Name: Biomoleculaire Detectie gebruik de interferometrische reflectie Imaging Sensor (IRIS) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: Leer label-free biomoleculaire detectie met de Interferometric Reflectance Imaging Sensor (IRIS). Deze methode kwantificeert antilichaam-antigeen binding op siliciumdioxide oppervlakken met eenvoudige optische componenten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen Zoiray Technologies Inc, een co-sponsor en commercialisering partner, bedanken voor zijn steun.

1. Voorbereiding van de ondergrond <ol><li> Coat gelaagde silicium-SiO 2 substraten met self-adsorberende copoly (DMA-NAS-KAARTEN): <ol><li> Copolymeer synthese, chemische structuur, en coating proces zijn gepubliceerd in: G. Pirri, F. Damin, M. Chiari, E. Bontempi, LE Depero. Karakterisering van een polymeer Geadsorbeerd Coating voor DNA Microarray Glass dia's. Anal. Chem. 2004, 76, 1352-1358. </li><li> Kortom, voor te bereiden polymeeroplossing door het toevoegen van 100 mg van polymeer tot 5 ml gedeïoniseerd (DI) water en voeg 5 ml van 40% verzadigd ammoniumsulfaat ((NH 4) 2SO 4)-oplossing tot een uiteindelijke concentratie van 0,92 M. te bereiken </li><li> Dompel chips in oplossing gedurende 30 minuten op een shaker en daarna grondig afspoelen met DI-water. Droog ze grondig met Argon / N 2 gas. </li><li> Bak frites bij 80 ° C gedurende 15 minuten. </li></ol></li><li> Store polymeer gecoate substraten / chips in een droge omgeving (vacuüm exsiccator) voor maximaal 3 maanden tot probe spotten procedure. </li></ol> 2. Voorbereiding van de Probe Array: antilichamen, antigenen, ss / dsDNA, RNA, enz. <ol><li> Verdunnen sonde (s) aan de juiste concentratie in de gewenste buffer. Deze stap kan aanzienlijk worden variëren, maar een typisch experiment maakt gebruik van antigeen of IgG bij een concentratie van 0,5 mg / ml (bereik van 0,1 -1 mg / ml) in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bij pH ≈ 7,4. </li><li> Plaats oplossingen in een 96 - of 384-wells plaat (of standaard bron plaat voor de spotter gebruikt) </li><li> Setup spotten parameters voor de gewenste gekleurde array: bepalen van de juiste parameters voor het spotten van de oppervlakte en oplossingen worden gebruikt (dwell tijden, naderingssnelheden, etc.). Bepaal het aantal herhalingen van elke conditie per grid, de grid lay-out, het aantal repliceren netten, en de gewenste spotten locatie op de chip. Plaats substraten en de bron plaat op de juiste locaties, controleer dan of afval en aanbod flessen klaar voor zijn, en beginnen met afdrukken uit te voeren. </li><li> Na het spotten is afgewerkt plaats substraten in een vochtige omgeving 's nachts (4-18 uur) om immobilisatie en uitschakelen proces door te gaan. </li><li> Was ondergronden: plaats ze in de volgende oplossingen voor drie minuten voor drie afzonderlijke wasbeurten: PBS met 0,1% Tween (PBST), PBS, en tenslotte gedeïoniseerd (DI) water. Afhankelijk van het type van het experiment (nat vs droog), droog de chip met Argon gas en te beginnen incubatie of plaats de chip in een stromingskamer en te monteren. </li><li> Deactiveer de resterende NHS groepen aan copolymeer oppervlak door onderdompeling van de chips in een 50 mM oplossing van ethanolamine met de pH ingesteld op 7,4 gedurende 30 minuten tijdens een shaker plaat. Een primaire amine-bevattende verbinding, zoals hydroxylamine of Tris kan ook worden gebruikt, zolang de bereide oplossing is veilig te gebruiken met eiwitten. Spoel de deactivering oplossing met behulp van PBS dan DI-water. </li><li> Optionele stap (afhankelijk van de oppervlakte chemie wordt gebruikt): Block oppervlak met behulp van een oplossing van BSA, caseïne, of gerehydrateerd melk gedurende 30 minuten. Voor de huidige polymere oppervlakte chemie die we gebruiken, doen we niet uitvoeren van deze stap als het polymeerskelet daden om te voorkomen dat niet-specifieke eiwit binding. </li></ol> 3. Data Acquisition en Incubatiecentrum Procedure: Endpoint formaat <ol><li> Maak een oplossing van het doelwit van belang in de gewenste buffer. Hier zal het een oplossing van de juiste concentratie van anti-BSA in PBS (ex: maak 1-10 ml van een 10 ng / mL oplossing van Anti-BSA in PBS). Zorg er ook voor om een ​​equivalente hoeveelheid buffer (zonder doel) hebben voor de negatieve controle incubatie. </li><li> Neem een ​​silicium spiegel scan voor het normaliseren van alle verzamelde gegevens vervolgens. </li><li> Scan de voorbereide probe array met het IRIS-systeem voorafgaand aan de incubatie stap om de eerste optische hoogte (massa) op elke plek te bepalen. Dit zal zorgen voor een goede analyse van veranderingen in de massa aan de oppervlakte, dat wil zeggen het niveau van de binding, na de incubatie. Hier zal een paar parameters worden aangepast voor het huidige experiment, zoals