Name: Single Lees en Gepaarde End mRNA-Seq Illumina Bibliotheken van 10 nanogram Totaal RNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 49 s
Description: Leer hoe je Illumina mRNA-Seq bibliotheken maakt van slechts 10 nanogram totaal RNA met T7 lineaire amplificatie. Deze methode maakt genexpressieanalyse mogelijk van moeilijk verkrijgbare celpopulaties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door financiering uit het Morgridge Instituut voor Onderzoek en de Universiteit van Wisconsin Foundation. Wij danken Krista Eastman voor redactionele ondersteuning.

<ol><li>Tang, F., Barbacioru, C., Wang, Y., Nordman, E., Lee, C., Xu, N., Wang, X., Bodeau, J., Tuch, B. B., Siddiqui, A., Lao, K., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6, 377-382 (2009).</li>
<li>Armour, C. D., Castle, J. C., Chen, R., Babak, T., Loerch, P., Jackson, S., Shah, J. K., Dey, J., Rohl, C. A., Johnson, J. M., Raymond, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+transcriptome+profiling+using+selective+hexamer+priming+for+cDNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Digital transcriptome profiling using selective hexamer priming for cDNA synthesis.</a> Nature Methods. 6, 647-649 (2009).</li>
<li>Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nature Methods. 5, 621-628 (2008).</li>
<li>Mamanova, L., Andrews, R. M., James, K. D., Sheridan, E. M., Ellis, P. D., Langford, C. F., Ost, T. W., Collins, J. E., Turner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRT-seq+amplification-free%2C+strand-specific+transcriptome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">FRT-seq amplification-free, strand-specific transcriptome sequencing.</a> Nature Methods. 5, 130-132 (2010).</li>
<li>Sengupta, S., Ruotti, V., Bolin, J., Elwell, A., Hernandez, A., Thomson, J., Stewart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+consistent%2C+fully+representative+mRNA-Seq+libraries+from+ten+nanograms+of+total+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Highly consistent, fully representative mRNA-Seq libraries from ten nanograms of total RNA.</a> Biotechniques. 49, 898-904 (2010).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome.+Biology%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome. Biology. 10, R25-R25 (2009).</li>
<li>Li, B., Ruotti, V., Stewart, R. M., Thomson, J. A., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+gene+expression+estimation+with+read+mapping+uncertainty%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq gene expression estimation with read mapping uncertainty.</a> Biotechniques. 26, 493-500 (2010).</li>
<li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>mRNA-Seq-8 Sample Prep Kit [Internet]. , Illumina. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.illumina.com/products/mrna_seq_8_sample_prep_kit.ilmn">http://www.illumina.com/products/mrna_seq_8_sample_prep_kit.ilmn</a> Forthcoming.</li>
<li>ScriptSeq mRNA-Seq Library Preparation Kit (Illumina -compatible) Epicentre [Internet]. , Epicenter. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.epibio.com/item.asp?id=578">http://www.epibio.com/item.asp?id=578</a> Forthcoming.</li>
</ol>

De auteurs beschrijven dat JAT is een oprichter, stockowner, adviseur en bestuurslid van Cellular Dynamics International (CDI). Hij fungeert ook als wetenschappelijk adviseur en heeft financiële belangen in Tactics II Stem Cell Ventures.

