Name: High-Efficiency transductie van leverkanker met behulp van recombinant adeno-geassocieerd virus serotype 3 Vectoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 2 s
Description: Leer hoe u AAV3-vectoren produceert voor efficiënte transductie van humane leverkankercellen. Deze methode maakt hoogwaardige gentherapie mogelijk met fluorescente EGFP-expressie als marker.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Drs. R. Jude Samulski en Xiao Xiao voor hun vriendelijke gaven van recombinant AAV3 en AAV-EGFP plasmiden, respectievelijk, en dr. Gail Tomlinson voor het verstrekken van ruim Hep293TT cellen. Dit onderzoek werd mede ondersteund door de GGD te verlenen subsidie ​​R01 HL-076901, R01 HL-097088, en de P01 DK-058327 (Project 1) van de National Institutes of Health (AS).

1. Verpakken van Recombinant adeno-geassocieerd virus serotype 3 (rAAV3) vectoren <ol><li> Ga naar de website: " <a href="http://www.geguchadze.com/calc">http://www.geguchadze.com/calc</a> "en berekent het bedrag van DNA. </li><li> Pre-mix plasmiden pHelper (adenovirus helper), pACG2c3 (AAV helper) en pdsAAV-CB-EGFP (rAAV vector) in medium zonder FBS en antibiotica. Totale volume moet 8.750 ul voor tien 15 cm 2 platen worden. </li><li> Voeg direct 1250 ul van PEI (0,1% m / v, Polysciences, Cat # 23966, pH 4,5) in de DNA-oplossing in stap 1.2. Vortex de DNA-PEI oplossing voor een paar seconden. </li><li> Incubeer DNA-PEI oplossing voor een complex formulier voor 5 min bij kamertemperatuur (RT). </li><li> Voeg 1 mL van DNA-PEI oplossing per 15 cm 2 plaat. </li><li> Verwijder medium na 4 uur, te vervangen met vers 25 ml compleet medium +10% FBS (C-DMEM). </li><li> Tweeënzeventig uur na transfectie, schrapen cellen en giet het in een 250 ml konische centrifugebuis. </li><li> Draaien op 3000 rpm, bij 4 ° C gedurende 10 minuten. Giet af supernatant. </li><li> Resuspendeer de celpellet in 5 ml van de RB TMS buffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8,0). Transfer naar een nieuwe 15 ml conische buis. </li><li> Freeze in droog ijs-ethanol bad gedurende 10 min en ontdooien bij 37 ° C gedurende 10 minuten. Herhaal dit drie keer. </li><li> Voeg 1 ul van 4,8 M MgCl 2 en 2 pi van Benzonase (25 U / uL, Novagen, Cat # 70.664-3). Vortex en incubeer bij 37 ° C gedurende 40 minuten. </li><li> Spin down bij 4.000 toeren per minuut, bij 4 ° C gedurende 40 min en verzamel de supernatant (geklaarde lysaat). </li><li> In een 13 mL Quick-Seal centrifugebuis (Beckman, Cat # 342413), load iodixanol gradiënt (OptiPrep, Cat # 1114542) van boven naar beneden: 2 ml van 15%, 2 ml van 25%, 1,5 ml van 40% en 1,5 ml van 60% iodixanol. Laad de supernatant (Stap 1.12) op de top van iodixanol verloop. Vul de buizen met RB TMS Buffer. </li><li> Centrifugeer bij 75.000 rpm gedurende 1 uur bij 16 ° C met behulp van Beckman 90Ti rotor. </li><li> Verzamel de 40% iodixanol fractie door het invoegen van een spuit op 40-60% grens. </li><li> Breng de 40% iodixanol fractie in een 50 ml conische buis en tot 40 ml te maken met buffer A (20 mM Tris, 15 mM NaCl, pH 8,5). </li><li> Monteer de filtratie waarbij gebruik wordt gemaakt HiTrap Q HP kolom (GE Healthcare, Cat # 17-1154-01). Was de kolom met de volgende buffer: 25 ml buffer A (20 mM Tris, 15 mM NaCl, pH 8,5), 25 ml buffer B (10 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8,5), 50 ml buffer A; 40 ml van het virus monster in Buffer A, 50 ml buffer A (20 mM Tris, 15 mM NaCl, pH 8,5), 20 ml buffer C (20 mM Tris, 175 mM NaCl, pH 8,5); </li><li> Verzamel Buffer C in een 20 mL Apollo Concentrators (Orbital Biosciences). Centrifugeer bij 3.000 tpm, bij 4 ° C gedurende 10 minuten. </li><li> Gooi de doorstroming en voeg 20 ml koud PBS en centrifugeer bij 3.000 toeren per minuut, bij 4 ° C gedurende 10 minuten. </li><li> Gooi de doorstroming en voeg 500 ul van gekoeld PBS. Was de vectoren af ​​van het membraan en overdracht aan siliconen behandeld Eppendorf buizen en op te slaan bevroren in kleine porties bij -80 ° C. </li></ol> 2. Bepaling van de rAAV3 Vector Titers <ol><li> Dooi 10 pi van gezuiverd virus in een Eppendorf buis op ijs. Voeg 40 ul van DDH 2 O. </li><li> Voeg 0,2 ul van Benzonase (25 U / uL, Novagen, Cat # 70664) en incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Neem 50 ul van plasmide standaard (0.2 ng / ul) in een ander eppendorfbuisje. </li><li> Voeg 50 ul van 100 mM NaOH in elke buis en incubeer in 65 ° C gedurende 30 minuten. </li><li> Onmiddellijk Chill op ijs gedurende minstens 5 minuten. </li><li> Snijd overdracht membraan (Millipore, Cat # INYC00010) volgens Bio-Dot Filter Paper (Bio-Rad, Cat # 1620161). Spoel membraan in 10x SSC met drie filter papieren voor 20 minuten. </li><li> Stel slot blot SF Apparatuur (Bio-Dot, Cat # 170 tot 6.542). Verbinding maken met een vacuüm kolf en voeg 100 ul van 10x SSC tot slot blot apparatuur. </li><li> Voeg 100 ul van 20x SSC en 1 pi van 6x laden kleurstof aan elk van de monsters in stap 2.5. </li><li> Belasting 100 pi van elk monster op het membraan in de sleuf blot apparaat. </li><li> Voeg nog een 100 ul van 10x SSC in elk van de monsters. </li><li> Herhaal