de belichtingstijd, gezichtsveld, die gedijt scherpstellen, etc. </li><li> Dompel chip (s) in bereide oplossing voor 1 uur op een shaker plaat. De incubatietijd kan variëren aanzienlijk afhankelijk van het niveau van agitatie, de concentratie van de doelstelling wordt gedetecteerd, het transport eigenschappen van de stroming kamer (als een real-time detectie mode wordt gebruikt), de affiniteiten van de target-probe paar, enz. . </li><li> Na de incubatie, herhaal dan de procedure was zoals beschreven in stap 2.5) </li><li> Scan van dezelfde probe array met het IRIS-systeem en het verkrijgen van post-incubatie beelden voor pre-incubatie vergelijking. </li><li> Herhaal dit proces voor de verschillende incubatie stappen, indien nodig, bijvoorbeeld in een sandwich-test format waarbij een secundair antilichaam wordt gebruikt. </li></ol> 4. Data Analysis <ol><li> Passen de verzamelde beelden voor elk IRIS scan (volgorde van de intensiteit beelden), met behulp van de lab-ontwikkelde software om proDuce een beeld van de sonde array met optische dikte informatie. Een snelle kwalitatieve analyse van de binding kan worden uitgevoerd door het aftrekken van (aangetekende) post-en pre-incubatie beelden. Bindend zal verschijnen als een verandering in de intensiteit op die plekken waar de massa veranderingen waargenomen. Voor de kwantitatieve analyse, bepalen de massa dichtheden van elke plek ten opzichte van de achtergrond door het gemiddelde optische dikte informatie voor elke pixel in een plek en een ring buiten de plek en het maken van een directe vergelijking van deze twee gebieden. </li></ol> 5. Representatieve resultaten: Figuur 1 toont een voorbeeld schema van de gelaagde Si-SiO 2 IRIS substraat gespot met een vertegenwoordiger van antilichaam array. Elk antilichaam ensemble is gespot in repliceren met specificiteit voor een ander epitoop gericht is op verschillende eiwitten. Twee verschillende gehele virussen en een viraal eiwit worden vertegenwoordigd als voorbeeld doelen. Negatieve controle antilichamen zijn afhankelijk van de test en kan niet-specifieke en / of virus-specifiek zijn. Figuur 2 toont de binding van humaan serumalbumine (HSA)-specifieke antilichamen tegen een reeks van gevlekte HSA en konijnen-IgG (controle) vlekken. Zoals hier te zien, na montage en bepaling van de optische diktes voor de pre-en post-incubatie beelden, kan een verschil afbeelding voor de binding array gecreëerd om de kwalitatieve evaluatie van binding. Kwantitatieve analyse blijkt dat een 2,05 en 0,13 nanometer betekenen optische hoogte verandering werd waargenomen voor de HSA en het konijn IgG plekken respectievelijk, voor een anti-HSA incubatie concentratie van 500 ng / mL. Figuur 3 toont een IRIS-meting van Fur eiwitbinding afhankelijkheid van eiwit concentratie en dsDNA oligomeer lengte. De bovenste grafiek toont absolute optische hoogtemetingen voor de eerste geïmmobiliseerd oligomeer sonde hoogtes en post-incubatie Fur bindend. Toenemende concentraties van Fur (50, 100, 200 nM) resulteerde in een verhoogde binding aan DNA-sondes. De lengte van de oligomeren heeft ook invloed op Fur binding met een langere sequenties resulteert in meer bindend. Hier, error bars geven een standaarddeviatie van het gemiddelde. De onderste grafiek toont berekend Fur eiwit dimeer binding per dsDNA streng. Dimeer binding werd significant verhoogd bij een Fur eiwit concentratie van 200 nM wijst op een hoog niveau van niet-specifieke binding. <img src="/files/ftp_upload/2694/2694fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Schematische voorstelling van een voorbeeld probe-array die gewoonlijk worden gebruikt in een experiment om specifieke virussen en virale componenten op te sporen in een multiplexed mode met het IRIS-systeem. <img src="/files/ftp_upload/2694/2694fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Post-incubatie verschil de afbeelding voor een binding van humaan serum albumine-specifieke antilichamen tegen gespot HSA verzameld met dit label-free-systeem bij een concentratie van 500 ng / mL. Het biomateriaal massadichtheid voor elke plek wordt bepaald door het gemiddelde optische dikte van informatie binnen een plek en vervolgens deze te vergelijken met het gemiddelde van een ring rond de plek die de achtergrond. <img src="/files/ftp_upload/2694/2694fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Perceel van bindende gegevens voor Fur eiwit interacties met gevlekte double-stranded oligomeren met een bekende consensus sequentie op basis van oligomeer lengte, de locatie van de consensus sequentie binnen het oligomeer en Fur eiwitconcentratie. Informatie over de absolute hoeveelheid van de Fur-eiwit gebonden aan elke gespot volgorde (top) kan worden gebruikt om het aantal Fur dimeren gebonden aan elk type van oligomeer (onder) te schatten.

