Name: Een praktische benadering van genetische Induceerbare Fate Mapping: een visuele gids voor Mark en Track Cellen In Vivo /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: Leer genetische induceerbare fate mapping om cellen in vivo te markeren en volgen met epifluorescentie-analyse. Deze techniek onthult bijdragen van progenitorcellen aan hersenontwikkeling bij muizenembryo's.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn dankbaar dat S. Arber voor de mGFP muizen en aan leden van de Zervas lab, die kritisch te lezen de krant en op voorwaarde dat technische bijstand. A. Brown werd ondersteund door een Brain Science Kaplan Summer Graduate Research Award. E. Normand werd ondersteund door een Brain Science Program Graduate Research Award. Dit onderzoek werd ook gefinancierd door het opstarten van de middelen voor onderzoek (MZ).

Tamoxifen voorbereiding en mondelinge Gavage Procedure (E8.5) <ul><li> Bereid een 20 mg / ml stockoplossing van tamoxifen door het oplossen van tamoxifen in de voorverwarmde maïsolie. </li><li> Incubeer de oplossing bij 37 ° C gedurende 2 uur op een nutator en vortex met tussenpozen. </li><li> Bescherm de tamoxifen voorraad van licht, bewaren bij 4 ° C, en gebruik voor maximaal een maand. </li><li> Voor het lot in kaart brengen van experimenten, stelt een kweekkoppel dat bestaat uit een Zwitsers Webster vrouw (wild-type; gekocht van Taconic) en een mannetje die zowel een gen-specifieke Creer T allel en een verslaggever allel. Ter demonstratie, maken we gebruik van Wnt1-Creer T; mGFP mannen (Ellisor 2009). </li><li> Controleer Zwitserse Webster vrouwtjes elke ochtend voor de verschijning van een vaginale plug. Aanwijzen van de ochtend (0900) van de dag een vaginale plug wordt gezien als 0,5 dagen na de coïtus en het berekenen van de datum van tamoxifen administratie op basis van dit uitgangspunt. (Voor dit experiment, embryonale dag 8.5 werd gebruikt). </li><li> Gebruik een 1 ml spuit met een diervoeder naald (20G x 1-1/2) voor het opstellen van 200 ul van de tamoxifen stockoplossing (4 mg tamoxifen). </li><li> Stevig beperken van de tijd-zwangere vrouwelijke Zwitserse Webster door grijpen de nek van de nek en de rug naar het hoofd immobiliseren en draai om, zodat de buikzijde naar boven is gericht. </li><li> Houd de staart tussen de vingers vrij om het lichaam te houden in een rechte lijn. </li><li> Plaats de voeding naald in de hoek van de mond en voorzichtig de naald gids langs het dak van de mond. </li><li> Draai de naald zodat het parallel aan het lichaam, terwijl tegelijkertijd het kantelen van de kop naar de nek recht te houden. </li><li> Leid de naald naar beneden de slokdarm, in de richting van de maag. Wees voorzichtig dat u de luchtpijp in te voeren. Als er weerstand op de naald, het dier kokhalsreflex bezig, of als de muis strijd, onmiddellijk verwijderen van de naald en probeer het opnieuw de maagsonde. </li><li> Zodra de naald voeren is in de maag, het beheer van de tamoxifen in de maag en terug te keren naar het vrouwtje haar huis kooi tot de datum van dissectie. </li></ul> Craniotomie: <ul><li> Intracardiaal perfuseren de volwassen lot in kaart gebracht muis met 4% PFA en verwijder het hoofd met een schaar door te snijden door de wervelkolom net boven de schouders. </li><li> Voer een scalpel langs de dorsale middellijn van het hoofd (rostraal naar caudaal) te snijden door de hoofdhuid en de schedel bloot te leggen. </li><li> Met behulp van de scalpel, schraap de overtollige weefsel of spieren uit langs de zijkant en de achterkant van de schedel. </li><li> Met een pincet, doorboren de schedel bij de middellijn alleen rostraal van de olfactorische bollen en maak een klein gaatje aan de uiteinden van de fijne schaar tegemoet te komen. </li><li> Plaats de fijne schaar in dit gat en maakt een incisie mediaal naar lateraal ongeveer de lengte van het olfactorische bollen. Deze cut zal breken de schedel op de kruising van de neusbeen en frontale bot en zorgen voor een goede toegang voor de schaar. </li><li> Snijd langs de sagittale hechtingen in de schedel (dorsale middellijn) en zorg ervoor dat de schaar tips uit de buurt van de hersenen hoek om te voorkomen dat schade aan het onderliggende weefsel te houden. </li><li> Voorzichtig pak de schedel met een tang en verwijder het bot langs de mediale incisie aan de hersenen bloot te