de stappen 2.9 en 2.10 tot alle monster gaat door het membraan. </li><li> Demonteer de sleuf blot apparaat en verwijder het membraan. Zet het in de Inspector Linker SL-1000 UV Crosslinker. Schakel "Energie", "Optimaal Crosslink" (show 1200) en druk op "Start". </li><li> Kook 1 ml zalmsperma (SS) DNA (Fisher, Cat # NC9753983) gedurende 5 minuten. Chill op ijs gedurende minstens 5 minuten. </li><li> De voorbereiding van de pre-hybridisatie-oplossing door het mengen van 27,5 mL van DDH 2 O, 15 ml 20x SSC, 5 ml van de oplossing 50x Denhardt's, 1,25 ml 20% SDS, 0,25 ml polyA en 1 ml van SS DNA van stap 2.13. </li><li> Hang de membraan in 25 ml van de pre-hybridisatie-oplossing in een bedekte glazen cilinder en incubeer bij 65 ° C in een hybridisatie kamer 's nachts. </li><li> Verdunnen 50 ng DNA-sjablonen in 10 uL van DDH 2 O. Koken bij 100 ° C gedurende 5 min en chillen op het ijs onmiddellijk gedurende minstens 5 minuten. </li><li> Centrifugeer bij 3.000 tpm bij RT gedurende 1 minuut. Voeg 2 ul van 10 mM 3 dNTPs (gebrek aan dCTP), 2 pi van Hexanucleotide Mix (Roche, Cat # 11277081001), 1 ul van Klenow (Roche, Cat # 11008404001) en 5 pi van α -32 P-dCTP. Incubeer bij 37 ° C gedurende 10 minuten. </li><li> Centrifuge G-50 kolommen (GE Healthcare, Cat # 27-5330-01) bij 3.000 tpm gedurende 2 minuten. belasting de sonde in stap 2,17 in de kolom. Centrifugeer bij 3.000 tpm gedurende 2 min en het verzamelen van de doorstroming. </li><li> Tellen radioactiviteit. Kook de sonde bij 100 ° C gedurende 5 min en chillen op het ijs onmiddellijk gedurende minstens 5 minuten. </li><li> Voeg de sonde (6x10 5 cpm / ml) in de pre-hybridisatie-oplossing met een membraan. </li><li> Incubeer overnacht bij 65 ° C in een hybridisatie kamer. </li><li> Gooi de hybridisatie-oplossing en spoel het membraan in 2x SSC +0.1% SDS bij RT gedurende 15 minuten. </li><li> Gooi de oplossing en spoel het membraan in 0.1x SSC +0.1% SDS bij 65 ° C gedurende 30 minuten. </li><li> Gooi de oplossing en spoel het membraan in 0.1x SSC bij RT kort. </li><li> Expose de film bij -80 ° C gedurende 6 uur en de ontwikkeling van de film. Een typisch resultaat is weergegeven in figuur 1. </li></ol> 3. rAAV3 Vector-gemedieerde transductie en Transgene expressie in menselijke lever kankercellen <ol><li> Zaad 1x10 4 cellen (ofwel Huh7 of Hep293TT) in elke well van de 96-well plaat. Incubeer in een bevochtigde CO 2 incubator voor ten minste 18 uur. </li><li> Verwijder medium uit de 96-well plaat. </li><li> Twee keer wassen cellen met 50 ul van medium zonder FBS en antibiotica en te verwijderen. </li><li> Voeg 50 ul van medium zonder FBS en antibiotica en rAAV vectoren in 5000 VGS / cel. </li><li> Incubeer de platen in de CO 2-incubator gedurende 4 uur. </li><li> Gooi het medium. Twee keer wassen cellen met 50 ul van compleet medium en te verwijderen. </li><li> Voeg 150 ul van C-DMEM aan elk putje en incubeer de plaat in CO 2 incubator gedurende 72 uur, en visualiseer de EGFP expressie met behulp van een fluorescentie microscoop (DMI 4000B, Leica Microsystems). </li><li> Beelden uit de drie bronnen van virus-geïnfecteerde cellen worden kwantitatief geanalyseerd door ImageJ analyse software (NIH, Bethesda, MD, USA). </li><li> Transgen expressie wordt beoordeeld als de totale oppervlakte van groene fluorescentie (pixel 2) per gezichtsveld. Een typisch resultaat is weergegeven in figuur 2. </li><li> Transgen expressie kan ook worden bepaald door middel van flowcytometrie. </li></ol> 4. Representatieve resultaten: Naar aanleiding van het protocol hierboven beschreven, kan een efficiënt genereren AAV-serotype vectoren. De typische opbrengst is ~ 500 pi met ~ 10 11 VGS / ul van gezuiverde vector voorraad. De zuiverheid van de vector voorraad wordt bepaald door het vergelijken van hybridisatie signalen op kwantitatieve DNA slot blots, met en zonder Benzonase spijsvertering. Gezuiverd rAAV3 vectoren transduceren menselijke lever kanker - Hepatoblastoma (HB) en hepatocellulair carcinoom (HCC) - cellijnen efficiënt. <img src="/files/ftp_upload/2538/2538fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Kwantitatieve DNA slot-blot-analyse voor het bepalen van de titers van rAAV3 vectoren. Tweevoudige verdunningen van gezuiverde virale voorraden, verteerd met Benzonase (bovenste rij) werden geanalyseerd op kwantitatieve DNA slot blots met 32 P-gelabelde EGFP-specifieke DNA-probe. De titer van AAV3 vector werd bepaald door vergelijking met een ng (middelste rij) of 10 ng (onderste rij) van AAV-EGFP-plasmide normen geladen op het membraan. De nummers komen overeen met DNA-kopieën. <img src="/files/ftp_upload/2538/2538fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Recombinant AAV vector-gemedieerde transgen-expressie in menselijke leverkanker cellen. Hep293TT cellen, een recent opgericht menselijke Hepatoblastoma cellijn 4, werden ofwel mock-geïnfecteerde (linker paneel), of getransduceerd met 5000 VGS / cel van een van beide scAAV2-EGFP of scAAV3-EGFP vectoren bij 37 ° C gedurende 2 uur. Transgenexpressie werd gevisualiseerd 72 uur na transductie met behulp van een fluorescentie microscoop.

