Name: Versterken en kwantificeren van HIV-1 RNA in HIV-geïnfecteerde personen met een viral load onder de limiet van de Opsporing van Standard Clinical Assays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 58 s
Description: Leer HIV-1 RNA kwantificeren en enkelvoudige genoomsequentie uitvoeren bij lage virale ladingen met real-time PCR. Deze methode detecteert tot 0,3 kopieën/ml en ondersteunt virologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen de patiënten die deelnamen aan de vele studies van HIV-1 te erkennen. JMC was een Research Professor van de American Cancer Society met de steun van de FM-Kirby Foundation.

<ol><li>Amara, R. R., Villinger, F., Altman, J. D., Lydy, S. L., O'Neil, S. P., Staprans, S. I., Montefiori, D. C., Xu, Y., Herndon, J. G., Wyatt, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+a+mucosal+challenge+and+prevention+of+AIDS+by+a+multiprotein+DNA%2FMVA+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Control of a mucosal challenge and prevention of AIDS by a multiprotein DNA/MVA vaccine.</a> Vaccine. 20, 1949-1955 (2002).</li>
<li>Dinoso, J., Kim, S., Blankson, J., Siliciano, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+Dynamics+of+Elite+Suppressors+in+HIV-1+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Conference+on+Retroviruses+and+Opportunistic+Infections%22%5BJournal%5D)">Viral Dynamics of Elite Suppressors in HIV-1 Infection.</a> Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections. , (2008).</li>
<li>Dinoso, J. B., Kim, S. Y., Wiegand, A. M., Palmer, S. E., Gange, S. J., Cranmer, L., O'Shea, A., Callender, M., Spivak, A., Brennan, T., Kearney, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+intensification+does+not+reduce+residual+HIV-1+viremia+in+patients+on+highly+active+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Treatment intensification does not reduce residual HIV-1 viremia in patients on highly active antiretroviral therapy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9403-9408 (2009).</li>
<li>Doria-Rose, N. A., Klein, R. M., Manion, M. M., O'Dell, S., Phogat, A., Chakrabarti, B., Hallahan, C. W., Migueles, S. A., Wrammert, J., Ahmed, R., Nason, M., Wyatt, R. T., Mascola, J. R., Connors, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+and+phenotype+of+human+immunodeficiency+virus+envelope-specific+B+cells+from+patients+with+broadly+cross-neutralizing+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Frequency and phenotype of human immunodeficiency virus envelope-specific B cells from patients with broadly cross-neutralizing antibodies.</a> J. Virol. 83, 188-199 (2009).</li>
<li>Dornadula, G., Zhang, H., Uitert, B. V. an, Stern, J., Livornese, L., Ingerman, M. J., Witek, J., Kedanis, R. J., Natkin, J., DeSimone, J., Pomerantz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+HIV-1+RNA+in+blood+plasma+of+patients+taking+suppressive+highly+active+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Residual HIV-1 RNA in blood plasma of patients taking suppressive highly active antiretroviral therapy.</a> JAMA. 282, 1627-1632 (1999).</li>
<li>Gandhi, R. T., Zheng, L., Bosch, R. J., Chan, E. S., Margolis, D. M., Read, S., Kallungal, B., Palmer, S., Medvik, K., Lederman, M. M., Alatrakchi, N., Jacobson, J. M., Wiegand, A., Kearney, M., Coffin, J. M., Mellors, J. W., Eron, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+raltegravir+intensification+on+low-level+residual+viremia+in+HIV-infected+patients+on+antiretroviral+therapy%3A+a+randomized+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+medicine%22%5BJournal%5D)">The effect of raltegravir intensification on low-level residual viremia in HIV-infected patients on antiretroviral therapy: a randomized controlled trial.</a> PLoS medicine. 7, (2010).</li>
<li>Gay, C., Dibben, O., Anderson, J. A., Stacey, A., Mayo, A. J., Norris, P. J., Kuruc, J. D., Salazar-Gonzalez, J. F., Li, H., Keele, B. F., Hicks, C., Margolis, D., Ferrari, G., Haynes, B., Swanstrom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-sectional+detection+of+acute+HIV+infection%3A+timing+of+transmission%2C+inflammation+and+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cross-sectional detection of acute HIV infection: timing of transmission, inflammation and antiretroviral therapy.</a> PLoS One. 6, 19617-19617 (2011).</li>
<li>Hatano, H., Delwart, E. L., Norris, P. J., Lee, T. H., Dunn-Williams, J., Hunt, P. W., Hoh, R., Stramer, S. L., Linnen, J. M., McCune, J. M., Martin, J. N., Busch, M. P., Deeks, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+persistent+low-level+viremia+in+individuals+who+control+human+immunodeficiency+virus+in+the+absence+of+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Evidence for persistent low-level viremia in individuals who control human immunodeficiency virus in the absence of antiretroviral therapy.</a> J. Virol. 83, 329-335 (2009).</li>
<li>Havlir, D. V., Bassett, R., Levitan, D., Gilbert, P., Tebas, P., Collier, A. C., Hirsch, M. S., Ignacio, C., Condra, J., Gunthard, H. F., Richman, D. D., Wong, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+predictive+value+of+intermittent+viremia+with+combination+hiv+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Prevalence and predictive value of intermittent viremia with combination hiv therapy.</a> JAMA. 286, 171-179 (2001).</li>
