Name: Axoplasm Isolatie van Rat heupzenuw (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-24T17:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 29 s
Description: Leer axoplasma-isolatie uit de zenuw van de rat voor neurowetenschappelijk onderzoek. Deze methode gebruikt hypotone incubatie en centrifugatie om zuiver axonaal cytoplasma te verkrijgen voor biochemische analyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit protocol maakt axoplasm isolatie met een minimalisering van gliale en vasculaire besmetting van de weefsels. De methode levert ongeveer 70 tot 100 ug totaal eiwit per axoplasm een ​​8-10 weken oud Wistar rat. 1. Ontleden bil Zenuwen <ol><li> Euthanaseren twee ratten door CO 2 inhalatie, gevolgd door cervicale dislocatie. Bevestig dood door palperen bij gebrek aan hartslag voor het begin van dissectie. </li><li> Uitstrijkje van de dissectie gebied met 70% ethanol. </li><li> Snijd de huid, de spieren los en te isoleren heupzenuw met een schaar en pincet voorzichtig zonder beschadiging van bloedvaten. Ontleden zowel sciatic zenuwen (ongeveer 1,5 cm per stuk) van elk dier en alle vier de zenuwen in een eppendorf met 500 pi PBS + 0,2 x-remmers te verzamelen, bleef op het ijs. </li><li> Breng de zenuw segmenten van kunststof borden met ten minste 2 ml PBS + 0,2 x protease-remmers. </li><li> Haal de epineurium van de zenuwen met behulp van fijne pincet onder de binoculair scope. Scheid de bundels zeer zorgvuldig totdat ze bewolkt en begint te zweven op het oppervlak van de oplossing. Deze stap moet geoefend worden totdat het kan snel en nauwkeurig worden uitgevoerd (niet het nemen van meer dan 10 minuten per zenuw). </li></ol> 2. Incubatie, Wassen en elutie <ol><li> Overdracht gescheiden bundels een nieuwe eppendorfbuisje met 500 pi PBS 0,2 x met protease remmers voor incubatie gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. </li><li> Was minstens 3 keer met 1 ml van dezelfde buffer door de overdracht van de bundels van eppendorfbuisje tot eppendorfbuisje en schudden gedurende 5 minuten na de overdracht. </li><li> Voor het verwijderen van overmaat aan vocht de bundels in een nieuw leeg eppendorfbuisje en breng de bundels aan een nieuwe eppendorfbuisje met 300 pi PBS 1X met protease-remmer voor incubatie gedurende 20-30 min bij RT. </li><li> Centrifugeer 10 min bij 10.000 xg bij 4 ° C. </li><li> Neem het supernatant en meet eiwit concentratie. Dit is uw axoplasm voorbereiding. </li></ol> 3. Representatieve resultaten <img src="/files/ftp_upload/2087/2087fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Western blot vergelijken axoplasm geïsoleerd door de handmatige methode knijpen met geïsoleerde axoplasm monsters zoals in dit protocol. Let op de lagere niveaus van albumine en GFAP, die het bloed eiwit-en gliale cel besmettingen, respectievelijk. In tegenstelling, is axonale tubuline b3 verrijkt met dit preparaat, wat wijst op een hoge mate van axonale eiwitten.

<ol><li>Hanz, S., Perlson, E., Willis, D., Zheng, J. Q., Massarwa, R., Huerta, J. J., Koltzenburg, M., Kohler, M., van-Minnen, J., Twiss, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axoplasmic+importins+enable+retrograde+injury+signaling+in+lesioned+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Axoplasmic importins enable retrograde injury signaling in lesioned nerve.</a> Neuron. 40, 1095-1104 (2003).</li>
<li>Michaelevski, I., Medzihradszky, K. F., Lynn, A., Burlingame, A. L., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+proteomics+reveals+mobilization+of+translation+machinery+to+the+lesion+site+in+injured+sciatic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Axonal transport proteomics reveals mobilization of translation machinery to the lesion site in injured sciatic nerve.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (5), 976-987 (2010).</li>
<li>Rishal, I., Michaelevski, I., Rozenbaum, M., Shinder, V., Medzihradszky, K. F., Burlingame, A. L., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axoplasm+isolation+from+peripheral+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Axoplasm isolation from peripheral nerve.</a> Dev Neurobiol. 70, 126-133 (2010).</li>
<li>Twiss, J. L., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomes+in+axons--scrounging+from+the+neighbors%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ribosomes in axons--scrounging from the neighbors.</a> Trends Cell Biol. 19, 236-243 (2009).</li>
</ol>

