Axoplasm Isolatie van Rat heupzenuw
24 september 2010
Demonstreren we een protocol voor axoplasm isolatie van volwassen ratten heupzenuw op basis van dissectie van de zenuw bundels en incubatie in hypotone medium om myeline release en lyseren niet-axonale structuren, gevolgd door extractie van de resterende axon-verrijkt materiaal.
Het algemene doel van deze procedure is om zuiver axonale cytoplasma of ectoplasma te isoleren van perifere zenuw. Dit wordt bereikt door eerst de nervus ischiadicus te dissecteren. De tweede stap van de procedure is het verwijderen van bindweefsel uit de zenuw en het scheiden van de sles.
De derde stap van de procedure is de incubatie van korte segmenten van zenuwsles in hypotoon medium. De laatste stap van de procedure is incubatie in isotone oplossing, centrifugatie en opsm milian. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die een hoge mate van verrijking voor axonale componenten laten zien door middel van western blot-analyse.
Hallo, mijn naam is I, Elle And I may Rosenbaum. We komen uit het laboratorium van Professor Mike F Labor Department of Biological Chemistry gebaseerd Institute of Science. Vandaag gaan we een nieuwe techniek van Oxy Opat Mesylation presenteren.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals handmatig knijpen OIS van perifere zenuw. Dat is dat deze procedure serum en glos besmetting van axonale inhoud vermindert. We hebben deze nieuwe techniek gebruikt voor op PLAs methylatie om D-gebaseerde retro-signalering na sciatische zenuwletsel te onderzoeken.
Dus laten we beginnen. Plaats een van de geëuthaniseerde acht tot tien weken oude Wistar-ratten op zijn zij op een dissectiemat voor een directe benadering van het distale deel van de nervus ischiadicus. Scheer de huid op de middelste dij en wissel grondig met 70% ethanol.
Gebruik een schaar om de huid van de dij af te snijden. Snijd voorzichtig door het vet en bindweefsel tussen de femorale biceps en oppervlakkige gluteale spieren. Gebruik een pincet om het blootgestelde gebied van de nervus ischiadicus op te tillen en verwijder het.
De verwijderde sectie zal ongeveer 1,5 centimeter lang zijn. Breng de zenuw over naar 500 microliter ijskoud 2X PBS met proteaseremmers in een microcentrifugebuisje. Houd de buis op ijs.
Herhaal de dissectieprocedure aan de andere kant van de rat en aan beide kanten van een tweede rat. Kras de bodem van een petrischaal met een pasterpipet en vul het met twee milliliter kamertemperatuur. Punt twee X PB s met proteaseremmers.
Breng een enkele zenuw over naar de schotel onder de dissectiemicroscoop. Gebruik fijn pincet om het epinearium van de zenuw te verwijderen door het weg te trekken en weggooien, waarbij de faciles in de schotel achterblijven. Scheid de faciles voorzichtig van elkaar en van de bodem van de schotel.
Individuele fales worden troebel en drijvend op het oppervlak van de oplossing. Breng de gescheiden fales onmiddellijk over naar een microcentrifugebuisje met 500 microliter 0,2 X PB s met proteaseremmers. Houd de sles op ijs.
Scheid en verzamel sles van de resterende sciatica in de buis met oefening. Verwijdering van het epineurum en scheiding van de sles. Moet niet meer dan 10 minuten per zenuw duren.
Verwijder de buis met de gescheiden SLES van het ijs. Incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur om myeline en lice niet-axonale structuren vrij te maken. Was de sles voor elke wasbeurt.
Gebruik pincet om de sles voorzichtig op te tillen en breng ze over naar een verse buis met één milliliter 2X PB s met proteaseremmers. Schud de buis vijf minuten op een rocker. Was de SLES op deze manier drie keer na het wassen.
Breng de SLES over naar een verse lege einorbuis om overtollig vocht te verwijderen en breng ze vervolgens over naar een buis met 300 microliter 1 XPBS met proteusremmers. Incubeer gedurende 20 tot 30 minuten bij kamertemperatuur. Om de opsm te elueren, interfereren hogere zoutconcentraties met verdere proteomics-procedures. Centrifugeer de fascikel gedurende 10 minuten bij 10.000 g bij vier graden Celsius om het weefsel en celdebris te pellen en pipet het supernatant in een schone einorbuis.
Het verkregen supernatant. Moet helder zijn. Gebruik een spectrofotometer om de eiwitconcentratie te meten.