leggen. De schedel kan off-chip in kleine stukjes of breken weg in grotere secties. Beweeg met de tang aan alle van de frontale, pariëtale, interparietal, en occipitale botten te verwijderen. </li><li> Crack de botten het inkapselen van de paraflocculi (gelegen langs de zijkanten van de hersenen op het niveau van de kleine hersenen) door knijpen de bolvormige botten aan elke kant. Trek weg de botten. </li><li> Draai het hoofd ondersteboven (dorsale zijde naar beneden) en gebruik de tang om de craniale zenuwen te verbreken en de hersenen los van de schedel. </li></ul> Hele Mount Microscopie: volwassen hersenen <ul><li> Beoordeel volwassen hersenen voor het GFP markeren met behulp van een fluorescerende dissectie scope. </li><li> Overdracht hersenen om een ​​petrischaal met PBS en fotograferen met behulp van PictureFrame of een andere geschikte software. </li></ul> Hele Mount Microscopie: E12.5 embryo's <ul><li> Beoordeel ganse berg embryo's voor GFP markeren met behulp van een fluorescerende dissectie scope. </li><li> Transfer die welke GFP positief door de ganse berg naar een petrischaal met PBS en fotograferen met behulp van PictureFrame of een andere geschikte software. </li><li> Gebruik een tang om snuifje af een klein stukje van de staart van elke embryo, plaats elk stuk in een PCR-buis en genotype het weefsel met behulp van PCR (Ellisor 2009) voor beide allelen tot resultaten te zien zijn via volledige mount analyse te bevestigen. </li></ul> Micro-dissectie en Explantatie voorbereiding van de ventrale mesencephalon van E12.5 embryo's <ul><li> Na dissectie van de baarmoeder keten en identification van het lot-mapped embryo's door middel van volledige montage fluorescentie, transfer embryo's ijskoud steriel PBS in een celcultuur schotel. </li><li> Met behulp van fijne schaar, verwijdert u het hoofd gedeelte van het embryo te snijden dwars, caudaal van rhombomere 1. </li><li> Verwijder vervolgens de rostrale deel van het hoofd met een coronale snijden door het diencephalon. Dit zal blootstellen een tube-achtige structuur, waarin de 4e ventrikel via de mesencephalic blaasje vormen een leiding tussen dorsale en ventrale weefsels. </li><li> Zorgvuldig de schaar tips te voegen in de 4e ventrikel, en knip langs de dorsale middellijn, caudaal van rostraal, volledige openstelling van de buis, het creëren van een "open-boek" voorbereiding. Het ventrale mesencephalon wordt nu mediaal worden blootgesteld, terwijl de twee helften van het dorsale mesencephalon zal lateraal verblijven. </li><li> Verwijder alle resterende niet-neuraal weefsel onder de ventrale mesencephalon, zodat het weefsel om meer botweg te leggen. Indien nodig, maak inkepingen in de rostrale en caudale aspecten zodanig dat de rug "vleugels" van de explantatie zal plat ook. De explant moet nu lijken op een "vlinder, waarbij de dorsale mesencephalon vertegenwoordigt de vleugels, en een rhombomere de staart. </li><li> Om verder te isoleren van de ventrale mesencephalon voor FACS-analyse of celkweek experimenten, verwijder dan de laterale (dorsale aspecten) van het weefsel. </li></ul> Representatieve resultaten: In deze GIFM experiment, Wnt1 expressie cellen zijn permanent en heritably gemerkt tijdens de embryogenese door het toedienen van tamoxifen bij E8.5 aan Wnt1-CreERT; mGFP embryo's. Vervolgens zijn deze gemarkeerde cellen worden gevisualiseerd via volledige mount fluorescentie en sectie immunohistochemie om te bepalen hoe Wnt1-afgeleide cellen bijdragen aan de neurale structuren over ontwikkeling. Hele monteren fluorescentie berust op het membraan-gebonden GFP onderdeel van de mGFP reporter en biedt daarom cellulaire informatie alsook een overkoepelend uitzicht Wnt1-afgeleide neurale projecties. Bijvoorbeeld, met tamoxifen administratie op E8.5, Wnt1-CreERTmGFP embryo's op E12.5 tentoonstelling GFP-fluorescentie in de eerste plaats in de middenhersenen, achterste achterhersenen en het ruggenmerg (Figuur 1A). Bij een hoge vergrotingsfactor, zijn prima neuronale projecties gezien innerveren de middenhersenen, het lichaam muur, ledematen en craniofaciale regio. Op dit ontwikkelingsfase, het embryo is doorschijnend en de interne GFP etikettering is gemakkelijk te onderscheiden. Echter, als het brein zich ontwikkelt, de dichtheid van volwassen weefsel verduistert GFP-fluorescentie afkomstig van interne hersenstructuren. Daarom, met