Biochemische en proteomics analyses hebben bevestigd dat deze procedure serum en gliale cel besmetting 3 vermindert in vergelijking met de eerder beschreven methoden voor het axoplasm isolatie door mechanisch persen 1. We hebben gebruik gemaakt van deze axoplasm isolatie protocol om dyneine op basis van retrograde signalering verkennen na heupzenuw verwonding 2, en het nut te hebben in de exploratie van de vele andere processen in de volwasseneneducatie perifere zenuwen, met inbegrip van...

<ul><li> Mannelijke Wistar ratten (8-10 weken oud) </li><li> PBS 0,2 x en PBS 1X oplossingen die proteaseremmers (Roshe) 2 tabletten per 50 ml </li><li> Eppendorfs voor 1,5 ml </li><li> Gesteriliseerd plastic schaaltjes 35 mm </li><li> Ontleden tools, zoals: schaar en fijn pincet </li><li> Verrekijker en tafel licht </li></ul> Antilichamen Muizen-anti-GFAP kloon GA-5 was van Sigma (G6171). Konijn anti-albumine was van Cedarlane (CLAG5140). Muis anti-tubuline β3 en konijn anti-Gerk waren van Sigma (T2200 en M5670 respectievelijk).

axoplasm isolatie van rat heupzenuw

Axoplasm Isolation from Rat Sciatic Nerve

Isolatie van pure axonale cytoplasma (axoplasm) van perifere zenuwen is van cruciaal belang zijn voor biochemisch onderzoek van de vele biologische processen. In dit artikel tonen we en beschrijven een protocol voor axoplasm isolatie van volwassen ratten heupzenuw op basis van de volgende stappen: (1) dissectie van de zenuw bundels en de scheiding van bindweefsel, (2) incubatie van korte segmenten van de zenuw bundels in hypotone medium aan myeline release en lyseren niet-axonale structuren, en (3) extractie van de resterende axon-verrijkt materiaal. Proteomics en biochemische karakterisering van deze voorbereiding heeft bevestigd dat een hoge mate van verrijking voor axonale componenten.

Demonstreren we een protocol voor axoplasm isolatie van volwassen ratten heupzenuw op basis van dissectie van de zenuw bundels en incubatie in hypotone medium om myeline release en lyseren niet-axonale structuren, gevolgd door extractie van de resterende axon-verrijkt materiaal.

Axoplasm Isolatie van Rat heupzenuw

De isolatie van zuiver axonaal cytoplasma (axoplasma) uit perifere zenuwen is cruciaal voor biochemische studies naar vele biologische processen. In dit artikel ...

