Een praktische benadering van genetische Induceerbare Fate Mapping: een visuele gids voor Mark en Track Cellen In Vivo

Lotgevraagkaarten worden gegenereerd door cellen in vivo te markeren en te volgen om te bepalen hoe progenitorcellen bijdragen aan specifieke structuren en celtypen in ontwikkelend en volwassen weefsel. Een verdere ontwikkeling van dit concept is genetisch induceerbare lotgevraagskaarting of GIFM, waarbij genexpressie, celgedrag in vivo en celgedragingen worden gekoppeld om lotgevraagkaarten te maken op basis van genetische afstamming. Hallo, mijn naam is Deborah Ellisor van het Mark Services Laboratory en de afdeling Moleculaire Biologie, Celbiologie en Biochemie aan de Brown University.

Vandaag zullen mijn collega's Ashley Brown, Liz Norman Neen Hagen, Steve Brown en ik een procedure demonstreren voor genetische induceerbare fate mapping. We gebruiken deze procedure in het laboratorium om de vroege ontwikkeling van de hersenen te bestuderen. We kunnen deze techniek ook toepassen op gen-inactiveringsstudies en diermodellen van menselijke ziekten.

Laten we beginnen met X cre, E-R-M-G-F-P embryo's. MGFP LAE is een reporterallel dat in alle cellen aanwezig is, weergegeven door grijze ovalen X cre, er, waarbij X de genregulerende elementen vertegenwoordigt. De controle van de C ER-expressie is ruimtelijk beperkt tot het expressiedomein van gen X, weergegeven in het blauw, en het CRE ER-eiwit wordt door HSP 90 in het cytoplasma vastgehouden.

In de afwezigheid van Tamoxifen zal de reporter uitstaan. Toediening van Tamoxifen resulteert in fate-mapped cellen in domein X omdat CER wordt vrijgegeven uit HSP 90, naar de nucleus transloceert en de stopcassette uit het reporterallel verwijdert. Permanente en erfelijk overdraagbare recombinatie zorgt ervoor dat cellen MG FP LA Z constitutief tot expressie brengen. De combinatie van het reporterallel CER en tamoxifen resulteert in markering waarbij een celpopulatie aanvankelijk wordt gemarkeerd in een primordiale hersenregio van het embryo op basis van genexpressie; deze fate-mapped cellen worden gevolgd, zelfs nadat de initiële genexpressie die CER aanstuurde is uitgedoofd.

Op deze manier kunnen de uiteindelijke distributie en het eindlot van een genetisch gedefinieerde cellijn in de volwassene worden geïdentificeerd. Deze procedure begint met de bereiding van een 20 mg/mL stamoplossing van tamoxifen; los 200 mg tamoxifen op in 10 mL voorverwarmde maïsolie in een glazen inhalatievloeitje.

Incubeer de oplossing vervolgens twee uur bij 37 °C op een Tator vortexmixer. Bescherm de bereide Tamoxifen-stamloplossing tegen licht door het flesje in folie te wikkelen en bewaar deze bij 4 °C. De stamoplossing kan tot één maand worden bewaard.

Voor fate mapping-experimenten wordt een fokpaar samengesteld bestaande uit een wild-type Swiss Webster vrouwtje en een mannetje dat zowel een genspecifiek CreER-allel als een reporter-allel draagt. Voor deze demonstratie gebruiken we een win to one CreER MG FP mannetje. Controleer het Swiss Webster vrouwtje elke ochtend op de aanwezigheid van een vaginale prop.

Stel de ochtend van de dag waarop de vaginale prop is waargenomen vast als 0,5 dagen na de copulatie en bereken de datum van toediening van Tamoxifen. Op basis van dit startpunt in dit experiment wordt Tamoxifen toegediend op embryonale dag 8,5. Trek met een spuit van één milliliter en een voedingsnaald voor dieren 200 µL van de Tamoxifen-stamoplossing op.

