Biomoleculaire Detectie gebruik de interferometrische reflectie Imaging Sensor (IRIS)

Het algemene doel van het volgende experiment is om de binding van antilichamen aan oppervlakte-immobiliseerde antigenen te kwantificeren met een gevoelig en labelvrij detectieplatform genaamd Iris. Dit wordt bereikt door eerst een array van test- en controle-probes voor te bereiden op een chemisch gefunctionaliseerd, uniform siliciumdioxide-oppervlak om specifieke eiwitten uit een oplossing te vangen. De geïmmobiliseerde probes kunnen antilichamen of antigenen zijn, DNA of RNA, of elk ander type macromolecuul dat compatibel is met de gefunctionaliseerde, polymere of andere oppervlaktechemieën.

De geprepareerde microarray wordt vervolgens geïncubeerd met een monster dat de eiwitten van belang bevat, waardoor binding kan plaatsvinden onder door de onderzoeker gespecificeerde omstandigheden. Vervolgens wordt de gehele sensorarray afgebeeld bij verschillende golflengten van licht. Bij het IRIS-systeem worden de gereflecteerde intensiteiten voor elke pixel verwerkt met op maat gemaakte algoritmen.

Om de hoeveelheid biomateriaal te kwantificeren die aan elke test- of controleconditie is gebonden, worden resultaten na incubatie verkregen die effectieve detectie en absolute kwantificering van antilichamen in een complex mengsel tonen, gebaseerd op de interferometrische labelvrije metingen van dit systeem. Voortbouwend op meer dan een decennium aan onderzoek en ontwikkeling op het gebied van optische interferentie en harsen holte-apparaten, hebben we deze nieuwe methode ontwikkeld die veel van de storende problemen kan overwinnen die we zijn tegengekomen bij onze eerdere labelvrije biosensorsystemen. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de stappen voor gegevensverzameling de juiste normalisatie vereisen en de procedures voor kwaliteitscontrole moeten worden gevolgd om accurate en reproduceerbare gegevensverwerving te garanderen.

Om de siliciumdioxide-substraten te coaten met zelfabsorberende copo dmma NAS-maps, wordt eerst de polymeeroplossing bereid door 100 milligrams polymeer toe te voegen aan vijf milliliters gedeïoniseerd water. Voeg vervolgens vijf milliliters 40% verzadigd ammoniumsulfaat toe voor een uiteindelijke ammoniumsulfaatconcentratie van 0,92 molar. Dompel de chips na incubatie gedurende 30 minuten in de polymeeroplossing op een schudmachine.

Spoel de chips grondig af met gedeïoniseerd water, droog de chips met argon- of stikstofgas en bak ze vervolgens gedurende 15 minuten bij 80 °C. Bewaar de polymeergecoate substraatchips in een droge omgeving, zoals een vacuümexsiccator, tot maximaal twee tot drie maanden voordat de procedure voor het spotten van de probes wordt uitgevoerd om elke probe te verdunnen. Bepaal eerst het juiste volume van de probe-stockoplossing en buffer om de gewenste eindconcentratie te bereiken.

Een typisch experiment maakt gebruik van antigeen of IgG in een concentratie van 0,5 mg/mL in fosfaatgebufferde zoutoplossing, waarbij de berekende hoeveelheid van elke probe-stockoplossing wordt toegevoegd aan kleine eppendorf-buisjes die de gewenste hoeveelheid PBS-buffer bevatten, waarna de oplossingen worden gemengd. Pipetteer vervolgens de probe-oplossingen in een 96-wells plaat met een lage proteïnebinding, die als bronplaat voor de spotter zal dienen. Stel vervolgens de spotting-parameters voor de geprinte array in door het aantal replicates van elke conditie per raster te bepalen.

Het raster bepaalt het aantal replica-rasters en de gewenste spottinglocatie op de chip. Plaats het substraat en de bronplaat in de spotter en controleer vervolgens de afval- en voorraadflessen. Start de printronde.

Nadat het spotten is voltooid, wordt het substraat een nacht in een omgeving met een hoge luchtvochtigheid geplaatst om het immobilisatie- en deactiveringsproces na de incubatie te laten verlopen. Was de substraten onder agitatie door de chip eerst drie keer afzonderlijk gedurende drie minuten in PBS met 0,1% tween. Volg dit op met drie incubaties van drie minuten in PBS en vervolgens in gedeïoniseerd water.

Indien een droge meting wordt uitgevoerd, droog de chip dan grondig met argongas. Deactiveer de resterende NHS-groepen op het oppervlak van het copolymeer door de chips gedurende 30 minuten op de schudplaat onder te dompelen in een 50 millimolair ethanolamine-oplossing met een pH-waarde die is ingesteld op 7.4. Spoel de ethanolamine grondig af met PBS en vervolgens met gedeïoniseerd water vóór het begin van de incubatieprocedure.

Bereid voor deze demonstratie een oplossing van het doeleitwit in PBS met de juiste concentratie. Er wordt 500 nanogram per milliliter anti-humaan serumalbumine gebruikt; voeg een gelijk volume buffer zonder doeleitwit toe voor de incubatie van de negatieve controle. Het irissysteem bestaat uit enkele basiscomponenten, zoals een lichtbron, optische componenten voor het correct verlichten van de sensorprobe-array, een camera voor het registreren van de intensiteit van het gereflecteerde licht en een tafel waarop het monster voor de metingen wordt geplaatst.

