Name: Versterken en kwantificeren van HIV-1 RNA in HIV-geïnfecteerde personen met een viral load onder de limiet van de Opsporing van Standard Clinical Assays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 58 s
Description: Leer HIV-1 RNA kwantificeren en enkelvoudige genoomsequentie uitvoeren bij lage virale ladingen met real-time PCR. Deze methode detecteert tot 0,3 kopieën/ml en ondersteunt virologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen de patiënten die deelnamen aan de vele studies van HIV-1 te erkennen. JMC was een Research Professor van de American Cancer Society met de steun van de FM-Kirby Foundation.

<ol><li>Amara, R. R., Villinger, F., Altman, J. D., Lydy, S. L., O'Neil, S. P., Staprans, S. I., Montefiori, D. C., Xu, Y., Herndon, J. G., Wyatt, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+a+mucosal+challenge+and+prevention+of+AIDS+by+a+multiprotein+DNA%2FMVA+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Control of a mucosal challenge and prevention of AIDS by a multiprotein DNA/MVA vaccine.</a> Vaccine. 20, 1949-1955 (2002).</li>
<li>Dinoso, J., Kim, S., Blankson, J., Siliciano, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+Dynamics+of+Elite+Suppressors+in+HIV-1+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Conference+on+Retroviruses+and+Opportunistic+Infections%22%5BJournal%5D)">Viral Dynamics of Elite Suppressors in HIV-1 Infection.</a> Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections. , (2008).</li>
<li>Dinoso, J. B., Kim, S. Y., Wiegand, A. M., Palmer, S. E., Gange, S. J., Cranmer, L., O'Shea, A., Callender, M., Spivak, A., Brennan, T., Kearney, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+intensification+does+not+reduce+residual+HIV-1+viremia+in+patients+on+highly+active+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Treatment intensification does not reduce residual HIV-1 viremia in patients on highly active antiretroviral therapy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9403-9408 (2009).</li>
<li>Doria-Rose, N. A., Klein, R. M., Manion, M. M., O'Dell, S., Phogat, A., Chakrabarti, B., Hallahan, C. W., Migueles, S. A., Wrammert, J., Ahmed, R., Nason, M., Wyatt, R. T., Mascola, J. R., Connors, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+and+phenotype+of+human+immunodeficiency+virus+envelope-specific+B+cells+from+patients+with+broadly+cross-neutralizing+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Frequency and phenotype of human immunodeficiency virus envelope-specific B cells from patients with broadly cross-neutralizing antibodies.</a> J. Virol. 83, 188-199 (2009).</li>
<li>Dornadula, G., Zhang, H., Uitert, B. V. an, Stern, J., Livornese, L., Ingerman, M. J., Witek, J., Kedanis, R. J., Natkin, J., DeSimone, J., Pomerantz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+HIV-1+RNA+in+blood+plasma+of+patients+taking+suppressive+highly+active+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Residual HIV-1 RNA in blood plasma of patients taking suppressive highly active antiretroviral therapy.</a> JAMA. 282, 1627-1632 (1999).</li>
<li>Gandhi, R. T., Zheng, L., Bosch, R. J., Chan, E. S., Margolis, D. M., Read, S., Kallungal, B., Palmer, S., Medvik, K., Lederman, M. M., Alatrakchi, N., Jacobson, J. M., Wiegand, A., Kearney, M., Coffin, J. M., Mellors, J. W., Eron, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+raltegravir+intensification+on+low-level+residual+viremia+in+HIV-infected+patients+on+antiretroviral+therapy%3A+a+randomized+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+medicine%22%5BJournal%5D)">The effect of raltegravir intensification on low-level residual viremia in HIV-infected patients on antiretroviral therapy: a randomized controlled trial.</a> PLoS medicine. 7, (2010).</li>
<li>Gay, C., Dibben, O., Anderson, J. A., Stacey, A., Mayo, A. J., Norris, P. J., Kuruc, J. D., Salazar-Gonzalez, J. F., Li, H., Keele, B. F., Hicks, C., Margolis, D., Ferrari, G., Haynes, B., Swanstrom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-sectional+detection+of+acute+HIV+infection%3A+timing+of+transmission%2C+inflammation+and+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cross-sectional detection of acute HIV infection: timing of transmission, inflammation and antiretroviral therapy.</a> PLoS One. 6, 19617-19617 (2011).</li>
<li>Hatano, H., Delwart, E. L., Norris, P. J., Lee, T. H., Dunn-Williams, J., Hunt, P. W., Hoh, R., Stramer, S. L., Linnen, J. M., McCune, J. M., Martin, J. N., Busch, M. P., Deeks, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+persistent+low-level+viremia+in+individuals+who+control+human+immunodeficiency+virus+in+the+absence+of+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Evidence for persistent low-level viremia in individuals who control human immunodeficiency virus in the absence of antiretroviral therapy.</a> J. Virol. 83, 329-335 (2009).</li>
<li>Havlir, D. V., Bassett, R., Levitan, D., Gilbert, P., Tebas, P., Collier, A. C., Hirsch, M. S., Ignacio, C., Condra, J., Gunthard, H. F., Richman, D. D., Wong, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+predictive+value+of+intermittent+viremia+with+combination+hiv+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Prevalence and predictive value of intermittent viremia with combination hiv therapy.</a> JAMA. 286, 171-179 (2001).</li>