Houd de drachtige Swiss Webster-vrouwtjesmuis stevig vast door de nekvel en rug te grijpen om de kop te immobiliseren en draai de muis om zodat de ventrale zijde naar boven is gericht. Houd de staart tussen uw vrije vingers om het lichaam in een rechte lijn te houden. Plaats vervolgens de voedingsnaald in de mondhoek en geleid de naald voorzichtig parallel aan het gehemelte totdat de punt van de voedingsnaald zich ongeveer ter hoogte van het oog bevindt.

Kantel de kop voorzichtig naar achteren om toegang te krijgen tot de slokdarm. Geleid de naald langs de epiglottis en door de slokdarm naar de maag. Zorg ervoor dat u niet in de trachea terechtkomt.

Zodra de voedingsnaald zich in de maag bevindt, wordt het tamoxifen toegediend en de naald verwijderd. Plaats het vrouwtje vervolgens terug in haar thuiskooi tot de datum van de dissectie. Op de dag van de dissectie worden de E 12.5 embryo's van het tijdgebonden drachtige vrouwtje vrijgelegd en vervolgens beoordeeld op GFP-markering.

In een GFP-positief embryo observeren we dat wind one-afgeleide neuronen bijdragen aan de middenhersenen, de ruitvormige kern van de achterhersenen en het ruggenmerg. De MG FP-reporter markeert axonale projecties, die ook zichtbaar kunnen zijn; overdraag GFP-positieve embryo's via whole mount naar een Petri-schaal met PPS en fotografeer deze met een fototoestel. Nadat de embryo's zijn gefotografeerd, gebruik dan een pincet om een klein stukje staart van elk embryo af te knippen en plaats elk stukje in een PCR-buis. De weefsels worden via PCR genotypeerd voor beide allelen om de resultaten uit de whole mount-analyse te bevestigen.

De volgende procedures stellen ons in staat om te analyseren hoe de gemarkeerde cellen afkomstig uit embryonale regio's het volwassen brein koloniseren voorafgaand aan het starten van de craniotomie. Bevestig met een knijptest in de teen dat de muis volledig is genarceerd. Nadat de muis is genarceerd met nembutal, worden incisies gemaakt om toegang te krijgen tot het hart via de borstkas.

Plaats vervolgens een vlindernaald in de apex of de linker ventrikel van het hart en zet deze vast met de C-klem. Maak met een schaar een uitgang voor de vloeistof in het rechter atrium en perfuseer vervolgens met 10 tot 15 milliliters ijskoude zoutoplossing totdat de vloeistof helder is. Volg dit met 20 tot 25 milliliters 4%paraform aldehyde.

Wanneer de intracardiale perfusie voltooid is, wordt de kop met een schaar verwijderd door door de wervelkolom net boven de schouders te knippen. Trek een scalpel langs de dorsale middellijn van de kop, rostral de cottle, om door de hoofdhuid te snijden en de schedel bloot te leggen. Schraap met de scalpel eventueel overtollig weefsel of spierweefsel weg langs de zijkant en de achterzijde van het cranium.

Doorboor met een pincet de schedel op de middellijn, net rostral van de olfactory bulbs, en maak een klein gaatje waar de punten van een fijne schaar door passen. Voer de fijne schaar in dit gaatje en maak twee bilaterale incisies vanuit de middellijn langs de lengte van de olfactory bulbs. Deze snede zal de schedel breken op het kruispunt van het neusbeen en het frontale been, wat een goede toegang voor de schaar biedt.

Snijd langs de sagittale naden in de schedel, waarbij u ervoor zorgt dat de scharenpunten van de hersenen af zijn gericht om beschadiging van het onderliggende weefsel te voorkomen. Pak vervolgens de schedel voorzichtig vast met een pincet en pel het bot langs de mediale incisie weg om de hersenen bloot te leggen. De schedel kan in kleine stukjes afschilferen of in grotere secties afbreken.