tamoxifen administratie op E8.5, is slechts een kleine GFP labeling waargenomen in de superieure colliculi van de volwassen door de ganse berg fluorescentie (figuur 1C, inzet). Daarnaast zijn een aantal axonale projecties gezien windhonden langs het ventrale oppervlak van de achterhersenen (niet afgebeeld). In tegenstelling, als tamoxifen wordt toegediend E9.5, aanzienlijke GFP etikettering gebeurt de hele inferieure colliculi (Figuur 1B, inzet). Deze toename in hele berg fluorescentie kan erop wijzen dat Wnt1 expressie cellen op E9.5 meer in belangrijke mate bijdragen tot oppervlakkige regio's van de dorsale middenhersenen of uit te breiden meer processen binnen deze regio dan Wnt1 uitdrukken cellen van E8.5. Hoe dan ook, dit verschil in hele berg fluorescentie weerspiegelt de dynamische aard van Wnt1 expressie tijdens de ontwikkeling en laat zien hoe GIFM kan worden gebruikt om verschillende celpopulaties volgen uit het embryo in de volwassen. Met immunohistochemie, het lot in kaart gebracht weefsel secties van Wnt1-CreERT; mGFP dieren worden geanalyseerd op cellulair niveau. Antilichamen tegen GFP en β-galactosidase (β-gal) worden gebruikt in combinatie met een verscheidenheid van weefsel specifieke biomarkers voor de fijne schaal cellulaire bijdrage van de Wnt1 lijn om neurale structuren en soorten cellen te bepalen. Met tamoxifen administratie op E8.5 en weefsel analyse op E12.5, dubbele positieve cellen (GFP + en β-gal +) worden waargenomen in de middenhersenen en de achterhersenen met projecties die zich door het ventrale mesencephalon (Figuur 1B). In het volwassen brein, de Wnt1-lijn gemarkeerd op E8.5 geeft aanleiding tot vele middenhersenen structuren met inbegrip van de superieure en inferieure colliculi evenals in de omgeving van dopaminerge cel populaties van de ventrale tegmentale gebied en de substantia nigra (figuur 1D) (zie Ook Zervas 2004). In tegenstelling, de Wnt1-lijn gemarkeerd op E9.5 leidt tot inferieure colliculi als de neuronen in de nabijheid van dopaminerge celpopulaties (Figuur 1F). <img src="/files/ftp_upload/1687/1687fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1 representatieve resultaten voor Wnt1-lot in kaart brengen.: Voorbeelden van whole-mount en immunocytochemie resulteert in Wnt1-CreERT, mGFP embryo's en volwassen hersenen lot in kaart gebracht (gemarkeerd) op E8.5 (AD)en E9.5 (EF). A. Wnt-1 Creer; mGFP embryo's op E12.5 tentoonstelling GFP-fluorescentie in de eerste plaats in de middenhersenen (Mb), posterior achterhersenen (Hb) en het ruggenmerg (Sp). B. gemarkeerde cellen gevisualiseerd en geanalyseerd op cellulair niveau door immunohistochemie zoals op deze 1-urn dikke optische gedeelte (40x objectief, z-series overname). Nucleair β-galactosidase (nβ-gal) antilichaam labeling (rood) en GFP antilichaam labeling (groen) geeft het lot-mapped cellen die in het ventrale middenhersenen. Hier gerecombineerde cellen zijn voorzien van dubbel positief (nβ-gal + / GFP +) vanwege de aard van de voorwaardelijke mGFP verslaggever. C. Whole-mount bloei microscopie onthult flauw GFP fluorescentie in de superieure colliculi (SC) van de volwassen (inzet). De beoordeling van de Wnt1 lijn gemarkeerd op E8.5 op volwassen gedeelten met een lage vergroting (5X) microscopie laat zien dat de Wnt1 lijn aanleiding geeft tot middenhersenen structuren met inbegrip van de superieure (SC) en inferieure (IC) colliculi (C). D. Een 40x, 1 mm optische gedeelte afkomstig van de ventrale middenhersenen in de buurt van dopaminerge neuronen met nβ-gal + cellen en een rijke GFP + axonale plexus. E. Markering op E9.5 resulteert in een aanzienlijke GFP etiket dat gemakkelijk wordt waargenomen in de colliculus inferior van de middenhersenen door de ganse berg fluorescentie (inzet). De Wnt1 lijn gemarkeerd op E9.5 op volwassen secties (β-gal +, rood) is geconcentreerd in de colliculus inferior (dorsale-posterior middenhersenen) zoals te zien is met een lage vergroting (5x) microscopie (E). F. Een 40x, 1 mm optische gedeelte afkomstig van de ventrale middenhersenen in de buurt van dopaminerge neuronen met nβ-gal + cellen en een rijke GFP + axonale plexus. Wnt1-afgeleide neuronen gemarkeerd op E8.5 E9.5 versus geleidelijk worden uitgesloten van bij te dragen aan dorsale middenhersenen, terwijl de Wnt1 lijn blijft bij te dragen aan ventrale middenhersenen.