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van zuiver axonaal cytoplasma of ectoplasma uit een perifere zenuw. Dit wordt bereikt door eerst de nervus ischiadicus (ischiaszenuw) te dissekeren. De tweede stap van de procedure is het verwijderen van het bindweefsel uit de zenuw en het scheiden van de sles.De derde stap van de procedure is de incubatie van korte segmenten zenuwvezels in een hypotoon medium. De laatste stap van de procedure is incubatie in een isotone oplossing, centrifugatie en osmosezuivering. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die een hoge graad van verrijking van axonale componenten aantonen via western blot-analyse.Hallo, mijn naam is Elle Rosenbaum. Wij komen uit het laboratorium van professor Mike F. Labor van de afdeling Biologische Chemie van het Institute of Science. Vandaag gaan we een nieuwe techniek voor oxy-opat-mesylering presenteren.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals handmatige squeeze OIS van perifere zenuwen, is dat deze procedure de contaminatie van axonale inhoud door serum en glia vermindert. We hebben deze nieuwe techniek gebruikt voor op PLAs methylering om D-gebaseerde retro-signalering na letsel aan de nervus ischiadicus te onderzoeken.Laten we beginnen. Plaats een van de twee geëuthanaseerde Wistar-ratten van 8 tot 10 weken oud op de zij op een dissectiemat voor een directe benadering van het distale deel van de nervus ischiadicus. Scheer de huid in het midden van het dijbeen en veeg dit grondig af met 70% ethanol.Gebruik een schaar om de huid van het dijbeen weg te knippen. Snijd voorzichtig door het vet en het bindweefsel tussen de biceps femoris en de oppervlakkige gluteale spieren. Gebruik een pincet om het blootgelegde deel van de nervus ischiadicus op te tillen en te verwijderen.Het verwijderde gedeelte zal ongeveer 1,5 centimeter lang zijn. Breng de zenuw over naar 500 µL ijskoud 2X PBS met protease-remmers in een microcentrifugebuis. Bewaar de buis op ijs.Herhaal de dissectieprocedure aan de andere zijde van de rat en aan beide zijden van een tweede rat. Kras de bodem van een Petri-schaal met een Pasteurpipet en vul deze met twee milliliters kamertemperatuur. 2X PBS met protease-remmers.Verplaats een enkele zenuw onder de dissectiemicroscoop naar de schaal. Gebruik een fijne pincet om het epineurium van de zenuw te verwijderen door het weg te trekken en gooi dit weg, zodat de fascikels in de schaal achterblijven. Scheid de fascikels voorzichtig van elkaar en van de bodem van de schaal.Individuele cellen zullen troebel worden en naar het oppervlak van de oplossing drijven. Breng de gescheiden cellen onmiddellijk over naar een microcentrifugebuisje met 500 µL 0,2 X PBS met protease-remmers. Houd de cellen op ijs.Scheid en verzamel de sles van de resterende nervus ischiadica in de buis door middel van oefening. Het verwijderen van het epineurium en het scheiden van de sles mag niet meer dan 10 minuten per zenuw duren.Haal de buis met de gescheiden SLES uit het ijs. Incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur om myeline en niet-axonale structuren los te maken. Was de sles bij elke wasbeurt.Gebruik een pincet om de sles voorzichtig op te tillen en over te brengen naar een nieuwe buis met één milliliter 2X PB s met proteaseremmers. Schud de buis vijf minuten op een schudplatform. Was de SLES op deze manier drie keer na het wassen.Overbreng de SLES naar een schone, lege eppendorfbuis om overtollig vocht te verwijderen en breng dit vervolgens over naar een buis met 300 µL 1X PBS met protease-remmers; incubeer gedurende 20 tot 30 minuten bij kamertemperatuur. Om de opsm te elueren, kunnen hogere zoutconcentraties verdere proteomics-procedures hinderen. Centrifugeer het monster bij 10.000 ×g gedurende 10 minuten bij 4 °C om het weefsel en celresten te pelletteren en pipetteer het supernatant over in een schone eppendorfbuis.Het verkregen supernatant moet helder zijn. Gebruik een spectrofotometer om de eiwitconcentratie te meten.Er moet een opbrengst van 200 tot 250 microgram proteïne worden verkregen. Bewaar de plasmabehandeling in aliquoten bij -80 °C voor maximaal zes maanden. Vermijd dooi- en vriescycli.Hier is een western blot waarin op plasm geïsoleerd via de handmatige knijpmethode wordt vergeleken met opsm-monsters geïsoleerd zoals beschreven in dit protocol. Let op de verlaagde niveaus van albumine en GFAP, die respectievelijk staan voor contaminaties door bloedeiwitten en gliacellen. In tegenstelling hiertoe is axonale tubuline bèta drie verrijkt in deze preparatie, wat duidt op een hoog niveau van axonale eiwitten.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de nervus ischiadicus moet dissekeren en hoe u de Paco correct moet scheiden. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

axoplasm-isolation-from-rat-sciatic-nerve

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Door de eenvoud van de ingreep en de robuuste gedrag dat eruit voortkomt, chronische vernauwing van de nervus ischiadicus is een van de vooraanstaande dierlijke modellen van neuropathische pijn. Binnen 24 uur na een operatie, wordt de pijn overgevoeligheid vastgesteld en kan kwantitatief gemeten worden met een von Frey aesthesiometer (mechanische test) en plantaire analgesie meter (thermische test).

