.
17. Vul de open centrifugebuizen of de pediatrische EDTA-microbuizen en plaats niet meer dan 500 μL in beide verzamelapparaten.
18. Zodra de microbuisjes gevuld zijn, verwijder je de PE-50 katheter uit de femorale arterie, ligaer je het proximale uiteinde en sluit je de incisie met een onderbroken 5-0 prolenenhechting.
19. Als er later bloed wordt gebruikt, plaats dan de doppen op de gevulde pediatrische EDTA-buizen en bewaar ze bij 4 °C.
20. Als trombus voorbereid moet worden voor gebruik op dezelfde dag, ga dan door naar stap 1.2 hierboven.
21. Herhaal onmiddellijk met de overgebleven centrifugebuizen.
22. Arteriële bloeddonoren kunnen na herstel van de narcose weer in het vivarium worden teruggebracht als er een eenzijdige katheterisatie is uitgevoerd. De contralaterale femurarteria kan later worden katheteriseerd, maar na bilaterale femorale arteriekatheterisatie moeten donoren worden geëuthanaseerd volgens de IACUC-regelgeving.

5. TE-MCAo

OPMERKING: De TE-MCAo-methode gebruikt de standaard cut down naar de arteria common carotis. De keuze van verdoving en de verminderde aanpak is aan de gebruiker. Het protocol begint hier op het punt waarop de chirurg de arteria common carotis (CCA), de arteria internal carotis (ICA) en de arteria external carotis (ECA) al heeft geïsoleerd.

1. Maak de CCA bloot en trek in met een 3-0 zijden ligatuur. Doe hetzelfde voor de ECA en de ICA.
2. Met een ligatuur of cauterisatie wordt de arteria occipitale cautaire blootgesteld en afgedicht.
3. Blootstelling en terugtrekken of afsluiten van de arteria pterygopalatine (PPA).
   OPMERKING: Met voldoende ervaring kan deze stap worden weggelaten. We raden aan om deze stap altijd uit te voeren bij het leren van de procedure.
4. Met zachte terugtrekking zet je de ECA en ICA in een "T"-configuratie.
5. Knoop de CCA-ligatuur pas af nadat alle bovenstaande stappen zijn voltooid.
6. Maak een arteriotomie in de ECA (Zea Longa CCA open methodology¹⁰) met behulp van microschaar.
7. Met de stompe afschuiningsmethode zoals beschreven in stap 4.4.2, bereid je de punt van een van de reeds belaste microkatheters voor (binnendiameter: 0,2 mm, buitendiameter: 0,360 mm, lengte: 300 mm, verbonden met vrouwelijke Luer-slot).
8. Plaats voorzichtig de microkatheter met voorgeladen tromba in de ECA. Maak de ICA-rembellus los en schuif de microkatheter intracraniaal naar 16 mm bij de carotisbifurcatie onder directe visualisatie om onbedoelde cannulatie van de extracraniële PPA te voorkomen.
   OPMERKING: Als de katheter liever de CCA binnengaat, kan zachte druk met een puntige watten tip helpen om de voortschrijdende katheter in de ICA te oriënteren.
9. Bevestig de intraluminale microkatheter aan ICA en CCA met 3-0 silk, en zorg dat je niet te strak aandraait.
10. Injecteer 20 μL in de 1 mL spuit met een gemotoriseerde spuitpomp met een snelheid van 10 μL/min gedurende een duur van 2 minuten.
    OPMERKING: Meestal zal de spuitpomp eerst niet verplaatsen totdat er voldoende druk is opgebouwd.
11. Injecteer nog eens 20 μL steriele zoutoplossing met dezelfde pompinstellingen.
    OPMERKING: Tijdens het onderzoek naar de bloedstroom met laser-gespikkelde beeldvorming vonden we 100% succes met een spoeling van 20 μL.
12. Verwijder de microkatheter en verbind de ECA permanent met een hechting proximaal van de arteriotomieplaats. Verwijder alle beperkingslussen. Let goed op eventuele bloedlekkage en sluit indien nodig met extra ligaturen.
13. Sluit de huidincisie tijdelijk met niettjes of een lopende 5-0 prolene-hechting.
14. Haal het dier uit de narcose en plaats het in een warme herstelkooi.
15. Optioneel: Labs kunnen laser-Dopplerflowmetrie gebruiken om succesvolle MCA-occlusie te bevestigen. Alternatief kan magnetische resonantiebeeldvorming worden verkregen na 24 of 48 uur om een cerebrale infarct te bevestigen en te kwantificeren.
    OPMERKING: Veel gebruikers geven er de voorkeur aan om 1,5 mL zoutoplossing of lactatievloeistof van Ringer subcutaan toe te dienen aan het einde van de operatie.