<li>Jordan, M. R., Kearney, M., Palmer, S., Shao, W., Maldarelli, F., Coakley, E. P., Chappey, C., Wanke, C., Coffin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+standard+PCR%2Fcloning+to+single+genome+sequencing+for+analysis+of+HIV-1+populations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of standard PCR/cloning to single genome sequencing for analysis of HIV-1 populations.</a> J Virol Methods. 168, 114-120 (2010).</li>
<li>Kaufmann, D. E., Kavanagh, D. G., Pereyra, F., Zaunders, J. J., Mackey, E. W., Miura, T., Palmer, S., Brockman, M., Rathod, A., Piechocka-Trocha, A., Baker, B., Zhu, B., Gall, S. L. e, Waring, M. T., Ahern, R., Moss, K., Kelleher, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+CTLA-4+by+HIV-specific+CD4%2B+T+cells+correlates+with+disease+progression+and+defines+a+reversible+immune+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Upregulation of CTLA-4 by HIV-specific CD4+ T cells correlates with disease progression and defines a reversible immune dysfunction.</a> Nat Immunol. 8, 1246-1254 (2007).</li>
<li>Kearney, M., Maldarelli, F., Shao, W., Margolick, J. B., Daar, E. S., Mellors, J. W., Rao, V., Coffin, J. M., Palmer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Population+Genetics+and+Adaptation+in+Newly+Infected+Individuals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Population Genetics and Adaptation in Newly Infected Individuals.</a> J. Virol. 83, 2715-2727 (2008).</li>
<li>Kearney, M., Palmer, S., Maldarelli, F., Shao, W., Polis, M. A., Mican, J., Rock-Kress, D., Margolick, J. B., Coffin, J. M., Mellors, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequent+polymorphism+at+drug+resistance+sites+in+HIV-1+protease+and+reverse+transcriptase%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Frequent polymorphism at drug resistance sites in HIV-1 protease and reverse transcriptase.</a> AIDS. 22, 497-501 (2008).</li>
<li>Kearney, M., Spindler, J., Shao, W., Maldarelli, F., Palmer, S., Hu, S. L., Lifson, J. D., Kewal Ramani, V. N., Mellors, J. W., Coffin, J. M., Ambrose, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+diversity+of+simian+immunodeficiency+virus+encoding+HIV-1+reverse+transcriptase+persists+in+macaques+despite+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Genetic diversity of simian immunodeficiency virus encoding HIV-1 reverse transcriptase persists in macaques despite antiretroviral therapy.</a> Journal of Virology. 85, 1067-1076 (2011).</li>
<li>Keele, B. F., Giorgi, E. E., Salazar-Gonzalez, J. F., Decker, J. M., Pham, K. T., Salazar, M. G., Sun, C., Grayson, T., Wang, S., Li, H., Wei, X., Jiang, C., Kirchherr, J. L., Gao, F., Anderson, J. A., Ping, L. H., Swanstrom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+transmitted+and+early+founder+virus+envelopes+in+primary+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of transmitted and early founder virus envelopes in primary HIV-1 infection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , 105-7552 (2008).</li>
<li>Liu, S. L., Rodrigo, A. G., Shankarappa, R. G., Learn, H., Hsu, L., Davidov, O., Zhao, L. P., Mullins, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+quasispecies+and+resampling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">HIV quasispecies and resampling.</a> Science. 273, 415-416 (1996).</li>
<li>Mahalanabis, M., Jayaraman, P., Miura, T., Pereyra, F., Chester, E. M., Richardson, B., Walker, B., Haigwood, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+viral+escape+and+selection+by+autologous+neutralizing+antibodies+in+drug-naive+human+immunodeficiency+virus+controllers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Continuous viral escape and selection by autologous neutralizing antibodies in drug-naive human immunodeficiency virus controllers.</a> J. Virol. 83, 662-672 (2009).</li>
<li>Migueles, S. A., Connors, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+CD4%28%2B%29+and+CD8%28%2B%29+T+Cells+in+Controlling+HIV+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Infect.+Dis.+Rep%22%5BJournal%5D)">The Role of CD4(+) and CD8(+) T Cells in Controlling HIV Infection.</a> Curr. Infect. Dis. Rep. 4, 461-467 (2002).</li>
<li>Palmer, S., Kearney, M., Maldarelli, F., Halvas, E. K., Bixby, C. J., Bazmi, H., Rock, D., Falloon, J., Davey, R. T., Dewar, R. L., Metcalf, J. A., Hammer, S., Mellors, J. W., Coffin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple%2C+linked+human+immunodeficiency+virus+type+1+drug+resistance+mutations+in+treatment-experienced+patients+are+missed+by+standard+genotype+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multiple, linked human immunodeficiency virus type 1 drug resistance mutations in treatment-experienced patients are missed by standard genotype analysis.</a> J. Clin. Microbiol. 43, 406-413 (2005).</li>
<li>Palmer, S., Wiegand, A. P., Maldarelli, F., Bazmi, H., Mican, J. M., Polis, M., Dewar, R. L., Planta, A., Liu, S., Metcalf, J. A., Mellors, J. W., Coffin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+real-time+reverse+transcriptase-initiated+PCR+assay+with+single-copy+sensitivity+for+human+immunodeficiency+virus+type+1+RNA+in+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">New real-time reverse transcriptase-initiated PCR assay with single-copy sensitivity for human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma.</a> J. Clin. Microbiol. 41, 4531-4536 (2003).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