<li>Jordan, M. R., Kearney, M., Palmer, S., Shao, W., Maldarelli, F., Coakley, E. P., Chappey, C., Wanke, C., Coffin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+standard+PCR%2Fcloning+to+single+genome+sequencing+for+analysis+of+HIV-1+populations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of standard PCR/cloning to single genome sequencing for analysis of HIV-1 populations.</a> J Virol Methods. 168, 114-120 (2010).</li>
<li>Kaufmann, D. E., Kavanagh, D. G., Pereyra, F., Zaunders, J. J., Mackey, E. W., Miura, T., Palmer, S., Brockman, M., Rathod, A., Piechocka-Trocha, A., Baker, B., Zhu, B., Gall, S. L. e, Waring, M. T., Ahern, R., Moss, K., Kelleher, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+CTLA-4+by+HIV-specific+CD4%2B+T+cells+correlates+with+disease+progression+and+defines+a+reversible+immune+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Upregulation of CTLA-4 by HIV-specific CD4+ T cells correlates with disease progression and defines a reversible immune dysfunction.</a> Nat Immunol. 8, 1246-1254 (2007).</li>
<li>Kearney, M., Maldarelli, F., Shao, W., Margolick, J. B., Daar, E. S., Mellors, J. W., Rao, V., Coffin, J. M., Palmer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Population+Genetics+and+Adaptation+in+Newly+Infected+Individuals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Population Genetics and Adaptation in Newly Infected Individuals.</a> J. Virol. 83, 2715-2727 (2008).</li>
<li>Kearney, M., Palmer, S., Maldarelli, F., Shao, W., Polis, M. A., Mican, J., Rock-Kress, D., Margolick, J. B., Coffin, J. M., Mellors, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequent+polymorphism+at+drug+resistance+sites+in+HIV-1+protease+and+reverse+transcriptase%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Frequent polymorphism at drug resistance sites in HIV-1 protease and reverse transcriptase.</a> AIDS. 22, 497-501 (2008).</li>
<li>Kearney, M., Spindler, J., Shao, W., Maldarelli, F., Palmer, S., Hu, S. L., Lifson, J. D., Kewal Ramani, V. N., Mellors, J. W., Coffin, J. M., Ambrose, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+diversity+of+simian+immunodeficiency+virus+encoding+HIV-1+reverse+transcriptase+persists+in+macaques+despite+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Genetic diversity of simian immunodeficiency virus encoding HIV-1 reverse transcriptase persists in macaques despite antiretroviral therapy.</a> Journal of Virology. 85, 1067-1076 (2011).</li>
<li>Keele, B. F., Giorgi, E. E., Salazar-Gonzalez, J. F., Decker, J. M., Pham, K. T., Salazar, M. G., Sun, C., Grayson, T., Wang, S., Li, H., Wei, X., Jiang, C., Kirchherr, J. L., Gao, F., Anderson, J. A., Ping, L. H., Swanstrom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+transmitted+and+early+founder+virus+envelopes+in+primary+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of transmitted and early founder virus envelopes in primary HIV-1 infection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , 105-7552 (2008).</li>
<li>Liu, S. L., Rodrigo, A. G., Shankarappa, R. G., Learn, H., Hsu, L., Davidov, O., Zhao, L. P., Mullins, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+quasispecies+and+resampling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">HIV quasispecies and resampling.</a> Science. 273, 415-416 (1996).</li>
<li>Mahalanabis, M., Jayaraman, P., Miura, T., Pereyra, F., Chester, E. M., Richardson, B., Walker, B., Haigwood, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+viral+escape+and+selection+by+autologous+neutralizing+antibodies+in+drug-naive+human+immunodeficiency+virus+controllers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Continuous viral escape and selection by autologous neutralizing antibodies in drug-naive human immunodeficiency virus controllers.</a> J. Virol. 83, 662-672 (2009).</li>
<li>Migueles, S. A., Connors, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+CD4%28%2B%29+and+CD8%28%2B%29+T+Cells+in+Controlling+HIV+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Infect.+Dis.+Rep%22%5BJournal%5D)">The Role of CD4(+) and CD8(+) T Cells in Controlling HIV Infection.</a> Curr. Infect. Dis. Rep. 4, 461-467 (2002).</li>
<li>Palmer, S., Kearney, M., Maldarelli, F., Halvas, E. K., Bixby, C. J., Bazmi, H., Rock, D., Falloon, J., Davey, R. T., Dewar, R. L., Metcalf, J. A., Hammer, S., Mellors, J. W., Coffin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple%2C+linked+human+immunodeficiency+virus+type+1+drug+resistance+mutations+in+treatment-experienced+patients+are+missed+by+standard+genotype+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multiple, linked human immunodeficiency virus type 1 drug resistance mutations in treatment-experienced patients are missed by standard genotype analysis.</a> J. Clin. Microbiol. 43, 406-413 (2005).</li>
<li>Palmer, S., Wiegand, A. P., Maldarelli, F., Bazmi, H., Mican, J. M., Polis, M., Dewar, R. L., Planta, A., Liu, S., Metcalf, J. A., Mellors, J. W., Coffin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+real-time+reverse+transcriptase-initiated+PCR+assay+with+single-copy+sensitivity+for+human+immunodeficiency+virus+type+1+RNA+in+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">New real-time reverse transcriptase-initiated PCR assay with single-copy sensitivity for human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma.</a> J. Clin. Microbiol. 41, 4531-4536 (2003).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