6. Systemische trombolyse

OPMERKING: Tenecteplase (TNK, 1,5 mg/mL) kan worden gekocht voor gebruik als systemische trombolyse. Gebruikers geven mogelijk de voorkeur aan andere lytische middelen. Individuele 50 mg flesjes worden gereconstitueerd met 50 mL gedestilleerd water, waarna 2,5 mL precies wordt gealiquoteerd in 3,0 mL flesjes. De aliquots kunnen worden ingevroren bij -20 °C voor later gebruik. De stabiliteit van een gereconstitueerde recombinante weefselplasminogenactivator opgeslagen bij -20 °C is 60 dagen^{en 11}.

1. Ontdooi één bevroren aliquot van TNK voor elk onderwerp. Ontdooi op kamertemperatuur gedurende ongeveer 15 minuten.
2. Gebruik een spuit van 1 cc en neem precies 1,5 mg/kg op. Bijvoorbeeld, een rat van 300 g heeft 0,45 mg nodig.
3. Doof het dier opnieuw en verwijder de tijdelijke huidsluiting.
4. Ontbloot elke tak van de externe halsslagader.
   OPMERKING: De staartader kan worden gebruikt als het laboratorium zich comfortabeler voelt met deze route. We gaven de voorkeur aan het gebruik van de jugularis vein omdat SPAN-chirurgen zich comfortabeler voelen bij externe jugularis carry, en dit wordt routinematig gedaan in ons filamentmodel.
5. Met een 30 of 32 G naald wordt de TNK direct in de ader geprezen.
   OPMERKING: In eerste instantie willen gebruikers misschien de ader isoleren tussen 3-0 zijden lussen. Met oefening is dit niet nodig.
6. Sluit de incisie met een onderbroken 5-0 prolene of een andere niet-absorberbare hechting.
7. Breng het dier terug in de herstelkooi zoals in stap 5.14.

7. Statistische methoden

1. Voor het maken van beschrijvende statistieken gebruik je gemiddelde en standaarddeviatie voor normaal verdeelde numerieke gegevens, en gebruik je mediaan- en interkwartielbereik voor niet-normaal verdeelde gegevens. Presenteer categorische gegevens als frequentieverdelingen. Voor hypothesetesten past u de t-test of ANOVA toe voor normaal verdeelde parametrische gegevens; Anders voer je geen hypothesetoetsing uit.

Resultaten

Figuur 1: Bloedafname van donordieren en trombuspreparat. Bloed werd van het donordier afgenomen via katheterisatie van de femoris arterie en overgebracht naar een microcentrifugebuis met (kan tot 4 weken worden bewaard) of zonder EDTA (gebruik op dezelfde dag). Om de trombus te bereiden werd calciumchloride-oplossing toegevoegd aan de opgeslagen bloedbuizen en onmiddellijk in een PE-50-katheter geïnspireerd. De opgerolde PE-50-buis werd 2 uur lang geïncubeerd in voorverwarmde fosfaatgebuffte zoutoplossing (PBS) bij 37°C in een tafeloven. Na 2 uur werd de met bloed gevulde PE-50 buis onmiddellijk overgebracht naar 4°C voor opslag. Zie sectie 1 in het protocol voor meer informatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Trombus in de katheter laden voor injectie. (A) Op de dag van de MCAo-operatie werd trombus uit de PE-50-buis geëxtrudeerd in een petrischaal met PBS. (B) Op de petrischaal werd de trombus met een scheermesje tot ongeveer 6 cm lang bijgesneden. (C) De trombus werd gewassen met PBS door deze in een PE-50-buis te trekken en 5 keer uit te stoten en vervolgens 15 keer in een PE-10-buis. (D) Trombus werd overgebracht naar een petrischaaltje met geconcentreerde Evan's Blue-oplossing. (E) Trombus werd overgebracht naar een petrischaaltje met verdunde Evan's Blue-oplossing en geladen in een geprefabriceerde microkatheter. (F) De microkatheter werd via de interne halsslagader van de rat verplaatst tot 16 mm van de punt van de katheter, passeerde via de carotisbifurcatie van de algemene halsslagader en werd geïnjecteerd met een gemotoriseerde spuitpomp. Zie sectie 2 in het protocol voor meer informatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 