Huidige protocollen voor het maken van gekoppelde eind bibliotheken vereisen tussen 1 ug 9 tot 2,5 microgram 10 basisbedrag van totaal RNA. Hier presenteren we onze lineaire T7 versterking op basis van (T7LA) methode om zowel de single lezen en is afgestemd op het einde Illumina-sequencing bibliotheken en tonen voor te bereiden dat deze methode maakt het mogelijk genereren van bibliotheken uit zo laag als 10 ng totaal RNA, het produceren van gegevens die vergelijkbaar is met dat van minimaal versterkt (MinAmp) bibliotheken gemaakt van een factor 1000 meer uitgangsmateriaal (10 ug totaal RNA). De 10 ng bibliotheken niet alleen identificeren vergelijkbaar totaal aantal genen, maar produceren ook genexpressie handtekeningen die vergelijkbaar zijn met (de figuren 3a en b). Bovendien zijn zowel de single te lezen en is afgestemd op het einde bibliotheken geproduceerd door de T7LA methode zijn erg op elkaar lijken (figuur 3c), waarmee onderzoekers te vergelijken gegevens die worden gegenereerd door bibliotheken gemaakt van een protocol. Aangezien deze bibliotheken werden bereid uit menselijke embryonale stamcellen RNA, zochten we naarvoor 30 stamcel specifieke genen bij de bibliotheken en vind dat bijna al deze genen (93-100%) zijn geïdentificeerd door de bibliotheken gemaakt van ten minste 10 ng van het starten van totaal RNA (figuur 4), waardoor het valideren van ons protocol. Wij geloven dat ons protocol zou zeer nuttig zijn voor onderzoekers, vooral in omstandigheden zoals stroom gesorteerd cellen of laser-, micro-ontleed weefsel waar de grondstof is beperkt. In dergelijke omstandigheden zou ons protocol laten generatie van genexpressie data te vergelijken met bibliotheken gemaakt van veel grotere hoeveelheden te beginnen, omdat ons protocol produceert expressie profielen vergelijkbaar zijn tussen minstens drie ordes van grootte van het starten van RNA.

<table border="1"><tbody><tr><td> Vennootschap </td><td> Kit / Reagens </td><td> Catalog # </td><td> Bijzondere opmerkingen </td></tr><tr><td> Ambion </td><td> Fragmentatie reagens </td><td> AM8740 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> Liner Acrylamide </td><td> AM9520 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> MEGAscript T7 Kit </td><td> AM1334 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> Niet DEPC behandeld nuclease gratis water </td><td> AM9932 </td><td></td></tr><tr><td> Fermentas </td><td> dNTP set </td><td> R0181 </td><td></td></tr><tr><td> Fermentas </td><td> gemethyleerd dNTPs </td><td> R0431 </td><td> Voor Single Lees sample prep alleen </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq SR Cluster Generation kit v5 </td><td> GD-203-5001 </td><td> Voor Single Lees sample prep alleen </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq Seq Kit v5 36 cycli </td><td> FC-104-5001 </td><td></td></tr><tr><td> Illumina </td><td> Chip Seq Sample Prep Kit </td><td> IP-102-1001 </td&gt; <td> Voor Single Lees sample prep alleen. Kan worden vervangen met de nationale handhavingsinstanties DNA-monster prep Master Mix Set 1 Cat # E6040S </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq PE Cluster Generation kit v5 </td><td> PE-203-5001 </td><td> Voor gepaarde einde sample prep alleen </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> Gepaarde Einde Sample Prep Kit </td><td> PE-102-1001 </td><td> Voor gepaarde einde sample prep alleen </td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> 1KB plus ladder </td><td> 10787-018 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. coli RNase H </td><td> 18021-014 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> RNase Out </td><td> 10777-019 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> 2e streng buffer 5x </td><td> 10812-014 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. coli DNA-polymerase </td><td> 18010-017 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E-gel SYBR safe 2% </td><td> G521802 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Superscript III (met 5x FS buffer en 0,1 M DTT) </td><td> 18080-085 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> TRIzol </td><td> 12183555 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> RNA quibit testkit </td><td> Q32852 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> dsDNA HS qubit testkit </td><td> Q32851 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. coli DNA-ligase </td><td> 18052-019 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> T4 DNA-polymerase </td><td> 18005-025 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Ultra Pure Dnase RNase water </td><td> 10977-015 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Superscript II dubbelstrengs cDNA synthese kit </td><td> 11917-020 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Random Primer (Invitrogen) </td><td> 48190-011 </td><td> Voor gepaarde einde sample prep alleen </td></tr><tr><td> IDT </td><td> Not1Nonamer B primer </td><td> N / A </td><td> Voor Single Lees samPLE prep alleen </td></tr><tr><td> IDT </td><td> Oligo dT T7 </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> NEB </td><td> Not1 spijsvertering kit </td><td> R0189S </td><td> Voor Single Lees sample prep alleen </td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> RNeasy Minelute kit </td><td> 74204 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> RNeasy Mini Kit (50) </td><td> 74104 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Gel zuivering kit </td><td> 28604 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> DNase set </td><td> 79254 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> RNeasy MinElute kit </td><td> 74204 </td><td></td></tr><tr><td> Zymo Onderzoek </td><td> DNA schoon en concentrator (250X) </td><td> D4014 </td><td></td></tr></tbody></table>

single lees en gepaarde end mrna-seq illumina bibliotheken van 10 nanogram totaal rna

Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA

Hele transcriptoom sequentiebepaling door mRNA-Seq wordt nu op grote schaal gebruikt om globale gen-expressie, mutatie, allel-specifieke expressie en andere genoom-brede analyses uit te voeren. mRNA-Seq opent ook de poort voor genexpressie analyse van niet-gesequenced genoom. mRNA-Seq biedt een hoge gevoeligheid, een groot dynamisch bereik en maakt het meten van transcript kopie nummers in een monster. Illumina&#39;s genoom analyse voert sequencen van een groot aantal (&gt; 10 7) van de relatief korte reeks leest (&lt;150 bp). De &#39;gepaarde end &quot;-benadering, waarin een enkele lange lezen is gesequenced aan beide de uiteinden, maakt voor het volgen van alternatieve splice knooppunten , inserties en deleties, en is nuttig voor de novo transcriptoom montage. Een van de belangrijkste uitdagingen voor onderzoekers is een beperkte hoeveelheid uitgangsmateriaal. Bijvoorbeeld, in experimenten waarbij cellen worden geoogst met behulp van laser micro-dissectie, beschikbaar vanaf totaal RNA may te meten in nanogram. Voorbereiding van de mRNA-Seq bibliotheken van dergelijke monsters zijn beschreven 1, 2 maar brengt grote PCR-amplificatie, dat kan invoeren bias. Andere RNA-Seq bibliotheek constructie met een minimum aan procedures PCR-amplificatie zijn gepubliceerd 3, 4 maar vereisen microgram hoeveelheden van het starten van totaal RNA. Hier beschrijven we een protocol voor de Illumina Genome Analyzer II-platform voor mRNA-Seq sequencing voor bibliotheek voorbereiding die belangrijk PCR-amplificatie vermijdt en vereist slechts 10 nanogram totaal RNA. Hoewel dit protocol is eerder beschreven en gevalideerd voor single-end sequencing 5, waar het werd aangetoond dat directionele bibliotheken te produceren zonder invoering van aanzienlijke versterking bias, hier zijn we verder valideren voor gebruik als een gekoppelde end protocol. We selectief versterken gepolyadenyleerde messenger RNA&#39;s kan starten totaal RNA met behulp van de T7-gebaseerde Eberwine lineaire versterking methode, bedacht &quot;T7LA &quot;(T7 lineaire versterking). De geamplificeerde poly-A mRNA&#39;s zijn gefragmenteerd, reverse getranscribeerd en adapter geligeerd aan de uiteindelijke volgorde bibliotheek te maken. Voor zowel de single lezen en gekoppeld einde loopt, sequenties worden toegewezen aan de menselijke transcriptoom 6 en zodat genormaliseerde Gegevens uit meerdere runs kunnen worden vergeleken. We verslag van de genexpressie gemeten in eenheden van transcripten per miljoen (TPM), die een superieure maatregel om RPKM bij het ​​vergelijken van samples 7.

Hier beschrijven we een methode voor de bereiding van zowel de single lezen en gekoppeld end Illumina mRNA-Seq sequencing bibliotheken voor genexpressie analyse op basis van T7-RNA lineaire versterking. Dit protocol vereist slechts 10 nanogram van het starten van totaal RNA en genereert een uiterst consistente bibliotheken vertegenwoordigt hele transcripten.

Single Lees en Gepaarde End mRNA-Seq Illumina Bibliotheken van 10 nanogram Totaal RNA

Whole transcriptome sequencing via mRNA-Seq wordt nu uitgebreid gebruikt voor het uitvoeren van globale genexpressieanalyse, mutatieanalyse, allelspecifieke expressie en andere ...