<ol><li>Özkumur, E., Needham, J. W., Bergstein, D. A., Gonzalez, R., Cabodi, M., Gershoni, J. M., Goldberg, B. B., Ünlö, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+and+dynamic+detection+of+biomolecular+interactions+for+high-throughput+microarray+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Label-free and dynamic detection of biomolecular interactions for high-throughput microarray applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 7988-7992 (2008).</li>
<li>Özkumur, E., Ahn, S., Yalcin, A., Lopez, C. A., Cevik, E., Irani, R. J., DeLisi, C., Chiari, M., Ünlö, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+microarray+imaging+for+direct+detection+of+DNA+hybridization+and+single-nucleotide+mismatches%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Label-free microarray imaging for direct detection of DNA hybridization and single-nucleotide mismatches.</a> Biosensors and Bioelectronics. 25, 1789-1795 (2010).</li>
<li>Özkumur, E., Lopez, C. A., Yalcin, A., Bergstein, D. A., Connor, J. H., Chiari, M., Ünlö, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+reflectance+imaging+for+a+multiplexed%2C+high-throughput%2C+label-free%2C+and+dynamic+biosensing+platform%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Journal+of+Selected+Topics+in+Quantum+Electronics%22%5BJournal%5D)">Spectral reflectance imaging for a multiplexed, high-throughput, label-free, and dynamic biosensing platform.</a> IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 16, 635-646 (2010).</li>
<li>Lopez, C. A., Daaboul, G. G., Vedula, R. S., Özkumur, E., Bergstein, D. A., Geisbert, T. W., Fawcett, H. E., Goldberg, B. B., Connor, J. H., Ünlö, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+multiplexed+virus+detection+using+spectral+reflectance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Label-free multiplexed virus detection using spectral reflectance imaging.</a> Biosensors and Bioelectronics. , (2011).</li>
</ol>

De IRIS-platform is een eenvoudige en snelle systeem te gebruiken voor het verzamelen van high-throughput binding data in een microarray formaat. Door het covalent immobiliseren verschillende functionele eiwit of DNA-probes op een oppervlak, target antigenen / biomarkers / etc. kunnen worden vastgelegd van de oplossing, net als in een immunoassay. Meting van deze interacties tussen probe omstandigheden in een eindpunt of real-time formaat met het IRIS-systeem zorgt voor zeer gevoelige en kwantitatieve informatie te worden verzameld voor elke interactie. De vertegenwoordiger experiment hier beschreven is slechts een voorbeeld van de types van interacties die kunnen worden bestudeerd met deze techniek. Detectie van transcriptiefactoren, virale antigenen, en hele virussen is eerder aangetoond en vertegenwoordigt slechts een paar voorbeelden van de soorten analyses die de IRIS gemakkelijk aankan.