<ol><li>Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+AAV+serotypes+1-9+mediated+gene+expression+and+tropism+in+mice+after+systemic+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection.</a> Mol Ther. 16, 1073-1080 (2008).</li>
<li>Glushakova, L. G., Lisankie, M. J., Eruslanov, E. B., Ojano-Dirain, C., Zolotukhin, I., Liu, C., Srivastava, A., Stacpoole, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV3-mediated+transfer+and+expression+of+the+pyruvate+dehydrogenase+E1+alpha+subunit+gene+causes+metabolic+remodeling+and+apoptosis+of+human+liver+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Genet+%26+Metabol%22%5BJournal%5D)">AAV3-mediated transfer and expression of the pyruvate dehydrogenase E1 alpha subunit gene causes metabolic remodeling and apoptosis of human liver cancer cells.</a> Mol Genet & Metabol. 98, 289-299 (2009).</li>
<li>Ling, C., Lu, Y., Kalsi, J. K., Jayandharan, G. R., Li, B., Ma, W., Cheng, B., Gee, S. W., McGoogan, K. E., Govindasamy, L., Zhong, L., Agbandje-McKenna, M., Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatocyte+growth+factor+receptor+is+a+cellular+coreceptor+for+adeno-associated+virus+serotype+3%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Human hepatocyte growth factor receptor is a cellular coreceptor for adeno-associated virus serotype 3.</a> Hum Gene Ther. 21, 1741-1747 (2010).</li>
<li>Chen, T. T., Rakheja, D., Hung, J. Y., Hornsby, P. J., Tabaczewski, P., Malogolowkin, M., Feusner, J., Miskevich, F., Schultz, R., Tomlinson, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+cancer+cell+line+derived+from+an+aggressive+childhood+liver+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Blood+%26+Cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a cancer cell line derived from an aggressive childhood liver tumor.</a> Pediatr Blood & Cancer. 53, 1040-1047 (2009).</li>
<li>Daya, S., Berns, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+using+adeno-associated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Gene therapy using adeno-associated virus vectors.</a> Clin Microbiol Rev. 21, 583-593 (2008).</li>
<li>Zhong, L., Li, B., Mah, C. S., Govindasamy, L., Agbandje-McKenna, M., Cooper, M., Herzog, R. W., Zolotukhin, I., Warrington, K. H. Jr, Weigel-Van Aken, K. A., Hobbs, J. A., Zolotukhin, S., Muzyczka, N., Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+of+adeno-associated+virus+2+vectors%3A+point+mutations+in+tyrosines+lead+to+high-efficiency+transduction+at+lower+doses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Next generation of adeno-associated virus 2 vectors: point mutations in tyrosines lead to high-efficiency transduction at lower doses.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105, 7827-7832 (2008).</li>
<li>Petrs-Silva, H., Dinculescu, A., Li, Q., Min, S. H., Chiodo, V., Pang, J. J., Zhong, L., Zolotukhin, S., Srivastava, A., Lewin, A. S., Hauswirth, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transduction+of+the+mouse+retina+by+tyrosine-mutant+AAV+serotype+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transduction of the mouse retina by tyrosine-mutant AAV serotype vectors.</a> Mol Ther. 17, 463-471 (2009).</li>
<li>Jayandharan, G. R., Zhong, L., Sack, B. K., Rivers, A. E., Li, M., Li, B., Herzog, R. W., Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+adeno-associated+virus+%28AAV%29-protein+phosphatase-5+helper+viruses+for+efficient+liver+transduction+by+single-stranded+AAV+vectors%3A+therapeutic+expression+of+factor+IX+at+reduced+vector+doses%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Optimized adeno-associated virus (AAV)-protein phosphatase-5 helper viruses for efficient liver transduction by single-stranded AAV vectors: therapeutic expression of factor IX at reduced vector doses.</a> Hum. Gene Ther. 21, 271-283 (2010).</li>
<li>Li, M., Jayandharan, G. R., Li, B., Ling, C., Ma, W., Srivastava, A., Zhong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transduction+of+fibroblasts+and+mesenchymal+stem+cells+by+tyrosine-mutant+AAV2+vectors+for+their+potential+use+in+cellular+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transduction of fibroblasts and mesenchymal stem cells by tyrosine-mutant AAV2 vectors for their potential use in cellular therapy.</a> Hum Gene Ther. 21, 1527-1543 (2010).</li>
<li>Kauss, M. A., Smith, L. J., Zhong, L., Srivastava, A., Wong, K. K. J. r, Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+long-term+transduction+and+multilineage+engraftment+of+human+hematopoietic+stem+cells+transduced+with+tyrosine-modified+recombinant+adeno-associated+virus+serotype+2%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Enhanced long-term transduction and multilineage engraftment of human hematopoietic stem cells transduced with tyrosine-modified recombinant adeno-associated virus serotype 2.</a> Hum Gene Ther. 21, 1129-1136 (2010).</li>
<li>Qiao, C., Zhang, W., Yuan, Z., Shin, J. H., Li, J., Jayandharan, G. R., Zhong, L., Srivastava, A., Xiao, X., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+serotype+6+capsid+tyrosine-to-phenylalanine+mutations+improve+gene+transfer+to+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus serotype 6 capsid tyrosine-to-phenylalanine mutations improve gene transfer to skeletal muscle.</a> Hum Gene Ther. 21, 1343-1348 (2010).</li>
<li>Markusic, D. M., Herzog, R. W., Aslanidi, G. V., Hoffman, B. E., Li, B., Li, M., Jayandharan, G. R., Ling, C., Zolotukhin, I., Ma, W., Zolotukhin, S., Srivastava, A., Zhong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transduction+and+correction+of+murine+hemophilia+B+using+AAV2+vectors+devoid+of+multiple+surface-exposed+tyrosines%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transduction and correction of murine hemophilia B using AAV2 vectors devoid of multiple surface-exposed tyrosines.</a> Mol Ther. 18, 2048-2056 (2010).</li>
<li>Ojano-Dirain, C., Glushakova, L. G., Zhong, L., Zolotukhin, S., Muzyczka, N., Srivastava, A., Stacpoole, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+animal+model+of+PDH+deficiency+using+AAV8-siRNA+vector-mediated+knockdown+of+pyruvate+dehydrogenase+E1%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Genet+%26+Metabol%22%5BJournal%5D)">An animal model of PDH deficiency using AAV8-siRNA vector-mediated knockdown of pyruvate dehydrogenase E1α.</a> Mol Genet & Metabol. 101, 183-191 (2010).</li>
<li>Petrs-Silva, H., Dinculescu, A., Li, Q., Deng, W. T., Pang, J. J., Min, S. H., Chiodo, V., Neeley, A. W., Govindasamy, L., Bennett, A., Agbandje-McKenna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+properties+of+tyrosine-mutant+AAV2+vectors+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Novel properties of tyrosine-mutant AAV2 vectors in the mouse retina.</a> Mol Ther. , Forthcoming (2011).</li>
</ol>