Chronische Vernauwing van de nervus ischiadicus en Pijn Overgevoeligheid Testen bij ratten

This video outlines the isolation and culturing of Schwann cells from mouse spinal roots. Isolated cells are then cultured in specific media. Schwann cells are isolated via differential digestion and adherence. They are subsequently transferred to extracellular matrix-coated coverslips for attachment and proliferation.

Isolation of Schwann Cells from Mouse Spinal Roots

This video demonstrates a method for isolating Schwann cells from mouse sciatic nerve fibers.

Magnetic Separation of Schwann Cells from Mouse Sciatic Nerves

This video demonstrates a single-fiber recording of C-fiber nerve conduction in rats. An anesthetized rat is incised to expose the sciatic nerve, which provides sensory and motor supply to the lower limbs. The individual C-fibers are then exposed. Electrical stimulation is provided using stimulus electrodes implanted in the foot, and a response is recorded from a single nerve fiber.

In Vivo Single-Fiber Recording of Sciatic Nerve C-Fibers in Rats

Hier presenteren we een in vivo techniek voor genoverdracht naar Schwann-cellen (SC's) in de wetenschappelijke nervus ischiadicus bij knaagdieren. Deze eenvoudige techniek is nuttig voor het onderzoeken van signaalmechanismen die betrokken zijn bij de ontwikkeling en instandhouding van myeliniserende SC's.

In vivo genoverdracht naar Schwann cellen in het knaagdier heupzenuw door elektroporatie

Hier presenteren we een protocol voor hydraulische extrusie van het ruggenmerg evenals identificatie en isolatie van specifieke dorsale wortelganglia (DRG's) in hetzelfde knaagdier. In vergelijking met standaard methoden voor ruggenmergisolatie is deze methode aanzienlijk sneller en vermindert het risico op weefselschade.

Hydraulische extrusie van het ruggenmerg en isolatie van achterwortelganglia in Knaagdieren

Single-Fiber opname is een effectieve elektrofysiologische techniek die toepasbaar is op de centrale en perifere zenuwstelsels. Samen met de voorbereiding van intact DRG met de bijgevoegde sciatische zenuw, het mechanisme van geleiding falen wordt onderzocht. Beide protocollen verbeteren het begrip van de relatie van het perifere zenuwstelsel met pijn.

Gebruik van in vivo single-Fiber opname en intact dorsale wortel ganglion met bijgevoegde Sciatische zenuw om het mechanisme van geleidings falen te onderzoeken

Deze methode maakt het mogelijk de opname van de kracht van twitch en tetanische contracties en actie potentialen in drie soorten motorische eenheden in de rat mediale gastrocnemius spier. De functionele isolatie van een enkele motorunit wordt veroorzaakt door elektrische stimulatie van de axon.

Functionele isolatie van enkele motoreenheden van Rat Medial Gastrocnemius Muscle

Dit protocol beschrijft de voorbereiding van het hele heupzenuwweefsel van ratten voor ex vivo elektrofysiologische stimulatie en registratie in een milieugereguleerd, tweecompartimenten, doordrenkt zoutoplossingsbad.

Voorbereiding van de heupzenuw van de rat voor ex vivo neurofysiologie

In het cocultuursysteem van dorsale wortelganglia en Schwann-cellen kan myelinisatie van het perifere zenuwstelsel worden bestudeerd. Dit model biedt experimentele mogelijkheden om perifere myelinisatie te observeren en te kwantificeren en om de effecten van interessante verbindingen op de myelineschede te bestuderen.

In vitro myelinisatie van perifere axonen in een cocultuur van dorsale wortel ganglionexplantaten en Schwann-cellen

Leer axoplasma-isolatie uit de zenuw van de rat voor neurowetenschappelijk onderzoek. Deze methode gebruikt hypotone incubatie en centrifugatie om zuiver axonaal cytoplasma te verkrijgen voor biochemische analyse.

Axoplasm Isolatie van Rat heupzenuw

Meer video's verkennen