<ol><li>Ellisor, D., Koveal, D., Hagan, N., Brown, A., Zervas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+conditional+reporter+alleles+in+the+developing+embryo+and+embryonic+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expr+Patterns%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of conditional reporter alleles in the developing embryo and embryonic nervous system.</a> Gene Expr Patterns. 9, 475-489 (2009).</li>
<li>Zervas, M., Millet, S., Ahn, S., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+behaviors+and+genetic+lineages+of+the+mesencephalon+and+rhombomere+1%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cell behaviors and genetic lineages of the mesencephalon and rhombomere 1.</a> Neuron. 43, 345-357 (2004).</li>
</ol>

Alle auteurs droegen ook voor dit werk en zijn alfabetisch gerangschikt. De bijdrage van ieder individu is duidelijk door zijn of haar deelname aan de video-artikel.

Het GIFM systeem dat we hebben laten zien kan worden gebruikt om een ​​breed scala van vragen in een verscheidenheid van cellulaire processen te beantwoorden. Kan bijvoorbeeld muizen ontwikkeld met verschillende Cre drivers worden gebruikt om een ​​celtype, weefsel of genetische afstamming van belang doel. Bovendien, omdat tamoxifen kan worden toegediend op elk gewenst embryonale of postnatale tijdstip, kan recombinatie worden gericht op alle relevante ontwikkelingsfase. De ruimtelijke en temporele controle van dit syst...

een praktische benadering van genetische induceerbare fate mapping: een visuele gids voor mark en track cellen in vivo</em

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Fate kaarten worden gegenereerd door deze te markeren en het bijhouden van cellen in vivo te bepalen hoe voorouders bijdragen aan de specifieke structuren en celtypes in het ontwikkelen en volwassen weefsel. Een voorschot in dit concept is G enetic ik nducible F at M apping (GIFM), het koppelen van genexpressie, lot van de cel, en cel-gedrag in vivo, het lot kaarten gebaseerd op genetische afstamming te creëren. GIFM exploits X-Creer lijnen waarbij X een gen of een reeks van gen-regulatorische elementen die de ruimtelijke expressie van een aangepaste bacteriofaag eiwit, Cre-recombinase (Creer T) verleent. Creer T bevat een aangepaste e Strogen r eceptor ligand bindend domein dat Creer T maakt afgezonderd in het cytoplasma in de afwezigheid van het geneesmiddel tamoxifen. De binding van tamoxifen releases Creer T, die naar de kern en bemiddelt recombinatie tussen DNA-sequenties geflankeerd door loxP sites. In GIFM, recombinatie treedt meestal op tussen een loxP geflankeerd Stop cassette voorafgaand aan een reporter-gen, zoals GFP. Muizen zijn gefokt om ofwel een regio-of celtype-specifieke Creer en een voorwaardelijke verslaggever allel bevatten. Onbehandelde muizen hebben geen markering, omdat de Stop-cassette in de verslaggever voorkomt verdere transcriptie van het reportergen. Wij beheren tamoxifen door orale sondevoeding aan timed-drachtige vrouwtjes, die tijdelijke controle van Creer T release en de daarna translocatie naar de kern het verwijderen van de Stop cassette van de verslaggever biedt. Naar aanleiding van recombinatie, de verslaggever allel is constitutief en heritably uitgedrukt. Deze reeks van gebeurtenissen merken cellen zodanig dat hun genetische geschiedenis onuitwisbaar is vastgelegd. De gerecombineerde verslaggever dient dus als een high fidelity genetische afkomst tracer die, eenmaal op, is losgekoppeld van de genexpressie in eerste instantie gebruikt om Creer T rijden. Wij passen GIFM in de muis om een ​​normale ontwikkeling en vast te stellen de bijdrage van genetische lineages tot volwassen soorten cellen en weefsels te bestuderen. We gebruiken ook GIFM om cellen te volgen op de mutant genetische achtergronden om beter te begrijpen complexe fenotypen die opvallende kenmerken van de menselijke genetische aandoeningen na te bootsen. Deze video artikel leidt onderzoekers door middel van experimentele methoden om met succes toe te passen GIFM. Tonen we de methode met behulp van onze goed gekarakteriseerde Wnt1-Creer T; mGFP muizen door het toedienen van tamoxifen bij embryonale dag (E) 8.5 via orale sondevoeding, gevolgd door ontleding bij E12.5 en analyse door epifluorescentie stereomicroscopie. We hebben ook laten zien hoe het lot in kaart gebracht domeinen micro-ontleden voor explantatie voorbereiding of FACS-analyse en ontleden volwassen lot-mapped hersenen voor de ganse berg fluorescerende beeldvorming. Tezamen zijn deze procedures kunnen de onderzoekers de kritische vragen in de ontwikkelingsbiologie en ziekte-modellen adres.

Genetische Induceerbare Fate Mapping (GIFM) merken en tracks cellen met fijne ruimtelijke en temporele controle<em&gt; In vivo</em&gt; En belicht hoe de cellen van een specifieke genetische afstamming een bijdrage leveren aan het ontwikkelen en volwassen weefsels. Hier blijkt zijn de technieken die nodig zijn om het lot kaart E12.5 muis embryo&#39;s voor epifluorescerende en explantatie analyse.

Een praktische benadering van genetische Induceerbare Fate Mapping: een visuele gids voor Mark en Track Cellen In Vivo</em

Lotingskaarten worden gegenereerd door cellen in vivo te markeren en te volgen om te bepalen hoe progenitorcellen bijdragen aan specifieke structuren en celtypen in ontwikkelende ...