HIV-1 geïnfecteerde personen op antiretrovirale combinatietherapie (CART) of die van nature de controle van de infectie hebben een zeer lage virale belasting, meestal rond een kopie per ml plasma 4, 11, 12, 17, 18. Viral load bij patiënten met een natuurlijke beheersing, vaak schommelen rond een individuele set punt 1, 2, 17. De gevoeligheid van de testen hierin beschreven is sterk afhankelijk van de input volume van het plasma. Over het algemeen hebben we gewerkt met 7 ml plasma, maar positieve re...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Random hexameren (500 ug / ml) </td><td> Promega </td><td> C118A </td><td></td></tr><tr><td> Taqman buffer A </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4304441 </td><td></td></tr><tr><td> RNAsin (40 U / ul) </td><td> Promega </td><td> N211B </td><td></td></tr><tr><td> RT enzym (200 U / ul) </td><td> Strategene </td><td> 600107-51 </td><td></td></tr><tr><td> Amplitaq Gold DNA polymerase </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4311814 </td><td> 6-pack </td></tr><tr><td> Amplitaq 10XGold PCR-buffer II </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4311814 </td><td> wordt geleverd met het enzym </td></tr><tr><td> Magnesiumcloride 25 mM </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4311814 </td><td> wordt geleverd met het enzym </td></tr><tr><td> 1 M Tris-HCl-buffer, pH 8,0, 5 mM </td><td> Invitrogen </td><td> AM9855G </td><td></td></tr><tr><td> Superscript III reverse transcriptase enzym, 200 U / ul </td><td> Invitrogen </td><td> 18080-044 </td><td></td></tr><tr><td> Superscript III 10X buffer </td><td> Invitrogen </td><td></td><td> wordt geleverd met het enzym </td></tr><tr><td> DTT 100 mM </td><td> Invitrogen </td><td></td><td> wordt geleverd met het enzym </td></tr><tr><td> Platinum Taq DNA-polymerase High Fidelity 5 U / ul </td><td> Invitrogen </td><td> 11304-102 </td><td></td></tr><tr><td> 10X High Fidelity PCR-buffer </td><td> Invitrogen </td><td> 11304-102 </td><td> wordt geleverd met het enzym </td></tr><tr><td> Proteïnase-K 20 mg / ml </td><td> Ambion </td><td> 2546 </td><td></td></tr><tr><td> Guanidiniumthiocyanaat oplossing 6M </td><td> FlukaBiochemica </td><td> 50983 </td><td></td></tr><tr><td> Glycogeen 20 mg / ml </td><td> Roche </td><td> 10901393001 </td><td></td></tr><tr><td> Isopropanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 19516 </td><td></td></tr><tr><td> Ethanol 70% </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E702-3 </td><td></td></tr><tr><td> Moleculair-biologische kwaliteit water </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 10977-015 </td><td></td></tr><tr><td> dNTPs (25 mmol per stuk) </td><td> Bioline </td><td> BIO-39025 </td><td></td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de Euipment </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Gemakkelijk Seal Centrifuge Tubes (16x73mm) </td><td> Seaton Wetenschappelijke </td><td> 6041 </td><td></td></tr><tr><td> Witte Delrin kronen </td><td> Seaton Wetenschappelijke </td><td> 4020 </td><td> Caps voor de Easy Seal Tubes </td></tr><tr><td> Buizenrek voor Optiseal Bell-Top Buizen, 8,9 ml </td><td> Beckman </td><td> 361642 </td><td></td></tr><tr><td> Hex driver ½ inc opening </td><td> Seaton Wetenschappelijke </td><td> 4013 </td><td></td></tr><tr><td> dop verwijderen tupe </td><td> Seaton Wetenschappelijke </td><td> 4014 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ml serologische pipetten </td><td> Costar </td><td> 4051 </td><td></td></tr><tr><td> Pipetboy </td><td> een </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 15 ml Transfer pipetten </td><td> ISC Bioexpress </td><td> P-5005-7 </td><td></td></tr><tr><td> 5,8 ml Dispossable overdracht pipetten, fijne punt </td><td> VWR </td><td> 14670-329 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml centrifugebuizen </td><td> Valk </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 ml centrifugebuizen </td><td> een </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tris buffer Saline tabletten </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T5030-100TAB </td><td></td></tr><tr><td> Ultracentrifuge en rotor </td><td> Sorval </td><td> 90SE en T-1270 </td><td></td></tr><tr><td> 96-well PCR-platen </td><td> Biorad </td><td> HSS-9601 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml Reagens reservoir </td><td> Costar </td><td> 4870 </td><td></td></tr><tr><td> MICROAMP optische 96-well plaat reactie </td><td> Applied Biosystems </td><td> N801-0560 </td><td></td></tr><tr><td> Optische plaat dekt </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4333183 </td><td></td></tr><tr><td> MICROAMP Optische Compressie Pad </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4312639 </td><td></td></tr><tr><td> MicrosealEen film </td><td> Biorad </td><td> MSA-5001 </td><td></td></tr><tr><td> 2 ml centrifugebuizen </td><td> Een </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1% agarose gels (E-gel, Invitrogen) </td><td> Invitrogen </td><td> G-7008-01 </td><td></td></tr><tr><td> E-base (Invitrogen) </td><td> Invitrogen </td><td> EB-M03 </td><td></td></tr></tbody></table> EDTA Collectie buizen elk merk