Begin met een siliciumspiegelscan van een schone, onbehandelde siliciumchip om alle vervolgens verzamelde gegevens te normaliseren voordat de scan wordt uitgevoerd. Bereid het iris-systeem voor door de parameters voor het experiment aan te passen. Dit omvat het meten van het histogram van de lichtintensiteiten die door de camera worden geregistreerd en het instellen van de belichtingstijd voor optimale intensiteiten.

Laad na de normalisatiescan de voorbereide probe-array in het IRIS-systeem en voer de setup uit zoals voorheen; stel de focus zo in dat het substraatoppervlak correct wordt afgebeeld. Controleer of de monsterhouder waterpas staat door de geregistreerde histogrammen van de gereflecteerde lichtintensiteiten te inspecteren. Kies tot slot een bestandsnaam om de gegevens onder op te slaan.

Initialiseer de software om de array te scannen, waarbij het oppervlak herhaaldelijk bij verschillende golflengten wordt belicht en de verzamelde beelden worden gemiddeld. De initiële optische hoogte voor het referentiepunt wordt bepaald, wat een juiste analyse mogelijk maakt van massaveranderingen op het oppervlak na de incubatie. Na de initiële scan wordt de chip gedurende één uur op een schudplaat ondergedompeld in de bereide incubatieoplossing. De incubatietijd kan aanzienlijk variëren, afhankelijk van het niveau van vegetatie, de concentratie van het te detecteren doelwit en de affiniteiten van het doelwit-sondepaar.

Herhaal na de incubatie de wasprocedure zoals eerder uitgevoerd. Scan dezelfde pro array met het iris-systeem om beelden na de incubatie te verkrijgen voor vergelijking met de beelden voor de incubatie. Dit proces kan indien nodig worden herhaald voor verschillende incubatiestappen.

Bijvoorbeeld, in een sandwich-assay-formaat waarbij een secundair antilichaam wordt gebruikt, kunnen de verzamelde beelden van elke iris-scan met commercieel ontwikkelde software worden gefit om een beeld van de probe te verkrijgen die de vorming van optische dikte bevat. Een snelle kwalitatieve analyse van de binding kan worden uitgevoerd door de beelden na en vóór de incubatie van elkaar af te trekken. Binding zal zichtbaar zijn als een verandering in intensiteit op de plaatsen waar massa-veranderingen zijn waargenomen.

Voor een kwantitatieve analyse wordt de massadichtheid van elke spot bepaald ten opzichte van de achtergrond door de optische dikte-informatie te middelen voor elke pixel binnen een spot en voor een annulus buiten de spot. Maak vervolgens een directe vergelijking tussen deze twee hier getoonde gebieden. Als voorbeeld: een schema van het gelaagde silicium- en siliciumdioxide-iris-substraat met een representatieve antilichaam-array.

Elk antilichaamensemble wordt in replica gespot met specificiteit voor een ander epitoop, gericht op een ander eiwit. Twee verschillende complete virussen en een viraal eiwit zijn als voorbeeld weergegeven. Negatieve controle-antilichamen zijn afhankelijk van de assay en kunnen aspecifiek en/of virus-specifiek zijn.

Hier is een voorbeeld van kwalitatieve resultaten voor de binding van antilichamen specifiek voor humaan serumalbumine aan een array van gespotte HSA- en konijn-IgG-controleplekken, zoals hier te zien is. Na het fitten en bepalen van de optische dikte voor de beelden vóór en na incubatie, kan een verschilbeeld voor de bindingsarray worden gemaakt om de binding snel te beoordelen. Een meer kwantitatieve analyse onthult dat er een gemiddelde verandering in optische hoogte van 2,05 en 0,13 nanometer werd waargenomen voor de HSA- en konijn-IgG-plekken respectievelijk bij een anti-HSA incubatieconcentratie van 500 nanogram per milliliter.

Deze staafgrafiek geeft een voorbeeld van de kwantitatieve gegevens die iris-metingen kunnen leveren. In dit voorbeeld wordt de afhankelijkheid van de binding van fur-proteïne van de proteïneconcentratie en de lengte van het dubbelstrengs all-ligament gepresenteerd. Deze staafgrafiek toont de absolute optische hoogtemetingen voor de initiële hoogtes van de geïmmobiliseerde all-ligament prop en na incubatie voor binding.

Het verhogen van de concentraties van Fur-eiwit naar 5, 100 en 200 nanomolar leidde tot een toename van de binding aan DNA-sondes. Hier wordt de berekende binding van het Fur-eiwit-dimeer per dubbelstrengs DNA-ligament weergegeven. De dimeerbinding was significant verhoogd bij een Fur-eiwitconcentratie van 200 nanomolar, wat wijst op een hoog niveau van aspecifieke interacties over het gehele ligament of een ander mechanisme voor de binding van het Fur-eiwit, zoals aggregatie van meerdere dimeren.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te beginnen met schone, uniforme substraten met de juiste oxidelaagdikte en om de monsters schoon te houden door ze voorzichtig met een pincet te hanteren. Het is daarnaast cruciaal om reagentia te gebruiken die correct zijn bewaard en waarvan bekend is dat ze functioneel zijn. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe biomoleculaire interacties in een labelvrij formaat gemeten kunnen worden via de preparatie van functionele probe-arrays op een siliciumdioxide-oppervlak, evenals de data-acquisitie en -analyse met behulp van de interferometric reflectance imaging sensor of iris.