Lotgevraagkaarten worden gegenereerd door cellen in vivo te markeren en te volgen om te bepalen hoe progenitorcellen bijdragen aan specifieke structuren en celtypen in ontwikkelend en volwassen weefsel. Een verdere ontwikkeling van dit concept is genetisch induceerbare lotgevraagskaarting of GIFM, waarbij genexpressie, celgedrag in vivo en celgedragingen worden gekoppeld om lotgevraagkaarten te maken op basis van genetische afstamming. Hallo, mijn naam is Deborah Ellisor van het Mark Services Laboratory en de afdeling Moleculaire Biologie, Celbiologie en Biochemie aan de Brown University.Vandaag zullen mijn collega's Ashley Brown, Liz Norman Neen Hagen, Steve Brown en ik een procedure demonstreren voor genetische induceerbare fate mapping. We gebruiken deze procedure in het laboratorium om de vroege ontwikkeling van de hersenen te bestuderen. We kunnen deze techniek ook toepassen op gen-inactiveringsstudies en diermodellen van menselijke ziekten.Laten we beginnen met X cre, E-R-M-G-F-P embryo's. MGFP LAE is een reporterallel dat in alle cellen aanwezig is, weergegeven door grijze ovalen X cre, er, waarbij X de genregulerende elementen vertegenwoordigt. De controle van de C ER-expressie is ruimtelijk beperkt tot het expressiedomein van gen X, weergegeven in het blauw, en het CRE ER-eiwit wordt door HSP 90 in het cytoplasma vastgehouden.In de afwezigheid van Tamoxifen zal de reporter uitstaan. Toediening van Tamoxifen resulteert in fate-mapped cellen in domein X omdat CER wordt vrijgegeven uit HSP 90, naar de nucleus transloceert en de stopcassette uit het reporterallel verwijdert. Permanente en erfelijk overdraagbare recombinatie zorgt ervoor dat cellen MG FP LA Z constitutief tot expressie brengen. De combinatie van het reporterallel CER en tamoxifen resulteert in markering waarbij een celpopulatie aanvankelijk wordt gemarkeerd in een primordiale hersenregio van het embryo op basis van genexpressie; deze fate-mapped cellen worden gevolgd, zelfs nadat de initiële genexpressie die CER aanstuurde is uitgedoofd.Op deze manier kunnen de uiteindelijke distributie en het eindlot van een genetisch gedefinieerde cellijn in de volwassene worden geïdentificeerd. Deze procedure begint met de bereiding van een 20 mg/mL stamoplossing van tamoxifen; los 200 mg tamoxifen op in 10 mL voorverwarmde maïsolie in een glazen inhalatievloeitje.Incubeer de oplossing vervolgens twee uur bij 37 °C op een Tator vortexmixer. Bescherm de bereide Tamoxifen-stamloplossing tegen licht door het flesje in folie te wikkelen en bewaar deze bij 4 °C. De stamoplossing kan tot één maand worden bewaard.Voor fate mapping-experimenten wordt een fokpaar samengesteld bestaande uit een wild-type Swiss Webster vrouwtje en een mannetje dat zowel een genspecifiek CreER-allel als een reporter-allel draagt. Voor deze demonstratie gebruiken we een win to one CreER MG FP mannetje. Controleer het Swiss Webster vrouwtje elke ochtend op de aanwezigheid van een vaginale prop.Stel de ochtend van de dag waarop de vaginale prop is waargenomen vast als 0,5 dagen na de copulatie en bereken de datum van toediening van Tamoxifen. Op basis van dit startpunt in dit experiment wordt Tamoxifen toegediend op embryonale dag 8,5. Trek met een spuit van één milliliter en een voedingsnaald voor dieren 200 µL van de Tamoxifen-stamoplossing op.Houd de drachtige Swiss Webster-vrouwtjesmuis stevig vast door de nekvel en rug te grijpen om de kop te immobiliseren en draai de muis om zodat de ventrale zijde naar boven is gericht. Houd de staart tussen uw vrije vingers om het lichaam in een rechte lijn te houden. Plaats vervolgens de voedingsnaald in de mondhoek en geleid de naald voorzichtig parallel aan het gehemelte totdat de punt van de voedingsnaald zich ongeveer ter hoogte van het oog bevindt.Kantel de kop voorzichtig naar achteren om toegang te krijgen tot de slokdarm. Geleid de naald langs de epiglottis en door de slokdarm naar de maag. Zorg ervoor dat u niet in de trachea terechtkomt.Zodra de voedingsnaald zich in de maag bevindt, wordt het tamoxifen toegediend en de naald verwijderd. Plaats het vrouwtje vervolgens terug in haar thuiskooi tot de datum van de dissectie. Op de dag van de dissectie worden de E 12.5 embryo's van het tijdgebonden drachtige vrouwtje vrijgelegd en vervolgens beoordeeld op GFP-markering.In een GFP-positief embryo observeren we dat wind one-afgeleide neuronen bijdragen aan de middenhersenen, de ruitvormige kern van de achterhersenen en het ruggenmerg. De MG FP-reporter markeert axonale projecties, die ook zichtbaar kunnen zijn; overdraag GFP-positieve embryo's via whole mount naar een Petri-schaal met PPS en fotografeer deze met een fototoestel. Nadat de embryo's