Visualisatie van MG53-gemedieerde celmembraan Reparatie gebruik In vivo En In vitro Systemen

Het algemene doel van deze procedure is om de capaciteit voor membraanherstel te beoordelen in zowel het dier als in geïsoleerde cellen. Geïsoleerde skeletspiervezels worden verzameld en omringd door medium dat FM 1 43-kleurstof bevat. Vervolgens wordt een UV-laser gebruikt om een deel van het celmembraan te bestralen en te beschadigen, zodat de kleurstof de cel kan binnendringen.

Geïsoleerde cellen worden getransfecteerd met plasmagedna dat GFP MG 53 tot expressie brengt, welke zal lokaliseren in het plasmamembraan en het cytosol van de cel. Vervolgens wordt de punt van een micro-elektrode in het C two C 12-membraan ingebracht om schade te induceren. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de translocatie van GFP MG 53 naar de plaats van de beschadiging aantonen.

Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien er specifieke vaardigheden vereist zijn om de technieken voor micro-elektrodepenetratie en isolatie van spiervezels te beheersen. De procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. Lin, onze labmanager, Dr. Wazu, een postdoc-onderzoeker, Matt Orange, een promovendus, en Dr. Shaza, een research assistant professor in onze afdeling. Plaats bij aanvang een dienblad of een blauwe laboratoriummat onder de loopband om afval van de dieren tijdens het experiment op te vangen.

Stel vervolgens de hoek van het loopbandoppervlak in. Sommige loopbanden hebben een geïntegreerd apparaat om de helling aan te passen, terwijl bij andere de loopband op een andere manier moet worden verhoogd. Over het algemeen wordt een vlak oppervlak of een hoek tussen 7 en 15 graden bergafwaarts of bergafwaarts gebruikt.

Acclimatiseer de muizen door ze op de loopband te plaatsen met het elektrische rooster uitgeschakeld en de aandrijfmotor van de band aan, maar zonder beweging gedurende 15 minuten; schakel na de acclimatisatieperiode het motiverende elektrische rooster in. Start de loopband met een beginsnelheid van ongeveer vijf meter per minuut. Verhoog de snelheid elke minuut met één tot twee meter per minuut en gun het dier een warming-up periode van vijf minuten.

Herhaal deze warming-up periode elke dag gedurende drie tot 10 dagen om de compliantie tijdens het testen te verhogen. Om een acute uitputtingsinspanning uit te voeren, wordt de snelheid van de loopband in de loop van de tijd verhoogd tot een maximale snelheid is bereikt, waarbij gelet wordt op tekenen van uitputting.

Een dier wordt als uitgeput beschouwd wanneer het meer dan de helft van de tijd van de loopband af is of vijf opeenvolgende seconden op het rooster doorbrengt. Verwijder de uitgeputte muis en noteer de totale looptijd. Uithoudingstraining.

Runningprotocollen beginnen met dezelfde opwarmprocedure. De maximale snelheid is echter over het algemeen lager en de looptijden kunnen vrij lang zijn. Plaats de muizen na de test terug in hun thuiskooi en maak de loopband schoon met 70%ethanol.

Isoleer de oppervlakkige laag van de musculus flexor digitorum brevis uit de voet voor verdere analyse. Snijd eerst de huid van de zool langs de mediane lijn, waarbij u er zorg voor draagt dat de onderliggende spier niet beschadigd raakt. Maak vervolgens horizontale sneden en verwijder de huid.

Identificeer de platte, witte pees van de FDB-spier die is vastgehecht aan het hielbeen (calcaneus). Gebruik een pincet om de pees te scheiden en snijd deze vervolgens door vlakbij de aanhechtingsplaats. Trek de pees voorzichtig omhoog terwijl u eventueel bindweefsel wegsnijdt.

Bepaal waar de distale pezen vertakken naar de individuele digits. Snijd de pezen door waar ze verbonden zijn met de diepere spierlaag en verwijder de FDB. Plaats het FDB-spierbundel in één milliliter collagenase-oplossing, voorverwarmd tot 37 °C.

Plak de buis horizontaal op een orbitale schudkerf van 37 °C en schud gedurende 65 minuten bij 200 RPM. Voldoende digestie wordt gekenmerkt door een troebelig uiterlijk en een bleke kleur. Knip het uiteinde van een pipetteertip van 1 mL af zodat het gedigesteerde bundeltje erdoorheen kan passeren.

Breng het bundeltje eenvoudig over in een centrifugebuis die ongeveer 600 µL 2.5. Calcium tyro bevat. Keer de buis voorzichtig om om de losse vezels van het bundeltje te schudden.

Snijd vervolgens het uiteinde van een 30 µL pipetpunt af, zodat de diameter slechts iets kleiner is dan de spierbundel. Gebruik deze punt om de bundel in de pipet op te zuigen en duw deze vervolgens terug in de oplossing. Herhaal dit proces totdat het grootste deel van de vezels is losgekoppeld van de bundel.