Er moet een opbrengst van 200 tot 250 microgram eiwit worden verkregen. Bewaar de op plasm-voorbereiding in aliquoten bij min 80 graden Celsius gedurende maximaal zes maanden. Vermijd ontdooi- en invriescycli.
Hier is een westerse blok die op plasm vergelijkt dat isolatie door de handmatige knijpmethode met opsm-monsters geïsoleerd zoals getoond in dit protocol. Merk de verminderde niveaus van albumine en GFAP op, die respectievelijk bloedeiwit en gliacellenbesmettingen vertegenwoordigen. In tegenstelling daarmee is axonale tubuline beta drie verrijkt in deze voorbereiding, wat wijst op een hoog niveau van axonale eiwitten.
Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een satic-zenuw moet dissecteren en hoe u Paco goed kunt scheiden. Dus dat is het. Bedankt voor het bekijken en veel succes met uw experimenten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol voor het isoleren van axoplasm van de wetenschappelijke ratwetenschap. De methode omvat dissectie van zenuwbundels en incubatie in een hypotoon medium om effectief myeline vrij te maken en niet-axonale structuren te lyseren, wat leidt tot de extractie van axon-verrijkt materiaal.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Celbiologie
- Axonaal onderzoek
Achtergrond
- Isolatie van axonaal cytoplasma is cruciaal voor het bestuderen van neuronale functie.
- De wetenschappelijke zenuw dient als model voor perifere zenuwstudies.
- Begrip van axonaal componenten kan helpen bij neurologisch onderzoek.
- Vorige methoden leveren mogelijk niet puur axonaal materiaal op.
Doel van het onderzoek
- Om een betrouwbaar protocol voor axoplasm isolatie te ontwikkelen.
- Om de zuiverheid van axonaal cytoplasma te verbeteren voor verdere analyse.
- Om de studie van axonaal componenten met behulp van biochemische technieken te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Dissectie van de wetenschappelijke zenuw om toegang te krijgen tot zenuwbundels.
- Verwijdering van bindweefsel rond de zenuw.
- Incubatie van zenuwsegmenten in een hypotoon medium.
- Daaropvolgende centrifugatie en incubatie in isotone oplossing.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol isoleert met succes axonaal cytoplasma.
- Western blot-analyse bevestigt hoge verrijking van axonaal componenten.
- De resultaten tonen de effectiviteit van de methode aan.
- Mogelijke toepassingen bij het bestuderen van axonaal biologie worden benadrukt.
Conclusies
- Deze methode biedt een robuuste aanpak voor axoplasm isolatie.
- Het kan worden gebruikt in verschillende studies met betrekking tot neuronale functie.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van axonaal structuur en functie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Isolation of pure axonal cytoplasm enables mechanistic de-risking in target validation for neurodegenerative disease programs. This protocol supports predictive confidence by reducing biological noise from non-axonal contaminants in peripheral nerve models. It provides a disease-relevant system for studying axonal signaling pathways relevant to neurotherapeutic discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of axonal protein composition to clarify therapeutic hypotheses.
- Operational Value: Reduces glial and serum contamination that obscures target engagement signals.
- Predictive Value: Supports functional target validation through enrichment of axonal components like tubulin beta three.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized axon-enriched lysates suitable for biochemical screening.
- Quantitative Output: Permits spectrophotometric protein concentration measurement for normalization.
- Reproducibility: Consistent yield of 200-250 micrograms supports reliable compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models peripheral nerve injury and retrograde signaling after sciatic nerve trauma.
- Translational Continuity: Bridges discovery to preclinical validation of axonal biology targets.
- Risk-Adjusted Decisions: Facilitates go/no-go decisions based on axonal target modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to preclinical validation of axonal modulators.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by isolating axonal cytoplasm for proteomic profiling.
- Screening: Enables preparation of standardized lysates for compound effect assessment.
- Analytics: Western blot analysis provides quantitative readouts for axonal enrichment.
- Translational Research: Connects to retrograde signaling studies relevant to nerve injury models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for peripheral nerve target de-risking.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through high enrichment of axonal components and reduced contaminant signals.
- Operational Value: Standardized dissection and incubation steps ensure reproducibility across labs.
- Strategic Value: Better target prioritization by minimizing false positives from glial or blood proteins.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted advancement of neurotherapeutic candidates based on clean axonal readouts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in peripheral nerve dissection and sterile technique.
- Needs centrifuge, spectrophotometer, and protease inhibitor infrastructure.
- Demands standardization of hypotonic incubation timing across operators.
- Adaptation considerations for other nerve types or species beyond rat sciatic nerve.
- Practical limitation: Procedure duration limits high-throughput application without automation.