Recombinante vectoren gebaseerd op een niet-pathogene menselijke parvovirus, het adeno-associated virus (AAV) zijn ontwikkeld, en zijn momenteel in gebruik in een aantal klinische proeven van gentherapie 5. Eerder, van de 10 meest gebruikte AAV serotypen, heeft de transductie efficiëntie van AAV3 vectoren in het algemeen gemeld te zijn bijzonder laag, zowel in vitro als in vivo 1. Echter, onze recente observatie dat AAV3 vectoren transduceren menselijke lever kanker cellijnen buitengewoon goed, als kwantitatief bepaald door middel van flowcytometrie 2, en dat AAV3 maakt gebruik van de menselijke hepatocyt groeifactor receptor (hHGFR) als een cellulaire co-receptor voor de binding en opname in deze 3 cellen, raden een selectieve weefsel-tropisme van AAV3 voor de menselijke levercellen in het algemeen, en menselijke lever-kankercellen in het bijzonder. Echter, ook omdat AAV3 vectoren transduceren normale menselijke hepatocyten efficiënt 2, zouden hun potentieel gebruik in kanker gentherapie toepassing in vivo worden negatief beïnvloed. Een mogelijke strategie om dit potentiële probleem te omzeilen bestaat transcriptionele-targeting van kankercellen door het identificeren van een genproduct dat selectief wordt geproduceerd door de tumor, maar niet door normale hepatocyten. Zo hebben eerdere studies aangetoond dat de serum niveaus van α-foetoproteïne (AFP) worden gebruikt als een specifieke marker voor het bijhouden van de aanwezigheid, progressie en / of herhaling van bepaalde soorten kanker van de lever, omdat de normale hepatocyten produceren in het algemeen zeer kleine hoeveelheden van dit eiwit. Inderdaad, hebben we gebruik gemaakt AAV3 vectoren die de AFP promotor transgen-expressie doel in leverkanker cellen, maar niet in normale hepatocyten 2, en studies zijn momenteel aan de gang om de effectiviteit van deze aanpak te testen in een muis xenograft model van leverkanker. In onze aanvullende onderzoeken, hebben we geconstateerd dat de transductie efficiëntie van de verschillende AAV vectoren serotype kan aanzienlijk worden versterkt door plaats-gerichte mutagenese van het oppervlak belicht tyrosine residuen in de virale capsiden 6-14. Sinds 6 van de 7 oppervlak blootgestelde tyrosines zijn ook geconserveerd in AAV3, hebben wij controlewerkzaamheden uitgevoerd plaats-gerichte mutagenese van deze residuen en merkte op dat de transductie efficiëntie van de tyrosine-mutant AAV3 vectoren aanzienlijk is verbeterd in menselijke lever kankercellen (ongepubliceerde gegevens). Studies zijn momenteel ook gewerkt aan de veiligheid en werkzaamheid van de tyrosine-mutant AAV3 vectoren in de muis xenotransplantaatmodellen voor menselijke Hepatoblastoma en hepatocellulair carcinoom te evalueren en indien succesvol, de optimale tyrosine-mutant AAV3 serotype vectoren kunnen blijken te zijn nuttig voor het richten van menselijke lever kanker voor de potentiële gentherapie.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-0170CM</td><td></td></tr><tr><td>PEI</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td>70664-3</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Q HP-kolom</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1154-01</td><td></td></tr><tr><td>Zalmzaad-DNA</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9753983</td><td></td></tr><tr><td>Iodixanol-gradiënt</td><td>OptiPrep</td><td>1114542</td><td></td></tr><tr><td>G-50 kolommen</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5330-01</td><td></td></tr></tbody></table>

high-efficiency transductie van leverkanker met behulp van recombinant adeno-geassocieerd virus serotype 3 vectoren

High-Efficiency Transduction of Liver Cancer Cells by Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 3 Vectors 