Het algemene doel van deze procedure is het genereren van Illumina mRNA-sequentiebibliotheken vanuit kleine hoeveelheden startmateriaal. De eerste stap van de procedure is het reverse transcriberen van totaal RNA met DTT zeven primers om cDNA te produceren. Het cDNA wordt gebruikt voor RNA-amplificatie via in vitro transcriptie. Vervolgens wordt het geamplificeerde RNA onderworpen aan willekeurige fragmentatie.Omgekeerde transcriptie van het gefragmenteerde RNA produceert cDNA, dat vervolgens adapterligatie, selectie op grootte en PCR-amplificatie ondergaat. Uiteindelijk laat dit protocol het genexpressieprofiel van het monster zien door middel van de meting van genkopiegetallen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat er slechts 10 nanogram starttotaal RNA nodig is.Dat is orden van grootte minder dan wat vereist is bij andere bestaande protocollen. Bovendien kunnen er gepaarde bibliotheken worden gegenereerd vanuit zulke kleine starthoeveelheden RNA. Deze methode stelt wetenschappers in staat om nieuwe biologische vragen te onderzoeken door de bepaling van genexpressieprofielen mogelijk te maken vanuit moeilijk te verkrijgen celpopulaties, zoals die verkregen via laser capture microdissectie of flowcytometrie.Het idee voor de ontwikkeling van deze methode ontstond toen we genexpressieprofielen moesten opstellen van een zeer beperkt aantal cellen die gedifferentieerd waren uit humane amnistische stamcellen. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de stappen voor de RNA-verwerking moeilijk aan te leren zijn vanwege de zeer kleine hoeveelheid RNA die gemakkelijk kan degraderen. De procedure zal worden gedemonstreerd door Angela Elwell, Jennifer Bolen en Baal Kimm Wynn uit mijn laboratorium.De methode voor het parallel voorbereiden van zowel single read als paired end sequencing-libraries is een procedure met meerdere stappen, zoals weergegeven in dit stroomdiagram. Eerst wordt totaal RNA geïsoleerd uit de cellen of weefsels van belang en gebruikt om dubbelstrengs cDNA voor te bereiden. Polyadenylatie messenger-RNA's worden vervolgens selectief geamplificeerd uit het cDNA met behulp van de T7-gebaseerde lineaire amplificatiemethode. Vervolgens wordt het geamplificeerde poly(A) willekeurig gefragmenteerd.Nadat het gefragmenteerde RNA is gezuiverd, wordt het teruggetranscribeerd naar cDNA. Het cDNA wordt aan de uiteinden hersteld en er worden basen toegevoegd aan het 3'-uiteinde van de DNA-fragmenten. Daarna worden er adapters aan het DNA geligeerd en wordt er een Not1-digestie uitgevoerd. In het geval van de single-read library wordt de DNA-library vervolgens geïsoleerd door middel van gelzuivering en geamplificeerd via PCR om de Illumina-adapters te ligeren.Ten slotte, nadat de DNA-bibliotheek is gekwantificeerd, is deze klaar voor sequencing. Ten behoeve van deze video zullen slechts geselecteerde procedures binnen dit protocol worden gedemonstreerd. De reverse transcriptie van de gefragmenteerde polyA mRNA's naar cDNA omvat eerste-streng- en tweede-strengsynthese.Voeg voor de synthese van de eerste streng voor de single read-library de volgende reagentia toe aan een PCR-buis: 10 µL gefragmenteerd poly mRNA en 1 µL Not1 random nonameer-primer. De sequentie van de Not1 nonameer-primer wordt hier getoond. De 5'-proximale sequentie in het groen is de Not1 restrictieplaats.Terwijl de in blauw getoonde sequentie het omgekeerde complement is van de adapter B-sequentie van Illumina uit de chip sequence kit, wordt het mengsel vijf minuten bij 70 °C geïncubeerd in de thermocycler en vervolgens snel op ijs afgekoeld. Voeg terwijl het mengsel op ijs blijft de volgende