Gebruik de pincet verder om alle frontale, pariëtale, interpariëtale en occipitale beenderen te verwijderen. Maak de para oculi, die zich langs de laterale randen van de hersenen op het niveau van het cerebellum bevinden, vrij door de bolvormige beenderen aan elke zijde voorzichtig samen te knijpen. Gebruik een schaar om het dorsale deel van het bot dat de hersenstam omringt voorzichtig door te knippen.

Steek één zijde van de schaar net onder de dorsale rand van het bot, beginnend vanaf de plek waar het ruggenmerg is doorgesneden en snijd in de richting van het cerebellum. Dit dient om de hersenstam en het cerebellum vrij te maken. Verwijder het resterende bot rondom de hersenstam met de pincet.

Trek de botten voorzichtig weg, draai de kop met de dorsale zijde naar beneden en gebruik de pincet om de hersenzenuwen door te snijden en de hersenen uit de schedel te bevrijden. Plaats de hersenen in een Petrischaal met ijs. Beoordeel de volwassen hersenen op GFP-markering met een fluorescent dissectiemicroscoop en maak foto's met behulp van een fotolijst.

In dit voorbeeld is de middenhersenen gemarkeerd met GFP; naast het gebruik voor lineage-analyse tijdens de embryogenese en bij de volwassen GIFM kan dit worden gecombineerd met andere toepassingen die veelvuldig worden gebruikt in de ontwikkelingsbiologie, zoals microdissectie en weefselexplant-experimenten. Bijvoorbeeld, het ventrale mesencephalon is de progenitorzone voor ontwikkelende dopaminerge neuronen die het gen wind one tot expressie brengen. Het isoleren van het ventrale mesencephalon via microdissectie maakt het dus mogelijk om een in vitro-setting op te zetten om de ontwikkeling ervan verder te onderzoeken.

Dit is slechts één voorbeeld van het gebruik van GIFM om een progenitorzone van belang te isoleren die is gedefinieerd door de genetische geschiedenis. Om deze procedure te starten, brengt u de eerder geïdentificeerde GFP-positieve embryo's met een fijne schaar over naar ijskoud steriel PBS in een kweekschaal. Verwijder het hoofdgedeelte van een embryo door transversaal te snijden.

Verwijder vervolgens het rostrale deel van de kop met een coronale snede door het cephalon. Hierdoor wordt een buisvormige structuur zichtbaar waarin het vierde ventrikel via de mesencefalische vesikel een verbinding vormt tussen dorsale en ventrale weefsels. Voer de schaarpunten voorzichtig in het vierde ventrikel in en knip langs de dorsale middenlijn in rostrale richting om de buis volledig te openen, waardoor een 'open-boek'-preparaat ontstaat.

Het ventrale mesencephalon wordt nu mediaal blootgelegd. Terwijl de twee dorsale helften van het mesencephalon lateraal blijven liggen, kan het noodzakelijk zijn om eventueel resterend niet-neuraal weefsel onder het ventrale mesencephalon te verwijderen. Om te zorgen dat het preparaat plat ligt, moet het preparaat nu lijken op een vlinder, waarbij het dorsale mesencephalon de vleugels vertegenwoordigt en rhombomere 1 de staart.

Om het ventrale mesencephalon verder te isoleren voor fax-analyse of celcultuurexperimenten, verwijdert u de laterale aspecten van het weefsel. Nu tonen we enkele representatieve resultaten van GIFM. In dit experiment worden WINT1-expresserende cellen, gemarkeerd tot E 8.5, gevisualiseerd om te bepalen hoe WINT1-directe cellen bijdragen aan neurale structuren gedurende de ontwikkeling.