<ol><li> Silicium wafers met 500 nm van thermisch gegroeid siliciumdioxide, Silicon Valley Microelectronics, custom order <li> Ammoniumsulfaat poeder, Sigma-Aldrich cat. # A5132 <li> Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) 10X klaar te concentreren, Fisher Scientific kat. # BP665-1 <li> Antilichaam tegen humaan serumalbumine (Anti-HSA), Sigma-Aldrich cat. # A0433 <li> Humaan serumalbumine (HSA), Sigma-Aldrich cat. # A9511 <li> Argon of stikstofgas (ultra-hoge zuiverheid), Airgas cat. # AR UHP300 of # NI UHP300 <li> Petrischalen, 60 mm x 15 mm, Fisher Scientific kat. # 0875713A <li> Scienceware ® vacuüm exsiccator, Sigma-Aldrich cat. # Z119016 <li> Reactievaatjes, Fisher Scientific kat. # 05-408-120 <li> 96-well platen, een laag cel-binding, Nalgene Nunc International kat. # 145399 <li> BioOdyssey Calligrapher MiniArrayer, Bio-Rad <li> Tween-20, Sigma-Aldrich # P1379 <li> Ethanolamine, Sigma-Aldrich # 398136 <li> Hydroxylamine, Thermo Scientific kat. # 26103 <li> Multi-purpose rotator, Thermo Scientific (Barnstead International), model # 2314, cat. # 2314Q <li> Retiga 2000R camera, QImaging kat. # 01-RET-2000R-FM-12 <li> AcuLED verlichting bron, PerkinElmer, custom order <li> Optische componenten (lenzen, doelstellingen, openingen, rails, palen, enz.), Thorlabs </ol>

biomoleculaire detectie gebruik de interferometrische reflectie imaging sensor (iris)

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor (IRIS)

De gevoelige meting van biomoleculaire interacties heeft het gebruik op vele terreinen en branches zoals de fundamentele biologie en microbiologie, milieu / landbouw / bescherming tegen biologische dreigingen monitoring, nanobiotechnologie, en nog veel meer. Voor diagnostische toepassingen, monitoring (het detecteren van) de aanwezigheid, afwezigheid, of abnormale expressie van gerichte proteomics of genomische biomarkers gevonden in patiënten monsters kunnen worden gebruikt om de behandeling benaderingen of therapie werkzaamheid vast te stellen. In het onderzoek arena, informatie over de moleculaire affiniteiten en specifieke kenmerken zijn nuttig voor het volledig karakteriseren van de systemen in onderzoek. Veel van de huidige systemen gebruikt om moleculaire concentraties of affiniteiten vast te stellen afhankelijk van het gebruik van labels. Voorbeelden van deze systemen zijn immunoassays, zoals het enzym-linked immunosorbent assay (ELISA), polymerase chain reaction (PCR) technieken, gelelektroforese testen, en massaspectrometrie (MS). Over het algemeen zijn deze labels zijn fluorescerende, radiologische of colorimetrische in de natuur en zijn direct of indirect aan de moleculaire doelwit van belang. Hoewel het gebruik van labels is algemeen aanvaard en heeft een aantal voordelen, zijn er nadelen die de ontwikkeling van nieuwe label-free methoden zijn stimulerend voor het meten van deze interacties. Deze nadelen zijn praktische facetten zoals verhoogde test kosten, reagens levensduur en bruikbaarheid, opslag en bezorgdheid over de veiligheid, verspilde tijd en moeite in de etikettering, en de variabiliteit tussen de verschillende reagentia te wijten aan de etikettering processen of labels zelf. Over een wetenschappelijk onderzoek basis, kan het gebruik van deze labels introduceren ook problemen, zoals problemen met effecten op eiwit-functionaliteit /-structuur door de aanwezigheid van de aangesloten labels en het onvermogen om rechtstreeks te meten van de interacties in real time. Hier wordt gepresenteerd is het gebruik van een nieuw label-free optische biosensor die vatbaar is voor studies microarray, de zogenoemde Interferometrische reflectie Imaging Sensor (IRIS), voor het opsporen van eiwitten, DNA, antigene materiaal, hele pathogenen (virionen) en andere biologisch materiaal. Het IRIS-systeem is aangetoond dat een hoge gevoeligheid, precisie en reproduceerbaarheid hebben voor verschillende biomoleculaire interacties [1-3]. Voordelen zijn onder andere multiplex imaging capaciteit, real-time en eindpunt meetmogelijkheden, en andere high-throughput attributen zoals verminderde reagensverbruik en een vermindering van de test tijden. Daarnaast is de IRIS-platform is eenvoudig te gebruiken, vereist goedkope apparatuur, en maakt gebruik van silicium gebaseerde vaste-fase-assay componenten waardoor zij aansluit bij veel hedendaagse oppervlakte chemie benaderingen. Hier presenteren we het gebruik van het IRIS-systeem van de voorbereiding van de sonde arrays voor incubatie en de meting van het doel de binding aan de analyse van de resultaten in een eindpunt formaat. Het model systeem zal de vangst van de beoogde antilichamen die specifiek zijn voor humaan serumalbumine (HSA) op de HSA-spotted substraten worden.