versterken en kwantificeren van hiv-1 rna in hiv-geïnfecteerde personen met een viral load onder de limiet van de opsporing van standard clinical assays

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Versterken virale genen en het kwantificeren van HIV-1 RNA in HIV-1 geïnfecteerde personen met een viral load onder de detectielimiet door standaard assays (minder dan 50 tot 75 kopieën / ml) is nodig om inzicht te krijgen op virale dynamiek en virus gastheer interacties bij patiënten die natuurlijk de controle van de infectie en degenen die op antiretrovirale combinatietherapie (CART). Hier beschrijven we hoe de virale genomen versterken door enkele genoom (de SGS-protocol) 13, 19 en hoe nauwkeurig kwantificeren HIV-1 RNA in patiënten met een lage virale belasting (de single-copy assay (SCA)-protocol) 12, 20. De single-kopie assay is een real-time PCR-test met de gevoeligheid afhankelijk van het volume van het plasma wordt getest. Als een enkel virus genoom wordt gedetecteerd in 7 ml plasma, dan is het RNA-kopie-aantal is naar verluidt 0,3 kopieën / ml. De test heeft een interne controle van het testen voor de efficiëntie van RNA-extractie, en controles voor mogelijke versterking van DNA of vervuiling. Monsters van patiënten worden gemeten in drievoud. De single-genoom sequencing assay (SGS), die nu op grote schaal gebruikt en wordt beschouwd als niet-arbeidsintensief 3, 7, 12, 14, 15, is een beperkende verdunning assay, waarbij eindpunt verdunde cDNA product is verspreid over een 96-wells plaat. Volgens een Poisson-verdeling, wanneer er minder dan 1 / 3 van de putten te geven product, is er een 80% kans van het PCR-product wordt resultante van versterking van een enkele cDNA-molecuul. SGS heeft het voordeel ten opzichte van het klonen van het niet worden onderworpen aan resampling en niet wordt vertekend door PCR-geïntroduceerde recombinatie 19. Echter, de versterking succes van SCA en SGS zijn afhankelijk van primer design. Beide testen zijn ontwikkeld voor HIV-1 subtype B, maar kan worden aangepast voor andere subtypen en andere regio&#39;s van het genoom door het veranderen van primers, probes, en normen.

Kwantificeren niveaus van HIV-1 RNA in het plasma en de volgorde single HIV-1 genoom van individuen met een viral load onder de detectielimiet (50-75 kopieën / ml) is moeilijk. Hier beschrijven we hoe te winnen en te kwantificeren plasma virale RNA met behulp van een real-time PCR-test die een betrouwbare maatregelen HIV-1 RNA beneden tot 0,3 kopieën / ml en hoe virale genomen versterken door enkele genoom, van monsters met een zeer lage viral load.

Versterken en kwantificeren van HIV-1 RNA in HIV-geïnfecteerde personen met een viral load onder de limiet van de Opsporing van Standard Clinical Assays

Amplificatie van virale genen en kwantificering van HIV-1 RNA bij HIV-1 geïnfecteerde individuen met virale belastingen onder de detectielimiet van standaardassays (onder ...