Bijvoorbeeld, wanneer C EER MG FP-embryo's op E 12.5 worden onderzocht, vertonen deze GFP-fluorescentie voornamelijk in het middenbrein, het achterste deel van het rhombencephalon en het ruggenmerg; bij hoge vergroting zijn fijne neuronale projecties te zien die innervatie vormen. De gemarkeerde cellen in de lichaamswand van het middenbrein, de ledematen en de craniofaciale regio kunnen ook op cellulair niveau worden gevisualiseerd en geanalyseerd via immunohistochemie. Zoals getoond op deze één micrometer dikke optische sectie van een E 12.5-embryo, gemarkeerd door toediening van Tamoxifen op E 8.5, duidt de nucleaire bèta-galactose-antilichaamlabeling in rood en de GFP-antilichaamlabeling in groen de fate-mapped cellen aan in het ventrale middenbrein.

Hier zijn de gecombineerde cellen dubbel positief vanwege de aard van de conditionele MGFP-reporter in de volwassen hersenen. De dichtheid van het volwassen weefsel kan de GFP-fluorescentie uit interne hersenstructuren maskeren. Daarom vertoont whole-mount fluorescentiemicroscopie slechts zwakke GFP-fluorescentie in de superieure CUI van de volwassene bij de beoordeling van de winst.

Eén lineage die is gemarkeerd op E 8.5 in coupes van volwassen dieren bij microscopie met lage vergroting laat zien dat de WIN one lineage leidt tot structuren in de middenhersenen, inclusief de superieure en inferieure colliculi. In deze afbeelding met hogere vergroting, genomen van de ventrale middenhersenen in de nabijheid van dopaminerge neuronen, zijn nucleair bèta-cal positieve cellen en een rijke GFP-positieve axonale plexus zichtbaar; in contrast hiermee resulteert markering op E 9.5 in aanzienlijke GFP-labeling die gemakkelijk waarneembaar is in de inferieure colliculus van de middenhersenen via fluorescence whole mount. De WINT one lineage gemarkeerd op E 9.5 in coupes van volwassen dieren is geconcentreerd in de inferieure colliculus, zoals te zien is met microscopie met lage vergroting.

In deze afbeelding met een hogere vergroting, genomen van het ventrale middenbrein van dopaminerge neuronen, zijn nuclear beta gel-positieve cellen en een rijk GFP-positief axonaal plexus zichtbaar. Hoewel win one-afgeleide neuronen gemarkeerd bij E 8.5 versus E 9.5 progressief worden beperkt in hun bijdrage aan het dorsale middenbrein, blijft de WIN one-lijn bijdragen aan het ventrale middenbrein.

We hebben zojuist de procedure voor genetische induceerbare fate mapping gedemonstreerd om cellijnen in vivo te markeren en te volgen. Hiermee kunnen we cellen markeren op basis van hun genetische afkomst en ze in de loop van de tijd volgen, zelfs nadat de genexpressie is gestopt. Door tamoxifen toe te dienen op dag acht en een half, hebben we aangetoond dat het wit one-domein bijdraagt aan de ontwikkeling van het midbrain, in aanvulling op het gehele midbrain in de volwassene.

In tegenstelling hiermuist leidt het toedienen van tamoxifen op een tijdstip waarop het Wnt1-domein beperkt wordt, tot een meer beperkte bijdrage aan de ontwikkelende midbrain tijdens de embryogenese, wat aanhoudt tot in de volwassen fase. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk rekening te houden met het feit dat het systeem cellen mozaïekachtig markeert, waardoor niet elke cel in een specifieke structuur gelabeld hoeft te zijn. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de CRE-er-lijn of het gebruikte conditionele reporterallel.

Belangrijk is dat, hoewel de celmarkering mozaïekachtig is, het patroon en de distributie van de mar-cellen zeer reproduceerbaar zijn. Wij hebben vastgesteld dat toediening van tamoxifen via orale gavage voordeliger is vergeleken met toediening via intraperitoneale injectie, omdat het ontsteking in de intraperitoneale ruimte en mechanische schade aan de embryo's minimaliseert. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.