Kwantitatieve, high-throughput, real-time, en label-free biomoleculaire detectie (DNA, eiwitten, enz.) op SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Oppervlakken kunnen worden bereikt met behulp van een eenvoudige interferometrische techniek die is gebaseerd op LED-verlichting, minimale optische componenten, en een camera. De Interferometrische reflectie Imaging Sensor (IRIS) is goedkoop, eenvoudig te gebruiken, en vatbaar voor formats microarray.

Biomoleculaire Detectie gebruik de interferometrische reflectie Imaging Sensor (IRIS)

De gevoelige meting van biomoleculaire interacties vindt toepassing in vele vakgebieden en industrieën, zoals de basisbiologie en microbiologie, ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de binding van antilichamen aan oppervlakte-immobiliseerde antigenen te kwantificeren met een gevoelig en labelvrij detectieplatform genaamd Iris. Dit wordt bereikt door eerst een array van test- en controle-probes voor te bereiden op een chemisch gefunctionaliseerd, uniform siliciumdioxide-oppervlak om specifieke eiwitten uit een oplossing te vangen. De geïmmobiliseerde probes kunnen antilichamen of antigenen zijn, DNA of RNA, of elk ander type macromolecuul dat compatibel is met de gefunctionaliseerde, polymere of andere oppervlaktechemieën.De geprepareerde microarray wordt vervolgens geïncubeerd met een monster dat de eiwitten van belang bevat, waardoor binding kan plaatsvinden onder door de onderzoeker gespecificeerde omstandigheden. Vervolgens wordt de gehele sensorarray afgebeeld bij verschillende golflengten van licht. Bij het IRIS-systeem worden de gereflecteerde intensiteiten voor elke pixel verwerkt met op maat gemaakte algoritmen.Om de hoeveelheid biomateriaal te kwantificeren die aan elke test- of controleconditie is gebonden, worden resultaten na incubatie verkregen die effectieve detectie en absolute kwantificering van antilichamen in een complex mengsel tonen, gebaseerd op de interferometrische labelvrije metingen van dit systeem. Voortbouwend op meer dan een decennium aan onderzoek en ontwikkeling op het gebied van optische interferentie en harsen holte-apparaten, hebben we deze nieuwe methode ontwikkeld die veel van de storende problemen kan overwinnen die we zijn tegengekomen bij onze eerdere labelvrije biosensorsystemen. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de stappen voor gegevensverzameling de juiste normalisatie vereisen en de procedures voor kwaliteitscontrole moeten worden gevolgd om accurate en reproduceerbare gegevensverwerving te garanderen.Om de siliciumdioxide-substraten te coaten met zelfabsorberende copo dmma NAS-maps, wordt eerst de polymeeroplossing bereid door 100 milligrams polymeer toe te voegen aan vijf milliliters gedeïoniseerd water. Voeg vervolgens vijf milliliters 40% verzadigd ammoniumsulfaat toe voor een uiteindelijke ammoniumsulfaatconcentratie van 0,92 molar. Dompel de chips na incubatie gedurende 30 minuten in de polymeeroplossing op een schudmachine.Spoel de chips grondig af met gedeïoniseerd water, droog de chips met argon- of stikstofgas en bak ze vervolgens gedurende 15 minuten bij 80 °C. Bewaar de polymeergecoate substraatchips in een droge omgeving, zoals een vacuümexsiccator, tot maximaal twee tot drie maanden voordat de procedure voor het spotten van de probes wordt uitgevoerd om elke probe te verdunnen. Bepaal eerst het juiste volume van de probe-stockoplossing en buffer om de gewenste eindconcentratie te bereiken.Een typisch experiment maakt gebruik van antigeen of IgG in een concentratie van 0,5 mg/mL in fosfaatgebufferde zoutoplossing, waarbij de berekende hoeveelheid