Meng de gedissocieerde vezels door de buis voorzichtig te draaien. Neem de gewenste hoeveelheid af en breng deze over op een delta T-schijf met glazen bodem. Bewaar de overgebleven vezels gedurende ongeveer zes uur bij vier graden Celsius voor gebruik in aanvullende studies.

Laat de schaal vijf minuten ongestoord staan. Hierdoor kunnen de vezels zich hechten aan de glazen bodem van de schaal. Plaats de schaal met glazen bodem op een confocale microscoop die is uitgerust met een UV-laser.

Observeer de vezels onder een fas contrastmicroscoop bij een vergroting van meer dan 100x om de aanwezigheid van een normaal striatiepatroon en een rechte, staafvormige structuur te controleren. Voeg FM 1 43 of FM 4 64 styro perineum-kleurstoffen toe aan de oplossing tot een eindconcentratie van 2,5 micromolar. Positioneer de vezel in een hoek van 45 graden, van linksboven naar rechtsonder in het gezichtsveld, om schade te induceren.

Bestraal een gebied van vijf bij vijf pixels van het plasmamembraan. Met een UV-laser ingesteld op maximaal vermogen gedurende vijf seconden moet de bestraalde regio het plasmamembraan splitsen, waarbij de helft van het vak van vijf bij vijf binnen de vezel moet liggen en de rest buiten de vezel. Leg beelden vast van de instroom van kleurstof in de vezel met intervallen van vijf seconden gedurende maximaal vijf minuten. Er mogen slechts drie vezels per schaal worden bestraald, aangezien de fluorescerende kleurstof uiteindelijk via endocytose in de vezel terecht zal komen, wat de data-analyse kan bemoeilijken.

Nadat drie vezels zijn gebruikt, dient er een nieuwe kweekschaal te worden voorbereid. Bereken met behulp van analyse-software de verandering in fluorescentie-intensiteit in een gebied van ongeveer 200 vierkante micron voor vergelijking tussen de vezels. Voor elk frame moet de volgende berekening worden uitgevoerd: delta F gedeeld door F nul, waarbij F nul de gemiddelde fluorescentie is van het region of interest in het eerste vastgelegde frame en delta F de verandering van de fluorescentie is in elk daaropvolgend frame.

Gebruik standaardmethoden om cellen te transfecteren met plasmide-DNA dat GFP MG 53 tot expressie brengt. Bereid vervolgens de micropipetten voor. Plaats een Pyrex-capillair op een micropipet.

Trek en vorm de pipet volgens het vooraf ingestelde programma. Bevestig de micropipet aan een driassige micromanipulator in de kweek. Verwijder het medium uit de delta T-schaal en vervang dit door 2,5 millimolair calcium tyro-buffer.

Plaats de schaal met getransfecteerde cellen op een laser-scanning confocale microscoop met een 40 x 1,3 NA olie-immersieobjectief. Induceer acute schade aan de levende cel door de micropipet in het celmembraan in te brengen en deze vervolgens snel uit de cel terug te trekken. Verzamel opeenvolgende beelden van de levende cel met een interval van 1,54 seconden per frame voor de troponine-geïnduceerde membraanruptuur.

PERFUSEER 0,005% troponine met een snelheid van ongeveer één milliliter per minuut direct boven de cel die wordt afgebeeld. De loopband kan worden gebruikt om een vermindering van het loopvermogen te meten. De MG 53-knockoutmuizen die hier worden getoond, hebben een verminderd loopvermogen als gevolg van schade aan de skeletspieren.

De omvang van de schade veroorzaakt door de UV-laser hangt af van het membraanherstelvermogen van de geobserveerde vezel. Hier is een vezel voorafgaand aan de beschadiging bij een normale muis. Dit beeld is 200 seconden later vastgelegd en toont een lichte beschadiging.

Een spiervezel afgeleid van MG 53 knockout-muizen met een aangetaste capaciteit voor membraanherstel zal een significantere kleurstofinstroom vertonen na een zichtbare beschadiging. Hier is een voorbeeld van een onbeschadigde GFP MG 53-getransfecteerde C2C12-myotube. De pijl in deze afbeelding wijst naar GFP MG 53-bevattende blaasjes die zich naar de plaatsen van beschadiging bewegen.

In dit voorbeeld werd saponine gebruikt om het plasmamembraan te beschadigen. Let op de translocatie van GFP MG 53 van het cytosol naar het celmembraan na beschadiging. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om kwalitatief goede spiervezels te isoleren met gladde saralmembranen en duidelijke dwarsstreeppatronen.

Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht in hoe u de membraanherstelcapaciteit van spieren kunt beoordelen en hoe u de cellen kunt kweken.