In deze video worden methoden gedemonstreerd voor het kwantificeren en sequensen van enkele HIV-genomen van individuen met virale ladingen van minder dan 50 kopieën per milliliter plasma. Eerst wordt een buis met zeven milliliter plasma gecentrifugeerd om een pellet te vormen. Vervolgens wordt het virus-RNA geëxtraheerd om het niveau van HIV-1 te kwantificeren.Er wordt een single-copy assay uitgevoerd waarbij het RNA wordt reverse getranscribeerd, op een 96-wells plaat met standaarden en controles wordt geladen en wordt onderworpen aan kwantitatieve real-time PCR. Het niveau van viremie wordt vervolgens berekend op basis van het inputvolume plasma. Om de virale populatie te karakteriseren, kunnen hoeveelheden van slechts 0,3 kopieën per milliliter worden gedetecteerd.Er wordt een enkele genoomsequencing-assay uitgevoerd waarbij cDNA dat is getranscribeerd uit viraal RNA over een 96-wells plaat wordt verdeeld om een eindpuntverdunning te bereiken. Vervolgens wordt een nested PCR uitgevoerd om virale genomen te amplificeren. Als 30% of minder van de PCR-reacties positief zijn voor een bepaald monster, duidt dit op de amplificatie van een enkele kopie cDNA.Deze monsters worden vervolgens gesequenced om de nucleotidenvolgorde van individuele virale genomen te onthullen. De hoge gevoeligheid van deze technieken stelt ons in staat om het niveau van RNA bij patiënten met ondetecteerbare HIV-waarden via standaardassays te monitoren en de mechanismen van natuurlijke controle te begrijpen. Hoewel we deze methoden gebruiken om HIV te bestuderen met verschillende primers en een interne ionenstandaard, kan dezelfde methode ook worden gebruikt om andere virussen te bestuderen.Over het algemeen is deze methode uitdagend omdat het moeilijk is om virus te isoleren uit grote volumes plasma, en een DNA-vrije omgeving vereist is om fout-positieven te voorkomen. Begin deze procedure met het extraheren van RNA uit plasmaproeven van patiënten. Breng zeven milliliter plasma over naar een schone buis van 15 milliliter.Als er RNA moet worden geëxtraheerd voor de single copy assay, wordt op dit punt 200 µL van de interne virioncontrole toegevoegd, die 30.000 kopieën van het RCA-virus bevat. Centrifugeer vervolgens het plasma vervolgens 15 minuten lang bij 2.600 ×g om lipiden en cellulair debris te verwijderen, aangezien deze de RNA-kwantificering kunnen beïnvloeden. Markeer na het centrifugeren één zijde van een settin easy seal centrifugebuis met een waterbestendige marker, waarbij cellulair debris en/of lipiden worden vermeden. Gebruik een pipet om het plasma over te brengen naar de gemarkeerde settin eae-buis.Noteer vervolgens het inputvolume van het plasma. Vul de buisjes aan met tris-gebufferde zoutoplossing tot aan de onderkant van de schroefdraad van de hals. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn.Sluit de buizen af met een dop. Plaats de monsters met de markering naar buiten in een vooraf gekoelde ultracentrifugerotor. Centrifugeer 30 minuten lang bij 170,000 ×g bij vier °C.Na centrifugatie zal de pellet niet zichtbaar zijn. Verwijder het supernatant en voeg vervolgens 90 µL moleculair zuiver water en 10 µL proteïne ACE K toe aan de virale pellet. Zorg er vervolgens voor dat de buis in een hoek staat waarbij de pellet is ondergedompeld in het mengsel van proteïne ACE K en water.Plaats de buis in een waterbad van 55 °C en incubeer deze gedurende 30 minuten. Centrifugeer de buis na de incubatie kort om het monster naar de bodem van de buis te brengen. Voeg vervolgens 10 µL glycogen (20 mg/mL) en 315 µL guanidiniumthiocyanaat-oplossing (6 M) toe en vortex.Breng de inhoud van de buis voorzichtig over naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 milliliter die 495 µL moleculaire isopropanol bevat en vortex gedurende 10 seconden. Centrifugeer vervolgens 30 minuten bij 21.000 ×g bij kamertemperatuur, verwijder het supernatant en voeg 500 µL 70% ethanol toe aan de buis; vortex gedurende 10 