zijn gefotografeerd, gebruik dan een pincet om een klein stukje staart van elk embryo af te knippen en plaats elk stukje in een PCR-buis. De weefsels worden via PCR genotypeerd voor beide allelen om de resultaten uit de whole mount-analyse te bevestigen.De volgende procedures stellen ons in staat om te analyseren hoe de gemarkeerde cellen afkomstig uit embryonale regio's het volwassen brein koloniseren voorafgaand aan het starten van de craniotomie. Bevestig met een knijptest in de teen dat de muis volledig is genarceerd. Nadat de muis is genarceerd met nembutal, worden incisies gemaakt om toegang te krijgen tot het hart via de borstkas.Plaats vervolgens een vlindernaald in de apex of de linker ventrikel van het hart en zet deze vast met de C-klem. Maak met een schaar een uitgang voor de vloeistof in het rechter atrium en perfuseer vervolgens met 10 tot 15 milliliters ijskoude zoutoplossing totdat de vloeistof helder is. Volg dit met 20 tot 25 milliliters 4%paraform aldehyde.Wanneer de intracardiale perfusie voltooid is, wordt de kop met een schaar verwijderd door door de wervelkolom net boven de schouders te knippen. Trek een scalpel langs de dorsale middellijn van de kop, rostral de cottle, om door de hoofdhuid te snijden en de schedel bloot te leggen. Schraap met de scalpel eventueel overtollig weefsel of spierweefsel weg langs de zijkant en de achterzijde van het cranium.Doorboor met een pincet de schedel op de middellijn, net rostral van de olfactory bulbs, en maak een klein gaatje waar de punten van een fijne schaar door passen. Voer de fijne schaar in dit gaatje en maak twee bilaterale incisies vanuit de middellijn langs de lengte van de olfactory bulbs. Deze snede zal de schedel breken op het kruispunt van het neusbeen en het frontale been, wat een goede toegang voor de schaar biedt.Snijd langs de sagittale naden in de schedel, waarbij u ervoor zorgt dat de scharenpunten van de hersenen af zijn gericht om beschadiging van het onderliggende weefsel te voorkomen. Pak vervolgens de schedel voorzichtig vast met een pincet en pel het bot langs de mediale incisie weg om de hersenen bloot te leggen. De schedel kan in kleine stukjes afschilferen of in grotere secties afbreken.Gebruik de pincet verder om alle frontale, pariëtale, interpariëtale en occipitale beenderen te verwijderen. Maak de para oculi, die zich langs de laterale randen van de hersenen op het niveau van het cerebellum bevinden, vrij door de bolvormige beenderen aan elke zijde voorzichtig samen te knijpen. Gebruik een schaar om het dorsale deel van het bot dat de hersenstam omringt voorzichtig door te knippen.Steek één zijde van de schaar net onder de dorsale rand van het bot, beginnend vanaf de plek waar het ruggenmerg is doorgesneden en snijd in de richting van het cerebellum. Dit dient om de hersenstam en het cerebellum vrij te maken. Verwijder het resterende bot rondom de hersenstam met de pincet.Trek de botten voorzichtig weg, draai de kop met de dorsale zijde naar beneden en gebruik de pincet om de hersenzenuwen door te snijden en de hersenen uit de schedel te bevrijden. Plaats de hersenen in een Petrischaal met ijs. Beoordeel de volwassen hersenen op GFP-markering met een fluorescent dissectiemicroscoop en maak foto's met behulp van een fotolijst.In dit voorbeeld is de middenhersenen gemarkeerd met GFP; naast het gebruik voor lineage-analyse tijdens de embryogenese en bij de volwassen GIFM kan dit worden gecombineerd met andere toepassingen die veelvuldig worden gebruikt in de ontwikkelingsbiologie, zoals microdissectie en weefselexplant-experimenten. Bijvoorbeeld, het ventrale mesencephalon is de progenitorzone voor ontwikkelende dopaminerge neuronen die het gen wind one tot expressie brengen. Het isoleren van het ventrale mesencephalon via microdissectie maakt het dus mogelijk om een in vitro-setting op te zetten om de ontwikkeling ervan verder te onderzoeken.Dit is slechts één voorbeeld van het gebruik van GIFM om een progenitorzone van belang te isoleren die is gedefinieerd door de genetische geschiedenis. Om deze procedure te starten, brengt u de eerder geïdentificeerde GFP-positieve embryo's met een fijne schaar over naar ijskoud steriel PBS in een kweekschaal. Verwijder het hoofdgedeelte van een embryo door transversaal te snijden.Verwijder vervolgens het rostrale deel van de kop met een coronale snede door het cephalon. Hierdoor wordt een buisvormige structuur zichtbaar waarin het vierde ventrikel via de mesencefalische vesikel een verbinding vormt tussen dorsale en ventrale weefsels. Voer de schaarpunten voorzichtig in het vierde ventrikel in en knip langs de dorsale middenlijn in rostrale richting om de buis volledig te openen, waardoor