In een pilothaalbaarheidsstudie schreven we 135 proefpersonen in bij 6 onderzoekslaboratoria. Hoewel proefpersonen gerandomiseerd werden in een van de 8 behandelingen, rapporteren we hier alleen op basis van geaggregeerde gegevens om de haalbaarheid van het model te illustreren. Van de 135 ingeschreven proefpersonen werd TNK toegediend in de juiste dosis en tijd bij 132 (98%). De MRI werd 3 dagen na TE-MCAo uitgevoerd bij 102 (75%) vanwege dierdood vóór de scan in 33 (24%). Het verlies van dieren vóór dag 3 was consistent in alle 6 laboratoria (Tabel 1), wat aangeeft dat het model op meerdere locaties kan worden ingezet. De gemiddelde grootte ± SD van de laesies was 13 ± 16% (laesiegebied omvat ischemie en oedeem als percentage van de ipsilaterale hemisfeer) met enige variabiliteit tussen laboratoria (Tabel 2). Representatieve MR-beelden en postmortale embolieën zijn te zien in aanvullende figuur 1.

	Laboratorium
Variabele	AG	DK	IW	MG	SD	YL
Steekproefgrootte (N)	23	30	11	28	24	19
MRI Gedaan	19	24	9	23	14	13

Tabel 1: haalbaarheid per laboratorium. De studielaboratoria waren Augusta University (AG), Duke (DK), University of Iowa (IW), Massachusetts General Hospital (MG), University of San Diego (SD) en Yale University (YL). Het aantal ingeschreven dieren (N) en het aantal dat overleefde om een MRI-scan te ondergaan dat dag 3 na de beroerte werd gedaan, worden weergegeven. Deze gegevens ondersteunen de haalbaarheid van het model.

Locatie	Steekproefgrootte (N)	Laesievolume (%) Gemiddelde ± SD	Midline Shift Index (%) Gemiddelde ± SD
AG	19	11 ± 14	11 ± 12
DK	24	18 ± 17	19 ± 13
IW	9	08 ± 13	13 ± 12
MG	23	09 ± 11	15 ± 17
SD	13	14 ± 21	04 ± 19
YL	12	18 ± 22	14 ± 15

Tabel 2: Volume van de laesie die is gezien op dag 3 MRI-scans, per locatie. Om de reproduceerbaarheid van het model op zes studielocaties vast te stellen, werden het laesievolume (ischemie plus oedeem) en de middenlijnverschuiving vergeleken. Het laesievolume wordt uitgedrukt als het oppervlaktepercentage van de ipsilaterale hemisfeer. Middenlijnverschuiving wordt uitgedrukt als het lineaire percentage van de maximale breedte van de intracraniële ruimte. De gegevens bevestigen heterogeniteit tussen de laboratoria.

Aanvullende Figuur 1: Representatieve Afbeeldingen. (A-E) Diverse multi-echo, multi-scan (MEMS) beelden van rattenhersenen genomen 48 uur na TE-MCAo. De secties liggen ongeveer 1 mm voor de bregma. (F-J) Verschillende voorbeelden van emboli die bij de MCA-oorsprong zijn geplaatst. Klik hier om dit figuur te downloaden.

Discussie

We hebben het trombo-embolisch knaagdiermodel van ischemische beroerte verfijnd voor gebruik in een multi-laboratorium preklinisch testnetwerk, SPAN. We verminderden het aantal gebruikte dieren aanzienlijk door een methode te ontwikkelen om donorbloed op te slaan voor later gebruik. We vereenvoudigden ook de bereiding van tromboemboli en de chirurgische aanpak om de uitvoering van meerdere MCAo-procedures op één dag te vergemakkelijken. Onze bedoeling is dat de TE-MCAo hetzelfde niveau van gebruikscomfort en chirurgische volumes bereiken als mogelijk is met de veelgebruikte nylonfilamentversie van de MCAo. Om dit resultaat te bereiken, organiseerden we twee fysieke chirurgentrainingsworkshops, en alle chirurgen die bij deze studie betrokken waren, hadden al enkele maanden, zo niet jaren, ervaring met het meer standaard filamentmodel. We toonden haalbaarheid aan in zes verschillende onderzoekslaboratoria en toonden uitstekende protocol-naleving aan.