seconden en centrifugeer 15 minuten bij 21.000 ×g. Verwijder de ethanol bij kamertemperatuur met een grote transferpipet, centrifugeer opnieuw om eventuele resterende ethanol te verwijderen en laat het pellet vervolgens 10 minuten aan de lucht drogen.Als er een single-copy assay wordt uitgevoerd, los dan het pellet op in 55 µL RNA-buffer en plaats de buis op ijs. Als er single-genome sequencing wordt uitgevoerd, los dan het RNA op in 40 µL tris-hydrochloride bij pH 8,0 en laat de buizen op kamertemperatuur staan om een single-copy assay uit te voeren.De standaardcurven voor HIV one en RCA's worden voorbereid door half-log seriële verdunningen uit te voeren van de RNA-transcripten van HIV one en RCA's in RNA-buffer. Voeg na het labelen van de 1,5 milliliter buisjes 54 microliters RNA-buffer toe aan elk van de buisjes. Verdun vervolgens tot 0,3 RNA-kopieën per 10 microliters voor HIV one en 100 RNA-kopieën per 10 microliters voor RCA's.Meng door te vortexen tussen elke verdunning. Nadat 54 µL RNA-buffer aan elke buis is toegevoegd, begint men met het toevoegen van 25 µL van het transcript aan de eerste buis; vortex kortstondig, centrifugeer kort en breng dit vervolgens opeenvolgend over naar de volgende buis, tot aan de laatste gelabelde buis.Zodra de verdunningen zijn bereid, combineert u de reverse transcriptase of het RT-cocktail voor CD NA-synthese. Maak voldoende mengsel voor 96 R-T-P-C-R reacties, inclusief acht controles zonder reverse transcriptase (NRT) om amplificatie vanuit DNA te controleren. Richt vervolgens een optische 96-wellsplaat in, waarin acht patiëntmonsters worden geplaatst, inclusief standaarden en controles.Voeg 20 µL van het NRT-reactiemengsel toe aan de acht aangewezen NRT-wells en voeg 20 µL van het RT-reactiemengsel toe aan de overige 88 wells. Voeg na het toevoegen van de RT- en NRT-mengsels aan de plaat 10 µL water toe aan de wells die gemarkeerd zijn als negatieve controles. Voeg vervolgens 10 µL HIV-transcripten toe aan de als HIV gemarkeerde wells in de concentraties die worden vermeld in het bijbehorende geschreven protocol, en aan twee wells gemarkeerd als RCAs.Voeg 10 µL RCA-transcripten in de gewenste concentraties toe aan de acht sets van drie aangrenzende putjes met het label 'sample' op de plaat en voeg 10 µL van het genoemde monster toe. Voeg daarnaast 10 µL van dit monster toe aan de acht putjes met het label 'NRT' en vervolgens aan de putjes met het label 'internal control'. Voeg bij voltooiing vijf µL monster en vijf µL water toe.De 96-wells plaat wordt ingericht zoals weergegeven in deze figuur. Seal de plaat en run deze op een thermocycler als volgt: 25 °C gedurende 15 minuten, 42 °C gedurende 40 minuten, 85 °C gedurende 10 minuten, 25 °C gedurende 30 minuten en bewaar vervolgens bij 5 °C.Bereid de PCR-mastermixen voor HIV en RCA's voor terwijl de cDNA's worden gesynthetiseerd. Wanneer de cDNA-synthese is voltooid, brengt u de plaat naar een gebied buiten de cleanroom dat is aangewezen voor de behandeling van cDNA.Voeg 20 microliters H-I-V-P-C-R master mix voor QPCR toe aan elk van de putjes die in groen zijn aangegeven in deze figuur. Voeg vervolgens 20 microliters RCAs PCR master mix toe aan het putje dat in grijs is aangegeven in deze figuur. Centrifugeer de plaat bij 2, 600 times g na het vullen.Plaats de plaat in een realtime PCR-instrument en voer de qPCR uit volgens de volgende condities: 95 °C gedurende 10 minuten. Daarna 45 cycli van 95 °C gedurende 15 seconden en 60 °C gedurende één minuut. Zodra de resultaten zijn verkregen, is een aparte analyse van de RCA's en HIV vereist om single genome sequencing uit te voeren.Begin met het synthetiseren van cDNA met RNA gesuspendeerd in tris-hydrochloride bij pH 8.0 als template. Combineer eerst in een PCR-plaat met 96 wells vijf µL van 10 mM dNTP's, vijf µL van de 2 mM gen-specifieke primer, óf pole óf en, en 40 µL van het geëxtraheerde RNA. Verzegel de plaat met een MicroSeal-folie van BioRad.Incubeer