van elke probe-stockoplossing wordt toegevoegd aan kleine eppendorf-buisjes die de gewenste hoeveelheid PBS-buffer bevatten, waarna de oplossingen worden gemengd. Pipetteer vervolgens de probe-oplossingen in een 96-wells plaat met een lage proteïnebinding, die als bronplaat voor de spotter zal dienen. Stel vervolgens de spotting-parameters voor de geprinte array in door het aantal replicates van elke conditie per raster te bepalen.Het raster bepaalt het aantal replica-rasters en de gewenste spottinglocatie op de chip. Plaats het substraat en de bronplaat in de spotter en controleer vervolgens de afval- en voorraadflessen. Start de printronde.Nadat het spotten is voltooid, wordt het substraat een nacht in een omgeving met een hoge luchtvochtigheid geplaatst om het immobilisatie- en deactiveringsproces na de incubatie te laten verlopen. Was de substraten onder agitatie door de chip eerst drie keer afzonderlijk gedurende drie minuten in PBS met 0,1% tween. Volg dit op met drie incubaties van drie minuten in PBS en vervolgens in gedeïoniseerd water.Indien een droge meting wordt uitgevoerd, droog de chip dan grondig met argongas. Deactiveer de resterende NHS-groepen op het oppervlak van het copolymeer door de chips gedurende 30 minuten op de schudplaat onder te dompelen in een 50 millimolair ethanolamine-oplossing met een pH-waarde die is ingesteld op 7.4. Spoel de ethanolamine grondig af met PBS en vervolgens met gedeïoniseerd water vóór het begin van de incubatieprocedure.Bereid voor deze demonstratie een oplossing van het doeleitwit in PBS met de juiste concentratie. Er wordt 500 nanogram per milliliter anti-humaan serumalbumine gebruikt; voeg een gelijk volume buffer zonder doeleitwit toe voor de incubatie van de negatieve controle. Het irissysteem bestaat uit enkele basiscomponenten, zoals een lichtbron, optische componenten voor het correct verlichten van de sensorprobe-array, een camera voor het registreren van de intensiteit van het gereflecteerde licht en een tafel waarop het monster voor de metingen wordt geplaatst.Begin met een siliciumspiegelscan van een schone, onbehandelde siliciumchip om alle vervolgens verzamelde gegevens te normaliseren voordat de scan wordt uitgevoerd. Bereid het iris-systeem voor door de parameters voor het experiment aan te passen. Dit omvat het meten van het histogram van de lichtintensiteiten die door de camera worden geregistreerd en het instellen van de belichtingstijd voor optimale intensiteiten.Laad na de normalisatiescan de voorbereide probe-array in het IRIS-systeem en voer de setup uit zoals voorheen; stel de focus zo in dat het substraatoppervlak correct wordt afgebeeld. Controleer of de monsterhouder waterpas staat door de geregistreerde histogrammen van de gereflecteerde lichtintensiteiten te inspecteren. Kies tot slot een bestandsnaam om de gegevens onder op te slaan.Initialiseer de software om de array te scannen, waarbij het oppervlak herhaaldelijk bij verschillende golflengten wordt belicht en de verzamelde beelden worden gemiddeld. De initiële optische hoogte voor het referentiepunt wordt bepaald, wat een juiste analyse mogelijk maakt van massaveranderingen op het oppervlak na de incubatie. Na de initiële scan wordt de chip gedurende één uur op een schudplaat ondergedompeld in de bereide incubatieoplossing. De incubatietijd kan aanzienlijk variëren, afhankelijk van het niveau van vegetatie, de concentratie van het te detecteren doelwit en de affiniteiten van het doelwit-sondepaar.Herhaal na de incubatie de wasprocedure zoals eerder uitgevoerd. Scan dezelfde pro array met het iris-systeem om beelden na de incubatie te