HIV-1 geïnfecteerde personen op antiretrovirale combinatietherapie (CART) of die van nature de controle van de infectie hebben een zeer lage virale belasting, meestal rond een kopie per ml plasma 4, 11, 12, 17, 18. Viral load bij patiënten met een natuurlijke beheersing, vaak schommelen rond een individuele set punt 1, 2, 17. De gevoeligheid van de testen hierin beschreven is sterk afhankelijk van de input volume van het plasma. Over het algemeen hebben we gewerkt met 7 ml plasma, maar positieve re...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Random hexameren (500 ug / ml) </td><td> Promega </td><td> C118A </td><td></td></tr><tr><td> Taqman buffer A </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4304441 </td><td></td></tr><tr><td> RNAsin (40 U / ul) </td><td> Promega </td><td> N211B </td><td></td></tr><tr><td> RT enzym (200 U / ul) </td><td> Strategene </td><td> 600107-51 </td><td></td></tr><tr><td> Amplitaq Gold DNA polymerase </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4311814 </td><td> 6-pack </td></tr><tr><td> Amplitaq 10XGold PCR-buffer II </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4311814 </td><td> wordt geleverd met het enzym </td></tr><tr><td> Magnesiumcloride 25 mM </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4311814 </td><td> wordt geleverd met het enzym </td></tr><tr><td> 1 M Tris-HCl-buffer, pH 8,0, 5 mM </td><td> Invitrogen </td><td> AM9855G </td><td></td></tr><tr><td> Superscript III reverse transcriptase enzym, 200 U / ul </td><td> Invitrogen </td><td> 18080-044 </td><td></td></tr><tr><td> Superscript III 10X buffer </td><td> Invitrogen </td><td></td><td> wordt geleverd met het enzym </td></tr><tr><td> DTT 100 mM </td><td> Invitrogen </td><td></td><td> wordt geleverd met het enzym </td></tr><tr><td> Platinum Taq DNA-polymerase High Fidelity 5 U / ul </td><td> Invitrogen </td><td> 11304-102 </td><td></td></tr><tr><td> 10X High Fidelity PCR-buffer </td><td> Invitrogen </td><td> 11304-102 </td><td> wordt geleverd met het enzym </td></tr><tr><td> Proteïnase-K 20 mg / ml </td><td> Ambion </td><td> 2546 </td><td></td></tr><tr><td> Guanidiniumthiocyanaat oplossing 6M </td><td> FlukaBiochemica </td><td> 50983 </td><td></td></tr><tr><td> Glycogeen 20 mg / ml </td><td> Roche </td><td> 10901393001 </td><td></td></tr><tr><td> Isopropanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 19516 </td><td></td></tr><tr><td> Ethanol 70% </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E702-3 </td><td></td></tr><tr><td> Moleculair-biologische kwaliteit water </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 10977-015 </td><td></td></tr><tr><td> dNTPs (25 mmol per stuk) </td><td> Bioline </td><td> BIO-39025 </td><td></td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de Euipment </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Gemakkelijk Seal Centrifuge Tubes (16x73mm) </td><td> Seaton Wetenschappelijke </td><td> 6041 </td><td></td></tr><tr><td> Witte Delrin kronen </td><td> Seaton Wetenschappelijke </td><td> 4020 </td><td> Caps voor de Easy Seal Tubes </td></tr><tr><td> Buizenrek voor Optiseal Bell-Top Buizen, 8,9 ml </td><td> Beckman </td><td> 361642 </td><td></td></tr><tr><td> Hex driver ½ inc opening </td><td> Seaton Wetenschappelijke </td><td> 4013 </td><td></td></tr><tr><td> dop verwijderen tupe </td><td> Seaton Wetenschappelijke </td><td> 4014 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ml serologische pipetten </td><td> Costar </td><td> 4051 </td><td></td></tr><tr><td> Pipetboy </td><td> een </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 15 ml Transfer pipetten </td><td> ISC Bioexpress </td><td> P-5005-7 </td><td></td></tr><tr><td> 5,8 ml Dispossable overdracht pipetten, fijne punt </td><td> VWR </td><td> 14670-329 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml centrifugebuizen </td><td> Valk </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 ml centrifugebuizen </td><td> een </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tris buffer Saline tabletten </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T5030-100TAB </td><td></td></tr><tr><td> Ultracentrifuge en rotor </td><td> Sorval </td><td> 90SE en T-1270 </td><td></td></tr><tr><td> 96-well PCR-platen </td><td> Biorad </td><td> HSS-9601 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml Reagens reservoir </td><td> Costar </td><td> 4870 </td><td></td></tr><tr><td> MICROAMP optische 96-well plaat reactie </td><td> Applied Biosystems </td><td> N801-0560 </td><td></td></tr><tr><td> Optische plaat dekt </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4333183 </td><td></td></tr><tr><td> MICROAMP Optische Compressie Pad </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4312639 </td><td></td></tr><tr><td> MicrosealEen film </td><td> Biorad </td><td> MSA-5001 </td><td></td></tr><tr><td> 2 ml centrifugebuizen </td><td> Een </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1% agarose gels (E-gel, Invitrogen) </td><td> Invitrogen </td><td> G-7008-01 </td><td></td></tr><tr><td> E-base (Invitrogen) </td><td> Invitrogen </td><td> EB-M03 </td><td></td></tr></tbody></table> EDTA Collectie buizen elk merk