de reactie vervolgens 10 minuten bij 65 °C om het RNA-mengsel te denatureren. Bereid het RT-reactiemengsel voor terwijl het RNA denatureert.Let op dat dit een ander RT-reactiemengsel is dan het mengsel dat wordt gebruikt voor de single copy assay. Plaats de PCR-plaat na de denaturatiestap op IJS om het RNA in de gedenatureerde vorm te houden. Voeg vervolgens 50 µL van het vers bereide RT-reactiemengsel toe aan elk monster en run de PCR-plaat in de thermocycler met de volgende instellingen: 45 °C gedurende 50 minuten, 85 °C gedurende 10 minuten en 4 °C voor de hold.Tijdens deze stap wordt het RNA in cDNA omgezet terwijl het cDNA wordt gesynthetiseerd. Bereid het PCR-reactiemengsel voor met ofwel P6-through-RT- of envelope-PCR-primers. Let op dat dit een ander PCR-reactiemengsel is dan het mengsel dat wordt gebruikt voor de single-copy assay. Breng 8,0 µL van het vers bereide PCR-reactiemengsel aan in elk van de 73 wells op een nieuwe 96-wells PCR-plaat, inclusief 70 monsters en drie negatieve controles.Wanneer de synthese van CD NA is voltooid, brengt u de plaat naar een gebied buiten de cleanroom dat is aangewezen voor de behandeling van CD NA. Voeg vervolgens 40 µL tris-hydrochloride bij pH 8,0 toe aan het CD NA-monster om het eindvolume op 140 µL te brengen. Voeg daarna 2,0 µL monster toe aan elk van de 70 putjes en 2,0 µL water aan elk van de negatieve controles. Seal de PCR-plaat en voer de PCR uit met behulp van het hier getoonde programma.Voer vervolgens een nested PCR uit volgens de instructies in de bijbehorende tekst. Laat na de PCR-run de monsters lopen op een 1% agarosegel. Inspecteer de resultaten.Als niet meer dan 30% van de wells positief is, zijn de meeste PCR-producten het resultaat van een enkel molecuul cDNA. Er is een single copy assay uitgevoerd zoals beschreven in deze video. Deze figuur toont de qPCR-resultaten van enkele elite controllers.Zoals hier te zien is, zien de amplificatiecurves voor de monsters en de verdunde HIV-standaard er correct uit. Het herstel van de interne virionstandaard was voor de meeste monsters boven de 1500 kopieën, behalve voor monster zeven, dat is omcirkeld. Ter bevestiging van een efficiënte RNA-extractie zijn de resultaten van monster drie in het rood gemarkeerd.Het kopieaantal in de drie wells was nul, één en nul kopieën. De NRT-controle, oranje gemarkeerd, en de negatieve controle, geel gemarkeerd, waren beide negatief, wat bevestigt dat de amplificatie niet was beïnvloed door contaminatie van andere monsters. Aangezien de positieve en negatieve controles waren geslaagd, kan het kopieaantal nu worden berekend. Het gemiddelde kopieaantal van 0,3 moet worden vermenigvuldigd met een factor 5,5 om het totale kopieaantal in de RNA-elutie te verkrijgen: 0,3 keer 5,5 is gelijk aan 1,65. Dit getal wordt vervolgens gedeeld door het totale geanalyseerde plasmavolume van 7,3 milliliters, wat resulteert in een HIV-1 RNA-waarde van 0,2 kopieën per ml.De assay voor sequencing van een enkel genoom werd uitgevoerd zoals beschreven in de video. Deze figuur toont een AROS-gel van een van de HIV-1 non-controllers in het onderzoek. De negatieve controles in put H1 en H2 zijn beide negatief.Minder dan een derde van de wells is geamplificeerd, wat bevestigt dat dit een eindpuntverdunning is, en de meeste van deze amplificaties zijn afkomstig van een enkele kopie van CDNA. Een alignment van de sequenties uit de SGS wordt hier getoond. Er zijn geen ambiguïteitspunten, wat aantoont dat de amplificatie afkomstig was van een enkele kopie van CDNA tijdens de poging tot RNA-extractie uit grote volumes plasma.Het is belangrijk om te onthouden dat de pre-spin moet worden uitgevoerd om cellen en lipiden te voorkomen die de efficiëntie van de assay na de ontwikkeling kunnen beïnvloeden. Deze techniek is gebruikt om de virale dynamiek te onderzoeken in een breed scala aan patiëntengroepen met virale loads die onder de detectielimiet van standaard assays liggen.

