Axoplasm Isolatie van Rat heupzenuw
24 september 2010
Demonstreren we een protocol voor axoplasm isolatie van volwassen ratten heupzenuw op basis van dissectie van de zenuw bundels en incubatie in hypotone medium om myeline release en lyseren niet-axonale structuren, gevolgd door extractie van de resterende axon-verrijkt materiaal.
Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van zuiver axonaal cytoplasma of ectoplasma uit een perifere zenuw. Dit wordt bereikt door eerst de nervus ischiadicus (ischiaszenuw) te dissekeren. De tweede stap van de procedure is het verwijderen van het bindweefsel uit de zenuw en het scheiden van de sles.
De derde stap van de procedure is de incubatie van korte segmenten zenuwvezels in een hypotoon medium. De laatste stap van de procedure is incubatie in een isotone oplossing, centrifugatie en osmosezuivering. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die een hoge graad van verrijking van axonale componenten aantonen via western blot-analyse.
Hallo, mijn naam is Elle Rosenbaum. Wij komen uit het laboratorium van professor Mike F. Labor van de afdeling Biologische Chemie van het Institute of Science. Vandaag gaan we een nieuwe techniek voor oxy-opat-mesylering presenteren.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals handmatige squeeze OIS van perifere zenuwen, is dat deze procedure de contaminatie van axonale inhoud door serum en glia vermindert. We hebben deze nieuwe techniek gebruikt voor op PLAs methylering om D-gebaseerde retro-signalering na letsel aan de nervus ischiadicus te onderzoeken.
Laten we beginnen. Plaats een van de twee geëuthanaseerde Wistar-ratten van 8 tot 10 weken oud op de zij op een dissectiemat voor een directe benadering van het distale deel van de nervus ischiadicus. Scheer de huid in het midden van het dijbeen en veeg dit grondig af met 70% ethanol.
Gebruik een schaar om de huid van het dijbeen weg te knippen. Snijd voorzichtig door het vet en het bindweefsel tussen de biceps femoris en de oppervlakkige gluteale spieren. Gebruik een pincet om het blootgelegde deel van de nervus ischiadicus op te tillen en te verwijderen.
Het verwijderde gedeelte zal ongeveer 1,5 centimeter lang zijn. Breng de zenuw over naar 500 µL ijskoud 2X PBS met protease-remmers in een microcentrifugebuis. Bewaar de buis op ijs.
Herhaal de dissectieprocedure aan de andere zijde van de rat en aan beide zijden van een tweede rat. Kras de bodem van een Petri-schaal met een Pasteurpipet en vul deze met twee milliliters kamertemperatuur. 2X PBS met protease-remmers.
Verplaats een enkele zenuw onder de dissectiemicroscoop naar de schaal. Gebruik een fijne pincet om het epineurium van de zenuw te verwijderen door het weg te trekken en gooi dit weg, zodat de fascikels in de schaal achterblijven. Scheid de fascikels voorzichtig van elkaar en van de bodem van de schaal.
Individuele cellen zullen troebel worden en naar het oppervlak van de oplossing drijven. Breng de gescheiden cellen onmiddellijk over naar een microcentrifugebuisje met 500 µL 0,2 X PBS met protease-remmers. Houd de cellen op ijs.
Scheid en verzamel de sles van de resterende nervus ischiadica in de buis door middel van oefening. Het verwijderen van het epineurium en het scheiden van de sles mag niet meer dan 10 minuten per zenuw duren.
Haal de buis met de gescheiden SLES uit het ijs. Incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur om myeline en niet-axonale structuren los te maken. Was de sles bij elke wasbeurt.
Gebruik een pincet om de sles voorzichtig op te tillen en over te brengen naar een nieuwe buis met één milliliter 2X PB s met proteaseremmers. Schud de buis vijf minuten op een schudplatform. Was de SLES op deze manier drie keer na het wassen.
Overbreng de SLES naar een schone, lege eppendorfbuis om overtollig vocht te verwijderen en breng dit vervolgens over naar een buis met 300 µL 1X PBS met protease-remmers; incubeer gedurende 20 tot 30 minuten bij kamertemperatuur. Om de opsm te elueren, kunnen hogere zoutconcentraties verdere proteomics-procedures hinderen. Centrifugeer het monster bij 10.000 ×g gedurende 10 minuten bij 4 °C om het weefsel en celresten te pelletteren en pipetteer het supernatant over in een schone eppendorfbuis.
Het verkregen supernatant moet helder zijn. Gebruik een spectrofotometer om de eiwitconcentratie te meten.
Er moet een opbrengst van 200 tot 250 microgram proteïne worden verkregen. Bewaar de plasmabehandeling in aliquoten bij -80 °C voor maximaal zes maanden. Vermijd dooi- en vriescycli.
Hier is een western blot waarin op plasm geïsoleerd via de handmatige knijpmethode wordt vergeleken met opsm-monsters geïsoleerd zoals beschreven in dit protocol. Let op de verlaagde niveaus van albumine en GFAP, die respectievelijk staan voor contaminaties door bloedeiwitten en gliacellen. In tegenstelling hiertoe is axonale tubuline bèta drie verrijkt in deze preparatie, wat duidt op een hoog niveau van axonale eiwitten.
Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de nervus ischiadicus moet dissekeren en hoe u de Paco correct moet scheiden. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol voor het isoleren van axoplasma uit de nervus ischiadicus van de volwassen rat. De methode omvat de dissectie van zenuwbundels en incubatie in een hypotoon medium om myeline effectief vrij te maken en niet-axonale structuren te lyseren, wat leidt tot de extractie van axon-verrijkt materiaal.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Axonaal onderzoek
Achtergrond
- De isolatie van axonaal cytoplasma is cruciaal voor het bestuderen van de neuronale functie.
- De nervus ischiadicus dient als model voor studies naar perifere zenuwen.
- Inzicht in axonale componenten kan bijdragen aan neurologisch onderzoek.
- Eerdere methoden leveren mogelijk geen zuiver axonaal materiaal op.
Doel van de studie
- Om een betrouwbaar protocol te ontwikkelen voor de isolatie van axoplasma.
- Om de zuiverheid van axonaal cytoplasma te verhogen voor verdere analyse.
- Om de studie van axonale componenten met behulp van biochemische technieken te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Dissectie van de nervus ischiadicus om toegang te krijgen tot de zenuwbundels.
- Verwijdering van het bindweefsel rondom de zenuw.
- Incubatie van zenuwsegmenten in een hypotoon medium.
- Vervolgcentrifugatie en incubatie in een isotone oplossing.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol isoleert met succes axonaal cytoplasma.
- Western blot-analyse bevestigt een sterke verrijking van axonale componenten.
- De resultaten tonen de effectiviteit van de methode aan.
- Potentiële toepassingen bij het bestuderen van de axonale biologie worden benadrukt.
Conclusies
- Deze methode biedt een robuuste benadering voor de isolatie van axoplasma.
- Het kan worden ingezet in diverse studies met betrekking tot de neuronale functie.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van de axonale structuur en functie.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
De isolatie van zuiver axonaal cytoplasma maakt mechanische risicobeperking mogelijk bij de validatie van targets voor programma's tegen neurodegeneratieve ziekten. Dit protocol ondersteunt de voorspellende betrouwbaarheid door biologische ruis van niet-axonale contaminanten in perifere zenuwmodellen te verminderen. Het biedt een ziekterelevant systeem voor het bestuderen van axonale signaleringsroutes die relevant zijn voor de ontdekking van neurotherapeutica.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt analyse van de axonale eiwitsamenstelling mogelijk om therapeutische hypothesen te verduidelijken.
- Operationele waarde: Vermindert gliale en serumcontaminatie die signalen van target engagement maskeren.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt functionele validatie van targets door verrijking van axonale componenten zoals tubulin beta three.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid voor assay: Produceert gestandaardiseerde axon-verrijkte lysaten die geschikt zijn voor biochemische screening.
- Kwantitatieve output: Maakt spectrophotometrische proteïneconcentratiemeting mogelijk voor normalisatie.
- Reproduceerbaarheid: Een consistente opbrengst van 200-250 micrograms ondersteunt betrouwbare screening van verbindingen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziekterelevantie: Modelleert perifere zenuwbeschadiging en retrograde signalering na trauma aan de nervus ischiadicus.
- Translationele Continuïteit: Slaat een brug tussen ontdekking en preklinische validatie van doelwitten voor axonale biologie.
- Risico-gecorrigeerde Beslissingen: Faciliteert go/no-go-beslissingen op basis van axonale doelwitmodulatie.
Integratie van Pipeline en Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van het testen van hypothesen over targets tot de preklinische validatie van axonale modulatoren.
- Discovery Biology: Ondersteunt de verduidelijking van signaalpaden door axonaal cytoplasma te isoleren voor proteomische profilering.
- Screening: Maakt de bereiding van gestandaardiseerde lysaten mogelijk voor de beoordeling van het effect van verbindingen.
- Analytics: Western blot-analyse biedt kwantitatieve resultaten voor axonale verrijking.
- Translational Research: Legt een verbinding met studies naar retrograde signalering die relevant zijn voor zenuwletselmodellen.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor het verminderen van risico's bij perifere zenuwdoelen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid door een hoge verrijking van axonale componenten en verminderde contaminatiesignalen.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerde dissectie- en incubatiestappen waarborgen de reproduceerbaarheid tussen laboratoria.
- Strategische waarde: Betere prioritering van targets door het minimaliseren van fout-positieven afkomstig van gliale eiwitten of bloedeiwitten.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde vooruitgang van neurotherapeutische kandidaten op basis van zuivere axonale read-outs.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in perifere zenuwdissectie en steriele techniek.
- Vereist infrastructuur voor centrifuge, spectrophotometer en protease-remmers.
- Vereist standaardisatie van de hypotone incubatietijd tussen verschillende operators.
- Overwegingen voor aanpassing aan andere zenuwtypen of soorten buiten de rattenischiasznerv.
- Praktische beperking: De duur van de procedure beperkt high-throughput toepassing zonder automatisering.