versterken en kwantificeren van hiv-1 rna in hiv-geïnfecteerde personen met een viral load onder de limiet van de opsporing van standard clinical assays

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Versterken virale genen en het kwantificeren van HIV-1 RNA in HIV-1 geïnfecteerde personen met een viral load onder de detectielimiet door standaard assays (minder dan 50 tot 75 kopieën / ml) is nodig om inzicht te krijgen op virale dynamiek en virus gastheer interacties bij patiënten die natuurlijk de controle van de infectie en degenen die op antiretrovirale combinatietherapie (CART). Hier beschrijven we hoe de virale genomen versterken door enkele genoom (de SGS-protocol) 13, 19 en hoe nauwkeurig kwantificeren HIV-1 RNA in patiënten met een lage virale belasting (de single-copy assay (SCA)-protocol) 12, 20. De single-kopie assay is een real-time PCR-test met de gevoeligheid afhankelijk van het volume van het plasma wordt getest. Als een enkel virus genoom wordt gedetecteerd in 7 ml plasma, dan is het RNA-kopie-aantal is naar verluidt 0,3 kopieën / ml. De test heeft een interne controle van het testen voor de efficiëntie van RNA-extractie, en controles voor mogelijke versterking van DNA of vervuiling. Monsters van patiënten worden gemeten in drievoud. De single-genoom sequencing assay (SGS), die nu op grote schaal gebruikt en wordt beschouwd als niet-arbeidsintensief 3, 7, 12, 14, 15, is een beperkende verdunning assay, waarbij eindpunt verdunde cDNA product is verspreid over een 96-wells plaat. Volgens een Poisson-verdeling, wanneer er minder dan 1 / 3 van de putten te geven product, is er een 80% kans van het PCR-product wordt resultante van versterking van een enkele cDNA-molecuul. SGS heeft het voordeel ten opzichte van het klonen van het niet worden onderworpen aan resampling en niet wordt vertekend door PCR-geïntroduceerde recombinatie 19. Echter, de versterking succes van SCA en SGS zijn afhankelijk van primer design. Beide testen zijn ontwikkeld voor HIV-1 subtype B, maar kan worden aangepast voor andere subtypen en andere regio&#39;s van het genoom door het veranderen van primers, probes, en normen.