Bij het kiezen van het implementeren van dit protocol moet een onderzoeker rekening houden met de volgende punten die het succes van het protocol bepalen. Ten eerste zal nauwgezette zorg bij het verzamelen van bloed invloed hebben op de succesvolle vorming van trombus. Er moet arterieel, niet veneus, bloed worden verzameld om voortijdige stolling te voorkomen. Ten tweede is het belangrijk om meer bloed te verzamelen dan nodig lijkt. Soms lukt één exemplaar er 's nachts niet in te tromboseren, terwijl de andere dat wel doen. Ten derde raden we sterk aan om het laden van de katheter te doen met optische vergroting, hetzij chirurgische loepen met een hoofdlamp of een vergrootglas met verlichting. Ten vierde is een voorzichtige en zorgvuldige dissectie van de CCA, ICA en ECA essentieel om scheurvorming en intravasculaire trombose te voorkomen. Het is ook essentieel om de PPA te visualiseren om ervoor te zorgen dat de bevallingskatheter correct in de ICA terechtkomt. Ten vijfde is het zeldzaam om nadelige effecten bij knaagdieren te zien door injectie van trombolytica. In onze studies zagen we geen bijwerkingen, zoals angio-oedeem of perifere bloedingen, na de TNK-injectie. Dit wil niet zeggen dat het onmogelijk is, maar we zijn niet op de hoogte van meldingen van systemische bijwerkingen van trombolitica bij knaagdieren. Een onderzoeker die ervoor kiest dit protocol voor het eerst toe te passen, kan goed worden aangeraden om een van de hier genoemde onderzoekers als coauteur te raadplegen, aangezien wij persoonlijke instructies erg nuttig vonden.

Bij het selecteren van een dierziektemodel voor het testen van kandidaattherapieën is het belangrijk om de patiëntenpopulatie die het medicijn beoogt nauwkeurig weer te geven. Focale ischemische beroertemodellen omvatten Rose Bengal fototrombotische modellen, corticale piale arterie occlusie en stereotactische endotheline-1 injectie 13,14,15. Deze modellen hebben het voordeel dat ze zeer reproduceerbare laesies creëren in voorspelbare delen van de cortex. Dit voordeel maakt ze te verkiezen in studies naar cellulaire mechanismen, of bij het correleren van de locatie van de laesie met gedragsuitkomsten. De extra kosten, complexiteit en het ontbreken van reperfusiecomponenten maken ze minder bruikbaar voor drugsscreening.

De MCAo met intraluminaal monofilament of trombo-embolie zijn de gevestigde modellen van keuze voor grote vaten occlusie (LVO^). Het siliciumgecoate monofilamentmodel is eenvoudig uit te voeren en veel gebruikt. Hoewel de locatie en grootte van de laesie minder voorspelbaar zijn, wordt deze heterogeniteit bij grootschalige drugstests als een voordeel gezien omdat menselijke beroertes ook vrij heterogeen^zijn. Een nadeel van de monofilamentmethode is dat de occlusie biologisch inert is. Bij patiënten veroorzaken trombi en trombolyse een ontstekingsreactie die samenhangt met de afgifte van trombine, plasminogeen en andere trombuselementen 20,21,22^. Om deze beperking te overwinnen, hebben velen modellen van trombo-embolie voorgesteld in studies van konijnen, varkens, honden en niet-menselijke primaten: 23,24,25,26,27. Deze studies zijn complex en vereisen over het algemeen gespecialiseerde expertise. Desalniettemin probeerden we het trombo-embolische model aan te passen voor gebruik in ons multi-laboratorium, preklinische testnetwerk. Dit vereiste dat we de voorbereiding van de tromboemboli vereenvoudigden, de chirurgische aanpak stroomlijnden en het aantal benodigde dieren aanzienlijk moesten verminderen. We ontwikkelden een trombo-embolisch model, de TE-MCAo, dat succesvol kon worden ingezet in zes verschillende laboratoria met uitstekende protocolnaleving (Tabel 1) en redelijk consistente laeesgrootte (Tabel 2). De doorvoer was voldoende, gemiddeld 6 vakken per week.