reagentia uit de superscript 3 kit toe: 4 µL 5x first strand buffer, 2 µL DTT en 1,5 µL DNTP-mengsel. Gebruik in het DNTP-mengsel 5-methyl-dCTP in plaats van dCTP. Plaats de buis in de thermocycler bij 42 °C gedurende twee minuten en voeg vervolgens 1 µL superscript 3 reverse transcriptase toe en incubeer dit gedurende één uur bij 42 °C.Stel vervolgens de reactie op voor de synthese van de eerste streng voor de para-end bibliotheek. Voeg de volgende reagentia toe aan een PCR-buis: 10 µL gefragmenteerd poly NNA en 1 µL random hexameer primer. Incubeer vijf minuten bij 65 °C in de thermocycler en koel vervolgens snel af op ijs.Voeg, terwijl de buis op ijs wordt gehouden, de volgende reagentia uit de superscript three First strand kit toe: 4 µL van de 5x first strand buffer, 2 µL DTT en 1,5 µL dNTPs. Incubeer in de thermocycler bij 45 °C gedurende één minuut. Voeg vervolgens 1 µL superscript three, reverse transcriptase toe en incubeer bij 45 °C gedurende één uur.Beide reacties zijn nu klaar voor de synthese van de tweede streng. Voeg aan elk van de mengsels op ijs de volgende reagentia uit de superscript twee kit toe: 91 µL gedestilleerd water, 30 µL 5x second strand buffer, 3 µL dNTP's, 1 µL E. coli DNA-ligase, 4 µL E. coli DNA-polymerase en 1 µL E. coli RNase H. Meng elke buis door deze om te keren, centrifugeer vervolgens kort en incubeer gedurende twee uur bij 16 °C.Voor de end-repair van het cDNA voor de single-read library worden de volgende reagentia toegevoegd aan 40 µL gezuiverd cDNA: 5 µL T4 DNA ligasebuffer met 10 mM ATP, 2 µL dNTP-mix, 1 µL T4 DNA-polymerase, 1 µL Klenow-enzym en 1 µL T4 PNK. Voor de paired-end library worden deze reagentia toegevoegd aan 30 µL gezuiverd cDNA: 45 µL RNase-vrij water.10 µL T4 DNA-ligasebuffer met 10 mM ATP, 4 µL van een 10 mM dNTP-mix, 5 µL T4 DNA-polymerase, 1 µL klenow-enzym en 5 µL T4 PNK. Incubeer beide buisjes in de thermocycler bij 20 °C gedurende 30 minuten voor de endrepair.De volgende stap in dit protocol is het toevoegen van adeninebasen aan het 3'-uiteinde van de DNA-fragmenten voor de single read-library. Bereid het volgende reactiemengsel: 34 µL DNA-monster, 5 µL klino-buffer, 10 µL dATP en 1 µL klino exo. Bereid voor de paired end-library het volgende reactiemengsel: 32 µL DNA-monster en 5 µL clin out-buffer.Incubeer 10 µL DATP en drie µL clin out exo van beide reactiemengsels gedurende 30 minuten bij 37 °C voordat de reacties voor adapterligatie worden opgezet. Ontdooi de adapters op ijs en verdun deze 1:20 voor de single read-library. Gebruik de Illumina chip sequence sample prep kit om het volgende reactiemengsel voor te bereiden: 10 µL DNA-monster, één µL adapter oligo mix, 15 µL 2X DNA Ligase-buffer en vier µL DNA Ligase; incubeer dit gedurende 15 minuten.Gebruik bij kamertemperatuur voor de paired-end bibliotheek de Illumina paired end sample prep kit om de volgende reactie voor te bereiden. Meng 10 µL DNA-monster, 10 µL PE-adapter oligo-mix, 25 µL twee X DNA-ligase-buffer en 5 µL DNA-ligase; incubeer gedurende 15 minuten bij 20 °C aan het einde van de respectievelijke incubaties. Reinig beide ligatiereacties met behulp van XMO-kolommen.Elueer de single-read library en 44 µL water; elueer de paired-end library met zes µL illusiebuffer, gevolgd door een tweede elutie in vijf µL EB. Voer een Not1-digestie alleen uit voor de single-read library. Incubeer gedurende twee uur tot overnacht bij 37 °C en zuiver vervolgens de reactie met behulp van een ZY IMO-kolom.Elueer de single read-library met zes µL buffer EB, gevolgd door een tweede verdunning met vijf µL EB. Het adapter-geligaeerde DNA voor beide libraries is nu klaar voor