Kwantificeren niveaus van HIV-1 RNA in het plasma en de volgorde single HIV-1 genoom van individuen met een viral load onder de detectielimiet (50-75 kopieën / ml) is moeilijk. Hier beschrijven we hoe te winnen en te kwantificeren plasma virale RNA met behulp van een real-time PCR-test die een betrouwbare maatregelen HIV-1 RNA beneden tot 0,3 kopieën / ml en hoe virale genomen versterken door enkele genoom, van monsters met een zeer lage viral load.

Versterken en kwantificeren van HIV-1 RNA in HIV-geïnfecteerde personen met een viral load onder de limiet van de Opsporing van Standard Clinical Assays

Amplificatie van virale genen en kwantificering van HIV-1 RNA bij HIV-1 geïnfecteerde individuen met virale belastingen onder de detectielimiet van standaardassays (onder ...

In deze video worden methoden gedemonstreerd voor het kwantificeren en sequensen van enkele HIV-genomen van individuen met virale ladingen van minder dan 50 kopieën per milliliter plasma. Eerst wordt een buis met zeven milliliter plasma gecentrifugeerd om een pellet te vormen. Vervolgens wordt het virus-RNA geëxtraheerd om het niveau van HIV-1 te kwantificeren.Er wordt een single-copy assay uitgevoerd waarbij het RNA wordt reverse getranscribeerd, op een 96-wells plaat met standaarden en controles wordt geladen en wordt onderworpen aan kwantitatieve real-time PCR. Het niveau van viremie wordt vervolgens berekend op basis van het inputvolume plasma. Om de virale populatie te karakteriseren, kunnen hoeveelheden van slechts 0,3 kopieën per milliliter worden gedetecteerd.Er wordt een enkele genoomsequencing-assay uitgevoerd waarbij cDNA dat is getranscribeerd uit viraal RNA over een 96-wells plaat wordt verdeeld om een eindpuntverdunning te bereiken. Vervolgens wordt een nested PCR uitgevoerd om virale genomen te amplificeren. Als 30% of minder van de PCR-reacties positief zijn voor een bepaald monster, duidt dit op de amplificatie van een enkele kopie cDNA.Deze monsters worden vervolg

amplifying-quantifying-hiv-1-rna-hiv-infected-individuals-with-viral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Source: Scarborough, R. J., et al. Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates a reverse transcriptase (RT) assay to assess the effect of a test RNA on virus-like particle (VLP) production. Cells are co-transfected with plasmids, and RT activity is measured as a quantitative indicator of VLP output. A decrease in RT activity reflects suppression of viral gene expression by the test RNA.

Reverse Transcriptase Activity as a Marker for Virus-Like Particle Production

Er is een protocol gegeven voor het ontwikkelen van een real-time recombinase polymerase-amplificatietest om de initiële concentratie van DNA-monsters te kwantificeren met behulp van een thermische cycler of een microscoop en een stage-heater. Ook beschreven is de ontwikkeling van een interne positieve controle. Scripts zijn gegeven voor het verwerken van ruwe real-time fluorescentiegegevens.

Ontwikkeling van een kwantitatieve Recombinase Polymerase Amplificatie test met een interne positieve controle

We beschrijven hier een eenvoudige en snelle papieren DNA extractiewerkwijze HIV provirale DNA uit vol bloed gedetecteerd met kwantitatieve PCR. Dit protocol kan worden verlengd voor gebruik bij het detecteren andere genetische merkers of alternatieve amplificatiewerkwijzen.