Er zijn verschillende stappen voor probleemoplossing die nuttig kunnen zijn. Uitblijven van bloed naar trombose is de meest voorkomende oorzaak van protocolfalen en is meestal te wijten aan besmetting van de voorbereidingskatheter met EDTA of heparine als deze op de operatietafel wordt geplaatst. Wij raden een nauwgezette verzameltechniek aan. We raden ook aan om elke week of om de week of om de week de calciumchloride-oplossing te bereiden die wordt gebruikt om de EDTA te inactiveren. Na het elueren van de trombus uit de voorbereidingskatheter kan het lastig zijn om de trombus in de benodigde fragmenten van 5 cm te snijden. Sommige trombi zijn fragiel en breken gemakkelijk. We raden aan om de stolsels te bereiden met optische vergroting en in extreme gevallen over te stappen op een andere donortrombus. Het aspireren en elueren van trombi vereist een matig vaardigheidsniveau; Daarom raden we een vrij lange trainingsperiode aan. Zorg ervoor dat de punt van de aspiratiekatheter vrij is van verstoppingen met behulp van optische vergroting. Trombi kunnen in de implantatiekatheter worden geklemd - we raden een zachte 'heen-en-weer' afwisseling aan tussen aspiratie en eluatie. Voor chirurgen die ervaring hebben met het typische MCAo-filamentmodel, kan identificatie van de PPA een nieuwe stap zijn. We raden sterk aan om de trombi te labelen met Evan's blauw, zodat de katheter gevolgd en gevolgd kan worden terwijl hij door de ICA opstijgt. De splitsing van de ICA/PPA kan gemakkelijk worden gelokaliseerd door zorgvuldige, diepe dissectie na de ICA, en bevindt zich betrouwbaar diep in een dunne tak van de interne halsslagaderzenuw.

Dit protocol heeft enkele beperkingen. Er is een element van chirurgische vaardigheid nodig om een canulatie van de halsslagaders van knaagdieren uit te voeren. Dit geldt echter evenzeer voor het filamentmodel. Het omgaan met de bloedtrombi vereist ook chirurgische vaardigheid. Zoals bij alle trombo-embolische modellen is het slagende infarct lager dan bij het filamentmodel. Als het doel van het onderzoek vaker infarcten is, is het filamentmodel te verkiezen. Aan de andere kant, als het doel een replicatie is van trombus en trombolyse, dan is dit model wenselijk.

Dit model is bedoeld om kandidaat-cerebrale beschermers te testen met een model dat trouw trombus en trombolyse toepast. Toekomstige richtingen zouden ook studies kunnen omvatten van adjuvante therapie gericht op het no reflow-fenomeen. Velen hebben antistollingsmiddelen en anti-trobbeltjes middelen voorgesteld voor dit doel.

Samenvattend is het hier gepresenteerde TE-MCAo-protocol aangepast om gebruik in meerdere laboratoria mogelijk te maken. We vereenvoudigden de bereiding van tromben en stroomlijnden de chirurgische aanpak. We hebben een methode ontwikkeld om donorbloed op te slaan, waardoor het aantal benodigde dieren aanzienlijk werd verminderd.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1 ml spuit	BD	309628
10x loep
1cc spuit	Terumo	SS-01T
23g stompe naald	Grainger	5FVK7
3.0 cc spuit	BD	309656
3-0 zijden ligatuur
30g naald	BD	305128
5-0 proleen hechtdraad	Ethicon	8698	Om de snee in de huid te sluiten
5-0 zijden ligatuur	Ethicon	A182
Aneurismaklem
Atropinesulfaat	Vet One	NDC86136-006-10	Bronchiale secreties verminderen
Stomp groeftang
Bupivacaïne	Xelia Pharmaceuticals	NDC70594-118-01	Lokaal verdovingsmiddel
Calciumchloride	Sigma	C7902
Carprofen	Zoetis Inc	NADA #141-199	Pijnstiller
Centrifugebuizen	Eppendorf	22364111	Voor bloedafname
Ethanol	Koptec	UN1170
Evan’s Blauw	Sigma	E2129
Verwarmingskussen	Harvard Apparatus	K021-435
Hemostatische klem
Isofluraan	Vet One	NDC13985-528-60
Made By Me Ultimate Weeflussen	Horizon Groups	Niet van toepassing	Zachte beperkingen
Microschaar	F.S.T.	15000-00
Microkatheters	Doccol Corporation	PE-FL-360-200-300	Voorgefabriceerde injectiekatheters
PE-10 katheter	BD	427401
PE-100 slang	Intramedic	7426
PE-50 slang	BD	427410
Pediatrische EDTA buisjes	BD Microtainer	K2E-363706	Donorbloed opslaan
Petrischaal	Eppendorf	30702115
Fosfaat gebufferde zoutoplossing	Fisher	B2438
Prevantics	PDI Inc.	NDC10189-1080-1	Antiseptisch
Q-tip	VWR	89031-288
Vakmes	AccuTec Pro	71960
Zoutoplossing	Hospira, Inc.	NDC 0409-4888-02
Schaar	F.S.T.	14958-11
Scherpe tang
Spuitpomp	New Era Pumps Inc.	BS-300
Tischoven	Boekel	132000
Tenecteplase (TNK)	Genentech, San Francisco	NDC50242-120-47	trombolyse
Oormerk	RapID Lab, San Francisco, CA	RapID Tags