Recombinante vectoren gebaseerd op een niet-pathogene menselijke parvovirus, hebben de adeno-geassocieerd virus 2 (AAV2) ontwikkeld, en zijn momenteel in gebruik in een aantal klinische proeven van gentherapie. Meer recent hebben een aantal extra AAV serotypen ook geïsoleerd, waarvan is aangetoond dat selectieve weefsel tropisme vertonen in diverse kleine en grote diermodellen 1. Van de 10 meest gebruikte AAV serotypes, AAV3 is verreweg de minst efficiënte in transduceren cellen en weefsels in vitro als in vivo. Echter, in onze onlangs gepubliceerde studies, hebben we aangetoond dat AAV3 vectoren menselijke lever kanker transduceren - Hepatoblastoma (HB) en hepatocellulair carcinoom (HCC) - cellijnen zeer efficiënt, omdat AAV3 maakt gebruik van menselijke hepatocyt groeifactor receptor als een cellulaire co-receptor voor binding en opneming in deze cellen 2,3. In dit artikel beschrijven we de stappen die nodig zijn om een ​​hoog rendement transductie van menselijke lever kankercellen te bereiken door middel van recombinant AAV3 vectoren die een reportergen. Het gebruik van recombinant AAV3 vectoren die een therapeutisch gen kan uiteindelijk leiden tot de mogelijke gentherapie van lever kanker bij de mens.

In dit artikel beschrijven we de identificatie van het adeno-geassocieerd virus serotype 3 (AAV3) als de meest efficiënte vector voor het richten van de menselijke lever kankercellen.

High-Efficiency transductie van leverkanker met behulp van recombinant adeno-geassocieerd virus serotype 3 Vectoren

Er zijn recombinante vectoren ontwikkeld op basis van een niet-pathogeen humaan parvovirus, het adeno-geassocieerde virus 2 (AAV2), die momenteel worden gebruikt in een ...