amplifying-quantifying-hiv-1-rna-hiv-infected-individuals-with-viral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Source: Scarborough, R. J., et al. Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates a reverse transcriptase (RT) assay to assess the effect of a test RNA on virus-like particle (VLP) production. Cells are co-transfected with plasmids, and RT activity is measured as a quantitative indicator of VLP output. A decrease in RT activity reflects suppression of viral gene expression by the test RNA.

Reverse Transcriptase Activity as a Marker for Virus-Like Particle Production

Er is een protocol gegeven voor het ontwikkelen van een real-time recombinase polymerase-amplificatietest om de initiële concentratie van DNA-monsters te kwantificeren met behulp van een thermische cycler of een microscoop en een stage-heater. Ook beschreven is de ontwikkeling van een interne positieve controle. Scripts zijn gegeven voor het verwerken van ruwe real-time fluorescentiegegevens.

Ontwikkeling van een kwantitatieve Recombinase Polymerase Amplificatie test met een interne positieve controle

We beschrijven hier een eenvoudige en snelle papieren DNA extractiewerkwijze HIV provirale DNA uit vol bloed gedetecteerd met kwantitatieve PCR. Dit protocol kan worden verlengd voor gebruik bij het detecteren andere genetische merkers of alternatieve amplificatiewerkwijzen.

Filtratie Isolatie van nucleïnezuren: Een eenvoudige en snelle DNA Extraction Method

Methoden om de werkzaamheid en toxiciteit van RNA-moleculen die zich richten op post-integratie stappen van de HIV-1 replicatiecyclus te evalueren, worden beschreven. Deze methoden zijn nuttig voor het screenen van nieuwe moleculen en het optimaliseren van de indeling van bestaande.

Evaluatie van de effectiviteit en toxiciteit van RNA&#39;s Targeting HIV-1 productie voor gebruik in Gene of Drug Therapy

Beschreven is een methode om te kwantificeren van de expressie van genen die 96 en 18 oppervlakte eiwitten door afzonderlijke cellen ex vivo, waardoor voor de identificatie van differentially uitgedrukte genen en proteïnen in virus-geïnfecteerde cellen ten opzichte van niet-geïnfecteerde cellen. Passen we de aanpak van de studie SIV-geïnfecteerde CD4+ T cellen geïsoleerd van rhesus makaken.

Eencellige kwantificatie van mRNA en oppervlak eiwituitdrukking in Simian Immunodeficiëntie Virus-geïnfecteerde CD4+ T cellen geïsoleerd van Rhesus Makaken

Full-length individuele proviraal sequencing (FLIPS) een efficiënte en hoog-productie methode voorziet in de versterking en sequentiebepaling van één, in de buurt van full-length (intact en defecte) HIV-1 proviruses en zorgt voor de bepaling van hun potentieel replicatie-competentie. FLIPS overwint beperkingen van eerdere tests ontworpen om de volgorde van het latente reservoir van HIV-1.

Versterking van in de buurt van Full-length HIV-1 Proviruses voor Next-Generation Sequencing

Real-time kwantitatieve polymerase kettingreactie analyse gecombineerd met omgekeerde transcriptie (RT-qPCR) is wijd verbeid gebruikt voor het meten van het niveau van de RNA-virusinfecties. Hier presenteren we een directe RT-qPCR assay, die niet een RNA-zuivering hoeft, ontwikkeld voor de kwantificering van verschillende RNA virussen, met inbegrip van dengue virus.

Meten van Dengue Virus RNA in het Supernatant van cultuur van geïnfecteerde cellen door Real-time kwantitatieve Polymerase-kettingreactie

Hier presenteren we een diepe rangschikken benadering waarmee een onbevooroordeelde bepaling van ontluikende 3'-termini en vogelgriepvirus profielen van single-stranded DNA moleculen. De belangrijkste toepassing is de karakterisatie van ontluikende retrovirale complementaire Ani (cDNAs), de tussenproducten die tijdens het proces van retrovirale omgekeerde transcriptie gegenereerd.

Bepalende 3'-Termini en sequenties van ontluikende Single-Stranded virale DNA moleculen tijdens HIV-1 Reverse transcriptie in geïnfecteerde cellen

RNA haarspelden en lussen kunnen fungeren als primers voor reverse transcriptie (RT) bij afwezigheid van sequentie-specifieke primers, interfereren met de studie van overlappende antisense transcripten. We hebben een techniek ontwikkeld die in staat is om streng-specifiek RNA te identificeren, en we hebben het gebruikt om HIV-1 antisense Protein ASP te bestuderen.

Detectie van humaan immunodeficiëntie virus type 1 (HIV-1) antisense protein (ASP) RNA transcripten bij patiënten door onderdeel-specifieke RT-PCR

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor een fluorescentiebeeldvormingsbenadering, multiplex immunofluorescent cell-gebaseerde detection van DNA, RNA en protein (MICDDRP), een methode die in staat is tot gelijktijdige fluorescentie eencellige visualisatie van virale eiwitten en nucleïnezuren van verschillende type en gestrandheid. Deze aanpak kan worden toegepast op een breed scala aan systemen.

Eencellige multiplexed fluorescentie beeldvorming om virale nucleïnezuren en eiwitten te visualiseren en HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika-virus en influenza-infectie te controleren

Leer HIV-1 RNA kwantificeren en enkelvoudige genoomsequentie uitvoeren bij lage virale ladingen met real-time PCR. Deze methode detecteert tot 0,3 kopieën/ml en ondersteunt virologisch onderzoek.

Versterken en kwantificeren van HIV-1 RNA in HIV-geïnfecteerde personen met een viral load onder de limiet van de Opsporing van Standard Clinical Assays (Video) | JoVE Journal

Versterken en kwantificeren van HIV-1 RNA in HIV-geïnfecteerde personen met een viral load onder de limiet van de Opsporing van Standard Clinical Assays

Meer video's verkennen