selectie op grootte. De procedure voor selectie op grootte van het adapter-geligaeerde DNA wordt uitgevoerd met een 2% Cyber Safe EE van Invitrogen; start deze procedure door programma nul (pre-run) gedurende twee minuten uit te voeren.Laad na de voorbereidende run 10 µL van de one KB plus ladder en de 2D NA-monsters. Vul de lege banen met 10 µL water en start het runprogramma. Voer een egel 2%run uit gedurende 28 minuten.Wanneer de run is voltooid, selecteer dan de gelplakjes van 200 tot 300 baseparen met een nieuw scheermesje. Het aantal genen geïdentificeerd door de verschillende bibliotheken werd geëvalueerd, en deze tabel toont informatie over de clusternummers. Foutpercentage van de geïdentificeerde genen en het percentage alignment van de single read- en paired end-bibliotheken voor zowel de single read- als de paired end-bibliotheken.De 10 nanogram T7 LA-bibliotheken identificeerden bijna hetzelfde aantal genen als de 10 microgram niet-geamplificeerde bibliotheken met een TPM van 10 of hoger. In het geval van de single-read bibliotheken identificeerde de 10 nanogram T7 LA-bibliotheek 100% van de 8.500 genen die werden geïdentificeerd door de 10 microgram niet-geamplificeerde bibliotheek voor paradigma-bibliotheken. De 10 nanogram T7 LA-bibliotheek identificeerde 86% van de genen die werden geïdentificeerd door de 10 microgram niet-geamplificeerde bibliotheek.Bibliotheken gemaakt van minder dan 10 nanogram waren niet in staat om evenveel genen te identificeren. In het protocol voor enkelvoudige reads identificeerde de bibliotheek van één nanogram T seven LA bijvoorbeeld slechts ongeveer 50% van de genen die door de 10 microgram min amp-bibliotheek werden geïdentificeerd. Daarom moet de minimale hoeveelheid totaal RNA voor gebruik met het T seven LA-protocol worden beperkt tot 10 nanogram voor de mapping van een housekeeping-gen.GA DH laat zien dat alle T zeven LA-bibliotheken die zijn gemaakt met ten minste 10 nanogram start-RNA alle exonen hebben geïdentificeerd, inclusief het uiterste vijf-prime-exon. De schaalbalk aan de linkerkant voor de bibliotheken met enkele reads geeft 350 totale reads aan. De schaalbalk in het midden voor de DEN-bibliotheken geeft 5.000 totale reads aan.Een vergelijking van de 10 nanogram T seven LA single read- en paired end-libraries met de min amp-libraries laat een hoge mate van gelijkenis zien. Een Spearman-correlatie van 0,90 werd verkregen tussen de single read 10 nanogram T seven LA-library en de 10 microgram min amp-library, en een correlatie van 0,95 werd verkregen tussen de PEREN 10 nanogram T seven LA-library en de 10 microgram min amp-library. Daarnaast is een vergelijking gemaakt tussen de twee single read- en peren-libraries vervaardigd uit 10 nanograms totaal RNA, waarbij de zeer hoge correlatiecoëfficiënt aantoont dat beide typen libraries die met het T seven LA-protocol zijn gemaakt, een zeer vergelijkbare genexpressiesignatuur produceren.Ten slotte, aangezien deze bibliotheken werden geprepareerd uit RNA van menselijke embryonale stamcellen (30 stamcellen), werd er in de bibliotheken gezocht naar specifieke genen. Bijna al deze genen werden geïdentificeerd in de bibliotheken die waren gemaakt van ten minste 10 nanogram starttotaal-RNA, wat dit protocol valideert. Tijdens het uitvoeren van dit protocol is het belangrijk om te onthouden dat de kleine RNA-monsters met uiterste voorzichtigheid moeten worden behandeld om degradatie te voorkomen.Na het bekijken van deze video zou u een zeer goed begrip moeten hebben van hoe u Illumina-, Mr.Aeq single read- en Paradigm-libraries bereidt vanuit zeer kleine hoeveelheden startmateriaal.