Het algemene doel van deze procedure is het produceren van actieve adeno-geassocieerde virus serotype drie-vectoren die menselijke leverkankercellen efficiënt kunnen transduceren. Dit wordt bereikt door eerst drie verschillende plasmiden gelijktijdig in 2 9 3-cellen te transfecteren. De tweede stap van de procedure is het zuiveren van AAV drie-virionen die in 2 9 3-cellen zijn geassembleerd.De derde stap van de procedure is het bepalen van de titer van de gezuiverde AAV3-vectorvoorraad. De laatste stap van de procedure is het transduceren van menselijke leverkankercellen met behulp van gezuiverde AAV3-vectoren. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die via fluorescentiemicroscopie een sterke expressie van het EGFP-eiwit in menselijke leverkankercellen aantonen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is het bereiken van een hoge efficiëntie van gentransfer en -expressie in menselijke leverkankercellen. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de productie van AAV3-vectoren, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals de veelgebruikte AAV2-vectoren. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben vanwege de betrokkenheid van een aantal stappen die tedious kunnen zijn. De procedure zal worden gedemonstreerd door een biologisch wetenschapper uit ons laboratorium.De experimentele manipulaties in dit deel van het protocol worden 48 uur voor aanvang van deze procedure in een weefselkweekkast uitgevoerd. Zaai 10 weefselkweekschalen van 15 centimeter in met de humane embryonale niercellijn 2, 9 3, zodat de cellen op de dag van transfectie voor 70 tot 80% confluent zijn op de dag van transfectie. Gebruik de website www.Gebruik ge shae. com/calc om de hoeveelheid plasmide-DNA te berekenen die voor transfectie moet worden gebruikt. Zodra de juiste volumes plasmide-DNA zijn berekend, gaat u over tot de transfectie door een geschikt volume celkweekmedium zonder FBS en antibiotica in een steriele buis van 15 milliliter te pipetteren.Pipette vervolgens de benodigde volumes P helper, PACG twee, C3 en PDSA AAV C-B-E-G-F-P in het medium. Het totale volume moet 8.750 µL zijn voor 10 15 cm platen. Pipetteer 1.250 µL PEI in het medium dat het plasmide-DNA bevat. Vortex de DNA-PEI-oplossing enkele seconden en incubeer de DNA-PEI-oplossing vervolgens gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur om de vorming van DNA-PEI-complexen mogelijk te maken. Haal de 10 15 cm platen met HEK 293 cellen uit de weefselkweekincubator.Pipetteer vervolgens één µL DNAPEI-oplossing in elk van de plaatjes. Incubeer de plaatjes in een weefselkweekincubator bij 37 °C en 5% CO2 gedurende vier tot zes uur. Aspireer na vier tot zes uur voorzichtig het medium uit de plaatjes.Pipetteer vervolgens 25 milliliters compleet medium met 10%FBS in elke plaat. Incubeer de cellen bij 37 degrees Celsius en 5%carbon dioxide gedurende ongeveer 72 hours. Wanneer er 72 hours zijn verstreken, haal je de platen uit de incubator en plaats je ze terug in de weefselkweekkast.Schraap vervolgens met een celscraper de cellaag van de bodem van de plaat in het kweekmedium, zonder het medium uit de plaat te aspireren. Giet het medium met de cellen in een conische centrifugebuis van 250 milliliter. Herhaal deze procedure voor elk van de getransfecteerde platen, waarbij de inhoud van elke plaat in dezelfde conische centrifugebuis van 250 milliliter wordt gegoten.Centrifugeer de buis met de cellen en het medium in een gekoelde centrifuge bij 4 °C gedurende 10 minuten bij 3000 rpm. Gooi na centrifugatie het supernatant weg, pipetteer vervolgens 5 mL RB TMS-buffer op de pellet en resuspendeer deze. Overbreng de celoplossing naar een schone conische centrifugebuis van 15 mL.Plaats de buis van 15 milliliter in een bad van droogijs en ethanol om deze gedurende 10 minuten te bevriezen. Nadat de incubatietijd is verstreken, haal je de buis eruit en plaats je deze gedurende 10 minuten bij 37 degrees Celsius. Om te ontdooien, herhaal je deze vries-dooi-cyclus nog twee keer.Vortex de buis gedurende enkele seconden. Na elke ontdooiing na de laatste ontdooiperiode, pipetteert u één microliter 4,8 molair magnesiumchloride en twee microliters van 25 units per microliter. Voeg dit toe aan de celoplossing en vortex om te mengen.Incubeer vervolgens gedurende 40 minuten bij 37 °C. Plaats de buis in een gekoelde centrifuge bij 4 °C en centrifugeer 40 minuten bij 4.000 rpm. Bereid aan het einde van de centrifugatieperiode de IAL-gradiënt voor die voor de zuivering van het virus wordt gebruikt. Pipetteer hiervoor 2 mL 15%, 2 mL 25%, 1,5 mL 40% en 1,5 mL 60% IAL in een centrifugebuis van 13 mL met sluiting.Pipetteer na centrifugatie de S-supernatant uit de centrifugebuis, waarbij u erop let het celpellet niet te verstoren. Pipetteer de supernatant op de IAL-gradiënt en voeg vervolgens voldoende RB TMS-buffer aan de buis toe om deze volledig te vullen. Plaats de buis in een Beckman 90 TI-rotor en zorg ervoor dat de rotor correct is gebalanceerd. Centrifugeer gedurende één uur bij 75.000 toeren per minuut bij 16 °C.Na centrifugatie wordt de 40% IAL-fractie opgevangen door een spuit van vijf milliliter, voorzien van een naald van 18 gauge, in de IAL-gradiënt in te brengen bij de grens van 40 tot 60%. Aspireer voorzichtig met de spuit en verzamel de 40% IAL-fractie.Breng de 40%IAL-fractie vanuit de spuit over in een conische buis van 50 milliliter. Vul de buis vervolgens aan met buffer a tot een eindvolume van 40 milliliters. Zet de filtratieapparatuur op met een high trap Q HP-kolom volgens de instructies van de fabrikant.Was vervolgens de kolom met de volgende oplossingen: 25 milliliter buffer A, 25 milliliter buffer B, 50 milliliter buffer A, 40 milliliter van het bereide idal-virusmonster in buffer A, 50 milliliter buffer A en tot slot 20 milliliter buffer C. Verzamel buffer C in een Apollo-concentrator van 20 milliliter. Centrifugeer het monster vervolgens in een gekoelde centrifuge ingesteld op 4 °C gedurende 10 minuten bij 3000 toeren per minuut; gooi na centrifugatie de doorstroom weg.Voeg vervolgens 20 milliliters gekoelde PBS toe aan de Apollo-concentrator en centrifugeer opnieuw in een gekoelde centrifuge bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten bij 3000 toeren per minuut. Verwijder na centrifugatie opnieuw het doorstroomvolume. Pipetteer 500 microliters gekoelde PBS op het membraan om het virus van het membraan te resuspenderen. Pipetteer vervolgens aliquots van 10 microliter van de virale vector in siliconenbehandelde Eppendorf-buisjes en bewaar deze bij minus 80 graden Celsius tot gebruik. Ontdooi één van de aliquots van 10 microliter gezuiverd virus op ijs.Pipetteer 40 µL dubbel gedestilleerd water in de buis om het virus te verdunnen. Voeg vervolgens 0,2 µL van 25 units per µL Ben Nase toe en incubeer het mengsel gedurende één uur bij 37 °C. Pipetteer ondertussen 50 µL van 0,2 ng/µL plasmide-standaard in een schone eend orph-buis.Voeg na incubatie 50 µL 100 mM natriumhydroxide toe aan de buis met het virus. Meng dit goed en voeg het ook toe aan de buis met de plasmide-standaard. Incubeer beide buizen 30 minuten bij 65 °C.Nadat de 30 minuten zijn verstreken, moeten beide buisjes onmiddellijk gedurende ten minste vijf minuten op ijs worden gekoeld. Snijd vervolgens een stuk transfermembraan op dezelfde grootte als een stuk bio dot filterpapier. Plaats het transfermembraan en drie