verkrijgen voor vergelijking met de beelden voor de incubatie. Dit proces kan indien nodig worden herhaald voor verschillende incubatiestappen.Bijvoorbeeld, in een sandwich-assay-formaat waarbij een secundair antilichaam wordt gebruikt, kunnen de verzamelde beelden van elke iris-scan met commercieel ontwikkelde software worden gefit om een beeld van de probe te verkrijgen die de vorming van optische dikte bevat. Een snelle kwalitatieve analyse van de binding kan worden uitgevoerd door de beelden na en vóór de incubatie van elkaar af te trekken. Binding zal zichtbaar zijn als een verandering in intensiteit op de plaatsen waar massa-veranderingen zijn waargenomen.Voor een kwantitatieve analyse wordt de massadichtheid van elke spot bepaald ten opzichte van de achtergrond door de optische dikte-informatie te middelen voor elke pixel binnen een spot en voor een annulus buiten de spot. Maak vervolgens een directe vergelijking tussen deze twee hier getoonde gebieden. Als voorbeeld: een schema van het gelaagde silicium- en siliciumdioxide-iris-substraat met een representatieve antilichaam-array.Elk antilichaamensemble wordt in replica gespot met specificiteit voor een ander epitoop, gericht op een ander eiwit. Twee verschillende complete virussen en een viraal eiwit zijn als voorbeeld weergegeven. Negatieve controle-antilichamen zijn afhankelijk van de assay en kunnen aspecifiek en/of virus-specifiek zijn.Hier is een voorbeeld van kwalitatieve resultaten voor de binding van antilichamen specifiek voor humaan serumalbumine aan een array van gespotte HSA- en konijn-IgG-controleplekken, zoals hier te zien is. Na het fitten en bepalen van de optische dikte voor de beelden vóór en na incubatie, kan een verschilbeeld voor de bindingsarray worden gemaakt om de binding snel te beoordelen. Een meer kwantitatieve analyse onthult dat er een gemiddelde verandering in optische hoogte van 2,05 en 0,13 nanometer werd waargenomen voor de HSA- en konijn-IgG-plekken respectievelijk bij een anti-HSA incubatieconcentratie van 500 nanogram per milliliter.Deze staafgrafiek geeft een voorbeeld van de kwantitatieve gegevens die iris-metingen kunnen leveren. In dit voorbeeld wordt de afhankelijkheid van de binding van fur-proteïne van de proteïneconcentratie en de lengte van het dubbelstrengs all-ligament gepresenteerd. Deze staafgrafiek toont de absolute optische hoogtemetingen voor de initiële hoogtes van de geïmmobiliseerde all-ligament prop en na incubatie voor binding.Het verhogen van de concentraties van Fur-eiwit naar 5, 100 en 200 nanomolar leidde tot een toename van de binding aan DNA-sondes. Hier wordt de berekende binding van het Fur-eiwit-dimeer per dubbelstrengs DNA-ligament weergegeven. De dimeerbinding was significant verhoogd bij een Fur-eiwitconcentratie van 200 nanomolar, wat wijst op een hoog niveau van aspecifieke interacties over het gehele ligament of een ander mechanisme voor de binding van het Fur-eiwit, zoals aggregatie van meerdere dimeren.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te beginnen met schone, uniforme substraten met de juiste oxidelaagdikte en om de monsters schoon te houden door ze voorzichtig met een pincet te hanteren. Het is daarnaast cruciaal om reagentia te gebruiken die correct zijn bewaard en waarvan bekend is dat ze functioneel zijn. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe biomoleculaire interacties in een labelvrij formaat gemeten kunnen worden via de preparatie van functionele probe-arrays op een siliciumdioxide-oppervlak, evenals de data-acquisitie en -analyse met behulp van de interferometric reflectance imaging sensor of iris.