een 'open-boek'-preparaat ontstaat.Het ventrale mesencephalon wordt nu mediaal blootgelegd. Terwijl de twee dorsale helften van het mesencephalon lateraal blijven liggen, kan het noodzakelijk zijn om eventueel resterend niet-neuraal weefsel onder het ventrale mesencephalon te verwijderen. Om te zorgen dat het preparaat plat ligt, moet het preparaat nu lijken op een vlinder, waarbij het dorsale mesencephalon de vleugels vertegenwoordigt en rhombomere 1 de staart.Om het ventrale mesencephalon verder te isoleren voor fax-analyse of celcultuurexperimenten, verwijdert u de laterale aspecten van het weefsel. Nu tonen we enkele representatieve resultaten van GIFM. In dit experiment worden WINT1-expresserende cellen, gemarkeerd tot E 8.5, gevisualiseerd om te bepalen hoe WINT1-directe cellen bijdragen aan neurale structuren gedurende de ontwikkeling.Bijvoorbeeld, wanneer C EER MG FP-embryo's op E 12.5 worden onderzocht, vertonen deze GFP-fluorescentie voornamelijk in het middenbrein, het achterste deel van het rhombencephalon en het ruggenmerg; bij hoge vergroting zijn fijne neuronale projecties te zien die innervatie vormen. De gemarkeerde cellen in de lichaamswand van het middenbrein, de ledematen en de craniofaciale regio kunnen ook op cellulair niveau worden gevisualiseerd en geanalyseerd via immunohistochemie. Zoals getoond op deze één micrometer dikke optische sectie van een E 12.5-embryo, gemarkeerd door toediening van Tamoxifen op E 8.5, duidt de nucleaire bèta-galactose-antilichaamlabeling in rood en de GFP-antilichaamlabeling in groen de fate-mapped cellen aan in het ventrale middenbrein.Hier zijn de gecombineerde cellen dubbel positief vanwege de aard van de conditionele MGFP-reporter in de volwassen hersenen. De dichtheid van het volwassen weefsel kan de GFP-fluorescentie uit interne hersenstructuren maskeren. Daarom vertoont whole-mount fluorescentiemicroscopie slechts zwakke GFP-fluorescentie in de superieure CUI van de volwassene bij de beoordeling van de winst.Eén lineage die is gemarkeerd op E 8.5 in coupes van volwassen dieren bij microscopie met lage vergroting laat zien dat de WIN one lineage leidt tot structuren in de middenhersenen, inclusief de superieure en inferieure colliculi. In deze afbeelding met hogere vergroting, genomen van de ventrale middenhersenen in de nabijheid van dopaminerge neuronen, zijn nucleair bèta-cal positieve cellen en een rijke GFP-positieve axonale plexus zichtbaar; in contrast hiermee resulteert markering op E 9.5 in aanzienlijke GFP-labeling die gemakkelijk waarneembaar is in de inferieure colliculus van de middenhersenen via fluorescence whole mount. De WINT one lineage gemarkeerd op E 9.5 in coupes van volwassen dieren is geconcentreerd in de inferieure colliculus, zoals te zien is met microscopie met lage vergroting.In deze afbeelding met een hogere vergroting, genomen van het ventrale middenbrein van dopaminerge neuronen, zijn nuclear beta gel-positieve cellen en een rijk GFP-positief axonaal plexus zichtbaar. Hoewel win one-afgeleide neuronen gemarkeerd bij E 8.5 versus E 9.5 progressief worden beperkt in hun bijdrage aan het dorsale middenbrein, blijft de WIN one-lijn bijdragen aan het ventrale middenbrein.We hebben zojuist de procedure voor genetische induceerbare fate mapping gedemonstreerd om cellijnen in vivo te markeren en te volgen. Hiermee kunnen we cellen markeren op basis van hun genetische afkomst en ze in de loop van de tijd volgen, zelfs nadat de genexpressie is gestopt. Door tamoxifen toe te dienen op dag acht en een half, hebben we aangetoond dat het wit one-domein bijdraagt aan de ontwikkeling van het midbrain, in aanvulling op het gehele midbrain in de volwassene.In tegenstelling hiermuist leidt het toedienen van tamoxifen op een tijdstip waarop het Wnt1-domein beperkt wordt, tot een meer beperkte bijdrage aan de ontwikkelende midbrain tijdens de embryogenese, wat aanhoudt tot in de volwassen fase. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk rekening te houden met het feit dat het systeem cellen mozaïekachtig markeert, waardoor niet elke cel in een specifieke structuur gelabeld hoeft te zijn. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de CRE-er-lijn of het gebruikte conditionele reporterallel.Belangrijk is dat, hoewel de celmarkering mozaïekachtig is, het patroon en de distributie van de mar-cellen zeer reproduceerbaar zijn. Wij hebben vastgesteld dat toediening van tamoxifen via orale gavage voordeliger is vergeleken met toediening via intraperitoneale injectie, omdat het ontsteking in de intraperitoneale ruimte en mechanische schade aan de embryo's minimaliseert. Dat is alles.Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