stukken bio filterpapier in een ondiepe tray.Vul de tray met 10x SSC en laat dit 20 minuten weken terwijl het membraan weekt. Stel het slot block SF-apparaat in volgens de instructies van de fabrikant. Sluit het apparaat aan op een vacuümkolf en pipetteer vervolgens 100 µL 10x SSC in elk van de slots die gevuld moeten worden met de verdunning van het virusmonster en de plasmide-standaard.Haal de buisjes uit de gekoelde centrifuge die op 4 °C is ingesteld na één minuut centrifugeren bij 13.000 rpm. Voeg vervolgens 100 µL 20× SSC en 1 µL 6× loading dye toe aan elk buisje. Pipetteer daarna nog eens 100 µL 10× SSC in elk buisje en breng 100 µL van elk monster aan in aangrenzende slots.Herhaal de verdunnings- en ladingsprocedure totdat het totale volume van elk monster in het slotblok-apparaat is geladen en verdere toevoegingen van 10x SSC, met een volume van 100 µL of minder, zijn voltooid. Zodra alle monsters door het membraan zijn gegaan, demonteert u het slotblok-apparaat en verwijdert u het membraan met een pincet. Let erop dat u het membraan bij de randen vasthoudt en plaats het membraan in de kamer van de inspector linker SL 1000 UV crosslinker.Select vervolgens energie-optimaal; het crosslinken moet ongeveer 30 seconden duren. Bereid nu de hybridisatie voor door één milliliter zalmsperma-DNA vijf minuten lang te koken. Na het koken gedurende vijf minuten moet het zalmsperma-DNA onmiddellijk gedurende ten minste vijf minuten op ijs worden afgekoeld.Bereid vervolgens de prehybridisatieoplossing voor volgens het beschreven protocol. Pipetteer 25 milliliter van de prehybridisatieoplossing met zalmsperm-DNA in een hybridisatiebuis. Breng het gecrosslinkte membraan voorzichtig over in de hybridisatiebuis en plaats vervolgens de dop op de buis, waarbij u er zeker van bent dat de prehybridisatieoplossing het membraan volledig bedekt.Incubeer in horizontale positie gedurende de nacht in een hybridisatiekamer bij 65 °C. Begin de volgende dag met de voorbereiding van de probe door 50 ng DNA-template in een eppendorfbuisje te pipetteren en 10 µL dubbel gedestilleerd water toe te voegen ter verdunning; kook het verdunde DNA vijf minuten lang en koel het daarna onmiddellijk gedurende ten minste vijf minuten op ijs. Centrifugeer de verdunde DNA-template bij 13.000 rpm gedurende één minuut bij kamertemperatuur.Werk vervolgens volgens de richtlijnen voor radioactiviteitsveiligheid van de instelling. Bereid de radioactieve probe voor door twee µL 10 mM DN TPS zonder DCTP en twee µL hexanucleotide toe te voegen. Meng één µL AU en vijf µL 32P-D-C-T-P en incubeer dit gedurende één uur bij 37 °C.Bereid de G 50-kolommen voor door deze twee minuten te centrifugeren bij 3000 toeren per minuut. Laad vervolgens de probe op de kolom en centrifugeer opnieuw gedurende twee minuten bij 3000 toeren per minuut en verzamel de doorstroomfractie. Op dit punt wordt de radioactiviteit van de doorstroomfractie gemeten volgens standaardprocedures om het aantal counts per minuut per milliliter van de probe te bepalen.Kook de probe vervolgens vijf minuten. Koel de probe daarna onmiddellijk vijf minuten op ijs af. De probe kan vervolgens worden gebruikt voor hybridisatie zonder het membraan te verwijderen.Pipetteer de probe met een concentratie van zes keer vijf counts per minuut per milliliter direct in de pre-hybridisatie-oplossing in de hybridisatiebuis. Incubeer de hybridisatiekamer overnacht bij 65 °C. Gooi de volgende dag de hybridisatieloplossing weg volgens de institutionele protocollen voor radioactiviteit, pipetteer 25 ml 2× SSC plus 0,1% SDS in de buis en was het membraan gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.Gooi de oplossing weg en pipetteer 25 milliliters van 0,1 keer SSC plus 0,1% SDS in de buis. Was het membraan gedurende 30 minuten bij 65 °C. Gooi na deze wasbeurt de oplossing weg en spoel het membraan kort af in 25 milliliters van 0,1 keer SSC bij kamertemperatuur.Wikkel het membraan in vershoudfolie en plaats het in een belichtingscassette in de donkere kamer. Plaats een stuk film bovenop het membraan en sluit de cassette om het tegen licht te beschermen. Plaats de belichtingscassette gedurende zes uur in de vriezer op -80 °C.Na zes uur wordt de film ontwikkeld en wordt de titer van de virusvoorraden bepaald door de dichtheid van de virusbanden te vergelijken met de banden van de plasmidstandaarden. Zodra de titer is bepaald, kan het virus worden gebruikt om cellen te transduceren; zaai eerst 1 × 10⁴ Hep 2 93 TT-cellen.Incubeer de cellen in elke put van een 96-wellplaat gedurende ten minste 18 uur in een incubator bij 37 °C en 5% CO2. Aspireer na de incubatie het medium uit elke put en pipetteer voorzichtig 50 µL medium zonder antibiotica en FBS in elke put. Aspireer dit medium en herhaal dit proces vervolgens om de cellen te wassen.Verdun de recombinante a a v vectoren in medium zonder FBS en antibiotica tot een uiteindelijke concentratie van 5 000 VGS per cel. Voeg 50 microliters van deze oplossing of 50 microliters medium zonder FBS als negatieve controle toe aan de putjes van de 96-wellsplaat en incubeer gedurende twee uur in een incubator bij 37 °C en 5% CO2. Verwijder na incubatie het virusbevattende medium en was de cellen twee keer zoals voorheen, met gebruik van 50 microliters compleet medium per putje.Nadat de laatste wasbeurt is weggegooid, voegt u 150 µL compleet medium toe aan elke put en incubeert u de plaat gedurende 72 uur in een incubator bij 37 °C en 5% CO2. Visualiseer ten slotte de EGFP-expressie met fluorescentiemicroscopie. De fluorescentie-intensiteit kan worden gekwantificeerd met Image J-software, waarbij de expressie van het transgen wordt beoordeeld als het totale oppervlak van groene fluorescentie per gezichtsveld.Hier wordt een voorbeeld getoond van een kwantitatieve DNA slot blot voor het bepalen van de titer van RAV3-vectoren. Dit membraan is geanalyseerd met een P 32 gelabelde EGFP-specifieke DNA-sonde. De bovenste rij van het blok bestaat uit tweevoudige verdunningen van gezuiverde virale stocks die zijn verteerd met Ben Nase.De middelste en onderste rij bestaan uit A-A-V-E-G-F-P standaarden, respectievelijk verdund vanuit één nanogram of 10 nanograms plasmide. De titer van de virale stocks wordt bepaald door vergelijking met de plasmide-standaarden. De getallen op de blot komen overeen met het aantal kopieën plasmide-DNA.Dit is een voorbeeld van transgene expressie gemedieerd door een recombinante AAV-vector. In een menselijke hepatoblastoomcellijn werden de cellen 72 uur na transductie gevisualiseerd met behulp van een fluorescentiemicroscoop. De eerste afbeelding illustreert de resultaten van een schijninfectie.De tweede afbeelding toont HEP 2 93 TT-cellen die zijn getransduceerd met 5, 000 VGS per cel van alle AAV two EGFP-vectoren bij 37 °C gedurende twee uur. De laatste afbeelding toont transductie met 5, 000 VGS per cel van R AAV three EEG FP onder dezelfde omstandigheden. Er is te zien dat RAAV three veel efficiënter is in het transduceren van dit celtype vergeleken met R AAV two.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van gentherapie, zoals de manier waarop menselijke leverkankercellen gericht kunnen worden aangepakt. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van menselijke leverkanker, omdat V three in staat is om therapeutische genen specifiek in menselijke leverkanker op een hoog niveau tot expressie te brengen.