Filtratie Isolatie van nucleïnezuren: Een eenvoudige en snelle DNA Extraction Method

Methoden om de werkzaamheid en toxiciteit van RNA-moleculen die zich richten op post-integratie stappen van de HIV-1 replicatiecyclus te evalueren, worden beschreven. Deze methoden zijn nuttig voor het screenen van nieuwe moleculen en het optimaliseren van de indeling van bestaande.

Evaluatie van de effectiviteit en toxiciteit van RNA&#39;s Targeting HIV-1 productie voor gebruik in Gene of Drug Therapy

Beschreven is een methode om te kwantificeren van de expressie van genen die 96 en 18 oppervlakte eiwitten door afzonderlijke cellen ex vivo, waardoor voor de identificatie van differentially uitgedrukte genen en proteïnen in virus-geïnfecteerde cellen ten opzichte van niet-geïnfecteerde cellen. Passen we de aanpak van de studie SIV-geïnfecteerde CD4+ T cellen geïsoleerd van rhesus makaken.

Eencellige kwantificatie van mRNA en oppervlak eiwituitdrukking in Simian Immunodeficiëntie Virus-geïnfecteerde CD4+ T cellen geïsoleerd van Rhesus Makaken

Full-length individuele proviraal sequencing (FLIPS) een efficiënte en hoog-productie methode voorziet in de versterking en sequentiebepaling van één, in de buurt van full-length (intact en defecte) HIV-1 proviruses en zorgt voor de bepaling van hun potentieel replicatie-competentie. FLIPS overwint beperkingen van eerdere tests ontworpen om de volgorde van het latente reservoir van HIV-1.

Versterking van in de buurt van Full-length HIV-1 Proviruses voor Next-Generation Sequencing

Real-time kwantitatieve polymerase kettingreactie analyse gecombineerd met omgekeerde transcriptie (RT-qPCR) is wijd verbeid gebruikt voor het meten van het niveau van de RNA-virusinfecties. Hier presenteren we een directe RT-qPCR assay, die niet een RNA-zuivering hoeft, ontwikkeld voor de kwantificering van verschillende RNA virussen, met inbegrip van dengue virus.

Meten van Dengue Virus RNA in het Supernatant van cultuur van geïnfecteerde cellen door Real-time kwantitatieve Polymerase-kettingreactie

Hier presenteren we een diepe rangschikken benadering waarmee een onbevooroordeelde bepaling van ontluikende 3'-termini en vogelgriepvirus profielen van single-stranded DNA moleculen. De belangrijkste toepassing is de karakterisatie van ontluikende retrovirale complementaire Ani (cDNAs), de tussenproducten die tijdens het proces van retrovirale omgekeerde transcriptie gegenereerd.

Bepalende 3'-Termini en sequenties van ontluikende Single-Stranded virale DNA moleculen tijdens HIV-1 Reverse transcriptie in geïnfecteerde cellen

RNA haarspelden en lussen kunnen fungeren als primers voor reverse transcriptie (RT) bij afwezigheid van sequentie-specifieke primers, interfereren met de studie van overlappende antisense transcripten. We hebben een techniek ontwikkeld die in staat is om streng-specifiek RNA te identificeren, en we hebben het gebruikt om HIV-1 antisense Protein ASP te bestuderen.

Detectie van humaan immunodeficiëntie virus type 1 (HIV-1) antisense protein (ASP) RNA transcripten bij patiënten door onderdeel-specifieke RT-PCR

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor een fluorescentiebeeldvormingsbenadering, multiplex immunofluorescent cell-gebaseerde detection van DNA, RNA en protein (MICDDRP), een methode die in staat is tot gelijktijdige fluorescentie eencellige visualisatie van virale eiwitten en nucleïnezuren van verschillende type en gestrandheid. Deze aanpak kan worden toegepast op een breed scala aan systemen.

Eencellige multiplexed fluorescentie beeldvorming om virale nucleïnezuren en eiwitten te visualiseren en HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika-virus en influenza-infectie te controleren

Leer HIV-1 RNA kwantificeren en enkelvoudige genoomsequentie uitvoeren bij lage virale ladingen met real-time PCR. Deze methode detecteert tot 0,3 kopieën/ml en ondersteunt virologisch onderzoek.

Versterken en kwantificeren van HIV-1 RNA in HIV-geïnfecteerde personen met een viral load onder de limiet van de Opsporing van Standard Clinical Assays (Video) | JoVE Journal

Versterken en kwantificeren van HIV-1 RNA in HIV-geïnfecteerde personen met een viral load onder de limiet van de Opsporing van Standard Clinical Assays

Meer video's verkennen