a-practical-approach-to-genetic-inducible-fate-mapping-visual-guide

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een methode wordt beschreven om enkele cellen met een gekooide fluorescerend eiwit met behulp van twee-foton absorptie van een Ti photoactivate: Sapphire femtoseconde laser oscillator. Het lot kaart brengen van de gefotoactiveerd cel, wordt immunohistochemie gebruikt. Deze techniek kan worden toegepast op elk celtype.

Single Cell Fate Mapping in de zebravis

Cellulaire processen zoals celmigratie van oudsher bestudeerd op twee-dimensionale, stijve kunststof oppervlakken. Dit rapport beschrijft een techniek voor het direct visualiseren eiwit lokalisatie en het analyseren van eiwitten dynamiek in cellen migreren in een meer fysiologisch relevante, drie-dimensionale matrix.

Live-cell imaging van het migreren van cellen die fluorescent-gemerkte eiwitten in een drie-dimensionale Matrix

Combinatorische 5 fluorescerende eiwitten markering van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen maakt in vivo klonale volgen via confocale en twee-foton microscopie, het verstrekken van inzicht in het beenmerg hematopoietische architectuur tijdens de regeneratie. Deze methode maakt het mogelijk niet-invasieve lot in kaart brengen van spectraal-gecodeerde HSPCs-afgeleide cellen in intacte weefsels voor langere perioden na de transplantatie.

In vivo Klonale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen Gekenmerkt door Five fluorescerende eiwitten met behulp van confocale microscopie en Multiphoton

In dit artikel beschrijven we de principes voor het ontwerpen en uitvoeren van een multi-kleurig lijn-traceringsexperiment met behulp van R26R-Confetti muizen. We bieden een specifiek protocol voor het volgen van hoornvliesepitheelcellen die kunnen worden aangepast voor andere weefsels van belang.

Een methode voor Lineage Tracing van hoornvliescellen De Multi-kleur Fluorescent Reporter Muizen

Door celtransplantatie, cytoskelettenlabeling en verlies/winst van functiebenaderingen te combineren, beschrijft dit protocol hoe de migrererende zebravis prospectieve prechordale plaat kan worden gebruikt om de functie van een kandidaatgen in in vivo celmigratie te analyseren.

analyseren<em&gt; In Vivo</em&gt; Cell Migratie behulp Cell Transplantaties en Time-lapse Imaging in zebravis embryo&#39;s

Live volgen van individuele WT retinale voorlopers in verschillende genetische achtergronden maakt voor de beoordeling van de bijdrage van de cel niet-zelfstandige signalering tijdens de neurogenese. Hier, een combinatie van gen knockdown, chimeer generatie via embryo transplantatie en in vivo time-lapse confocale beeldvorming werd gebruikt voor dit doel.

In vivo beeldvorming van transgene Gene Expression Individuele retinale voorouders in chimère zebravis embryo&#39;s to Cell Nonautonomous Invloeden Studie

Het hier beschreven protocol maakt gebruik van een photolabeling benadering bij pasgeboren muizen te specifiek immune cellen die van de dubbelpunt te naar extra intestinale sites emigreren te identificeren. Deze strategie zal worden nuttig zijn te onderzoeken van host-microbiome interacties in vroege leven.

In Vivo Photolabeling cellen in de dikke darm te beoordelen van trekkende potentieel van hematopoietische cellen in neonatale muizen

De hier gepresenteerde methode maakt gebruik van micropatterning samen met kwantitatieve beeldvorming om de ruimtelijke ordening binnen de zoogdier culturen te onthullen. De techniek is gemakkelijk vast te stellen in een standaard laboratorium voor celbiologie en biedt een Tractable systeem om patronen in vitro te bestuderen.

De opkomende ruimtelijke ordening van zoogdiercellen in kaart brengen met behulp van micro patronen en kwantitatieve beeldvorming

Morfologische veranderingen optreden in immuun responsieve fibroblast cellen na activering en het bevorderen van veranderingen in cellulaire werving. Gebruik makend van 2-Photon Imaging in combinatie met een genetisch gemanipuleerde fibroblast-specifieke proteïne 1 (FSP1)-CRE; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) muis lijn en groene fluorescently gelabeld lipopolysaccharide-FITC, we kunnen zeer specifieke opname van lipopolysaccharide in dermale fibroblasten en morfologische veranderingen in...

In vivo tweekleurige 2-Fobe beeldvorming van genetisch gelabelde reporter cellen in de huid

Het vermogen om stamcellen en hun nakomelingen permanent te markeren met een fluorofoor met behulp van een induceerbare transgene lineage tracing muislijn maakt ruimtelijke en temporele analyse van activering, proliferatie, migratie en / of differentiatie in vivo mogelijk. Lineage tracing kan nieuwe informatie onthullen over lineage commitment, reactie op interventie(s) en multipotentie.

Afstamming Tracering van induceerbare fluorescerend gelabelde stamcellen in het volwassen muizenbrein

Leer genetische induceerbare fate mapping om cellen in vivo te markeren en volgen met epifluorescentie-analyse. Deze techniek onthult bijdragen van progenitorcellen aan hersenontwikkeling bij muizenembryo's.

Een praktische benadering van genetische Induceerbare Fate Mapping: een visuele gids voor Mark en Track Cellen In Vivo

Meer video's verkennen