high-efficiency-transduction-liver-cancer-cells-recombinant-adeno

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

RNA-interferentie (RNAi) beschikt over een groot aantal voordelen ten opzichte van gen knock-out en is in brede kring gebruikt als een instrument in gen functionele studies. De uitvinding van DNA-vector-gebaseerde RNAi-technologie heeft op lange termijn en induceerbaar gen knockdown mogelijk, en verhoogde ook de haalbaarheid van gene...

DNA vector-gebaseerde RNA-interferentie op genfunctie in Cancer Study

We beschrijven de lever neo-eilandje formatie in STZ (streptozotocine)-geïnduceerde diabetische muizen door genoverdracht van Neurogenin3 (Ngn3) en betacelluline (BTC) met behulp van helper-afhankelijke adenovirale vector (HDAd) en de omkering van hyperglycemie. Onze methode wordt voordelen van helper-afhankelijke adenovirale vectoren met hun zeer efficiënt in vivo transductie en langdurige genexpressie.

Neo-Islet Vorming in de lever van muizen met diabetes door Helper-afhankelijke adenovirale vector-gemedieerde genoverdracht

The video demonstrates locoregional delivery of oncolytic viruses through hepatic arterial injection as a therapeutic approach for hepatocellular carcinoma. These viruses selectively replicate in tumor cells, inducing cell lysis and releasing tumor cell-associated antigens. This process triggers immunogenic cell death, inducing an anti-tumor response.

Targeting Liver Tumors with Oncolytic Viruses via the Hepatic Artery

Oncolytische virotherapieën zijn in ontwikkeling als nieuwe therapieën voor de behandeling van hepatocellulair carcinoom (HCC). Hier beschrijven we een methode voor locoregionale therapie van HCC via hepatische arteriële toediening van oncolytisch virus.

Transarterial Toediening van Oncolytic Virussen voor Locoregionale Therapie van Orthotope HCC in Ratten

De recellulariseerde extracellulaire matrix van een decellulaire rattenlever kan worden gebruikt als een gehumaniseerd, driedimensionaal ex vivo model om de distributie en transgenexpressie van een virus of vireel vector te bestuderen.

Studie van virale vectoren in een drie-dimensionale lever Model herbevolkt met de menselijke hepatocellulair carcinoom cellijn HepG2

Hier presenteren we een protocol voor levende cellen beeldvorming van de signalering activiteit TGF-β/Smad3 met behulp van een adenovirus verslaggever systeem. Dit systeem transcriptionele activiteit in real time worden bijgehouden en kunnen worden toegepast op beide afzonderlijke cellen in vitro en in levende diermodellen.

Live cel beeldvorming van de TGF-β/Smad3 signalering traject In Vitro en In Vivo met behulp van een Adenovirus verslaggever systeem

Portale ader injectie van colorectale kanker (CRC) organoïden genereert stroma-rijke levermetastase. Dit muismodel van CRC-levermetastase vertegenwoordigt een nuttig hulpmiddel om tumor-stroma-interacties te bestuderen en nieuwe stroma-gerichte therapieën te ontwikkelen, zoals adeno-geassocieerde virus-gemedieerde gentherapieën.

Portale ader injectie van colorectale kanker organoïden om de levermetastase stroma te bestuderen

Recombinant adeno-geassocieerd virus (rAAV) wordt veel gebruikt voor klinische en preklinische genafgifte. Een ondergewaardeerd gebruik van rAAV's is de robuuste transductie van gekweekte cellen zonder dat zuivering nodig is. Voor onderzoekers die nieuw zijn op het gebied van rAAV, bieden we een protocol voor het klonen van transgencassettes, de productie van ruwe vectoren en de transductie van celculturen.

Transgenexpressie in gekweekte cellen met behulp van ongezuiverde recombinante adeno-geassocieerde virale vectoren

Hier wordt een op suspensie HEK293-cel gebaseerd AAV-productieprotocol gepresenteerd, wat resulteert in minder tijd en arbeid die nodig is voor vectorproductie met behulp van componenten die beschikbaar zijn voor onderzoeksdoeleinden van commerciële leveranciers.

Productie van Adeno-geassocieerde vectorbatches met hoog rendement met behulp van HEK293-suspensiecellen

Hier beschrijven we een geoptimaliseerd protocol voor laterale staartaderinjectie bij muizen om adeno-geassocieerd virus (AAV) systemisch toe te dienen bij volwassen muizen. Daarnaast beschrijven we protocollen van veelgebruikte assays om AAV-transductie te beoordelen.

Consistente toediening van adeno-geassocieerd virus via laterale staartaderinjectie bij volwassen muizen

Dit protocol beschrijft hoe intrasplentische injectie van AAV8-afgeleverd klein haarspeld-RNA dezelfde gen-knockdown-efficiëntie in de lever bereikt als injectie van de poortader, wat een eenvoudigere procedure vertegenwoordigt met veel lagere perioperatieve en postoperatieve mortaliteit en complicaties.

Efficiënte genknockdown in de lever via intrasplenische injectie van adeno-geassocieerd virus serotype 8 (AAV8)-afgeleverd klein haarspeld-RNA

Leer hoe u AAV3-vectoren produceert voor efficiënte transductie van humane leverkankercellen. Deze methode maakt hoogwaardige gentherapie mogelijk met fluorescente EGFP-expressie als marker.

High-Efficiency transductie van leverkanker met behulp van recombinant adeno-geassocieerd virus serotype 3 Vectoren

Meer video's verkennen