biomolecular-detection-employing-interferometric-reflectance-imaging

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

In dit artikel beschrijven we hoe we krijgen FRET sporen van individuele DNA-moleculen geïmmobiliseerd op een oppervlak met behulp van een geautomatiseerde scanning confocale microscoop.

Geautomatiseerd systeem voor Single Molecule Fluorescentie metingen van Surface-geïmmobiliseerde biomoleculen

Deze video laat zien experimenten met daarop volgende analyse van eiwit-eiwit interacties door het gebruik van micro-oppervlakken met een patroon. De aanpak biedt de mogelijkheid om eiwit interacties op te sporen in levende cellen en combineert een hoge doorvoer-mogelijkheden met de mogelijkheid te extraheren kwantitatieve informatie.

In-vivo detectie van eiwit-eiwit interacties op de Micro-oppervlakken met een patroon

In this video, we demonstrate biolayer interferometry (BLI) technology to detect the intermolecular interactions between ligands and target analytes in real-time. BLI measures changes in the interference pattern of white light reflected off a layer of immobilized ligands on a biosensor surface as they interact with analytes in solution.

Biolayer Interferometry Technology to Detect Interactions between Ligand and Analyte

We presenteren een protocol voor de toepassing van interferometrische Photoactivated Localization Microscopy (iPALM), een 3-dimensionale single-molecule lokalisatie super resolutie microscopie methode, aan de beeldvorming van het actine cytoskelet in hechtende zoogdiercellen. Deze aanpak maakt het mogelijk op basis van licht visualisatie van nanoschaal structurele kenmerken die anders onopgelost zouden blijven door middel van conventionele diffractie beperkt optische microscopie.

Driedimensionale Super resolutie microscopie van de F-actine filamenten door interferometrische Photoactivated Localization Microscopy (iPALM)

Hier presenteren we een protocol voor het controleren van de montage en demontage van de toxine van de bloedzweer met behulp van biolayer interferometrie (BLI). Na montage/demontage op de biosensor oppervlak, de grote eiwitcomplexen worden vrijgegeven uit het oppervlak voor visualisatie en identificatie van onderdelen van de complexen met behulp van elektronenmicroscopie en massaspectrometrie, respectievelijk.

Analyseren van de dynamische eiwitcomplexen op gemonteerd en vrijgelaten uit Biolayer interferometrie Biosensor met behulp van spectrometrie van de massa en elektronenmicroscopie

Dit protocol is een leidraad voor het implementeren van interferentie reflectie microscopie op een standaard fluorescentiemicroscoop voor etiket-vrije, hoog-contrast, High-Speed beeldvorming van microtubuli met behulp van in vitro oppervlakken assays.

Implementatie van interferentie reflectie microscopie voor etiket vrije, High-Speed beeldvorming van microtubuli

We presenteren een protocol voor het implementeren van interferentie-reflectiemicroscopie en totaal-interne-reflectie-fluorescentiemicroscopie voor de gelijktijdige beeldvorming van dynamische microtubuli en fluorescerend gelabelde microtubuli-geassocieerde eiwitten.

Gelijktijdige interferentiereflectie en totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie voor beeldvorming van dynamische microtubuli en bijbehorende eiwitten

Dit artikel beschrijft het gebruik van een nieuwe, snelle optische imager voor de macroscopische fotoluminescentie lifetime imaging van monsters die lang verval uitzenden. De integratie-, beeldacquisitie- en analyseprocedures worden beschreven, samen met de voorbereiding en karakterisering van de sensormaterialen voor de beeldvorming en de toepassing van de imager bij het bestuderen van biologische monsters.

Fluorescentie Lifetime Macro Imager voor biomedische toepassingen

Dit artikel beschrijft een protocol voor het bestuderen van DNA-eiwitinteracties met behulp van een op streptavidine gebaseerd biolaaginterferometrie (BLI) systeem. Het schetst de essentiële stappen en overwegingen voor het gebruik van basis- of geavanceerde bindingskinetiek om de evenwichtsbindingsaffiniteit (KD) van de interactie te bepalen.

Analyse van DNA-eiwitinteracties met op streptavidine gebaseerde biolaaginterferometrie

Hier presenteren we een protocol dat gebruik maakt van optische fotothermische infrarood-fluorescentie in situ hybridisatie (OPTIR-FISH), ook bekend als mid-infrarood fototherme-FISH (MIP-FISH), om individuele cellen te identificeren en hun metabolisme te begrijpen. Deze methodologie kan breed worden toegepast voor diverse toepassingen, waaronder het in kaart brengen van het cellulaire metabolisme met een resolutie van één cel.

Optische fotothermische infrarood-fluorescentie in situ hybridisatie (OPTIR-FISH)

Leer label-free biomoleculaire detectie met de Interferometric Reflectance Imaging Sensor (IRIS). Deze methode kwantificeert antilichaam-antigeen binding op siliciumdioxide oppervlakken met eenvoudige optische componenten.

Biomoleculaire Detectie gebruik de interferometrische reflectie Imaging Sensor (IRIS)

Meer video's verkennen