single-read-paired-end-mrna-seq-illumina-libraries-from-10-nanograms

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

MicroRNA's (miRNA's) zijn een wijdverspreid geconserveerde klasse van regulerende moleculen. Hier beschrijven we een miRNA-kloonmethode die afhankelijk is van twee krachtige ligatiefasen gevolgd door high-throughput sequencing. Onze methode maakt nauwkeurige genoom-wide kwantificering van miRNA's mogelijk.

Zeer efficiënte Ligatie van Kleine RNA-moleculen voor MicroRNA Kwantificering van High-throughput sequencing

Dit protocol beschrijft het combinatorische gebruik van ChIP-seq, 4sU-seq en totaal RNA-seq ribosoom profilering voor cellijnen en primaire cellen. Hierdoor wijzigingen bijhouden in transcriptiefactor bindend, DOVO transcriptie, RNA-verwerking, omzet en vertaling na verloop van tijd, en de algemene gang van zaken in geactiveerd en/of snel veranderende cellen weer te geven.

Real-time analyse van transcriptiefactor bindend, transcriptie, vertaling en omzet globale u gebeurtenissen wilt weergeven tijdens de activatie van de cellulaire

Dit protocol laat zien hoe om te zuiveren van extracellulaire microRNAs van cel voedingsbodems voor kleine RNA bibliotheek constructie en de volgende generatie sequencing. Verschillende kwaliteitscontrole controlepunten worden beschreven om lezers te begrijpen wat u kunt verwachten wanneer u werkt met lage input monsters als exRNAs.

Isoleren, Sequencing en analyseren van extracellulaire MicroRNAs van menselijke mesenchymale stamcellen

Nanogaatje sequencing is een nieuwe technologie die het mogelijk maakt kosteneffectieve sequencing in afgelegen locaties en resource-arme instellingen. Hier, presenteren wij een protocol voor het rangschikken van mRNAs van geheel bloed dat met dergelijke voorwaarden compatibel is.

Het rangschikken van mRNA van geheel bloed gebruikend Nanogaatje het rangschikken

We presenteren een gedetailleerd klein RNA Library Reparatie protocol met minder bias dan standaardmethodes en een verhoogde gevoeligheid voor 2 '-O-methyl rna's. Dit protocol kan worden gevolgd met behulp van zelfgemaakte reagentia om kosten te besparen of kits te gebruiken voor het gemak.

Verbetering van kleine RNA-SEQ: minder bias en betere detectie van 2 '-O-methyl Rna's

We beschrijven een techniek voor het profileren van microRNAs in vroege muisembryo's. Dit protocol overwint de uitdaging van lage celinput en kleine RNA-verrijking. Deze test kan worden gebruikt om veranderingen in miRNA expressie na verloop van tijd te analyseren in verschillende celvormen van het vroege muisembryo.

Voorbereiding van kleine RNA-bibliotheken voor sequencing van vroege muisembryo's

Hier beschrijven we de stadia van monsterverzameling en voorbereiding voor RIBO-seq bij bacteriën. Sequencing van de bibliotheken die volgens deze richtlijnen zijn opgesteld, resulteert in voldoende gegevens voor een uitgebreide bio-informatische analyse. Het protocol dat we presenteren is eenvoudig, maakt gebruik van standaard laboratoriumapparatuur en duurt zeven dagen van lysis tot het verkrijgen van bibliotheken.

RIBO-seq in Bacteria: een Sample Collection and Library Preparation Protocol voor NGS Sequencing

Absolute kwantificering RNA-sequencing (AQRNA-seq) is een technologie die is ontwikkeld om het landschap van alle kleine RNA's in biologische mengsels te kwantificeren. Hier worden zowel de bibliotheekvoorbereidings- als de gegevensverwerkingsstappen van AQRNA-seq gedemonstreerd, waarbij veranderingen in de transfer-RNA (tRNA)-pool in Mycobacterium bovis BCG worden gekwantificeerd tijdens door uithongering veroorzaakte rustperiode.

AQRNA-seq voor het kwantificeren van kleine RNA's

Grootschalige Schermen van Metagenomic Bibliotheken

RNA-extractie uit Neuroprecursor cellen met behulp van de Bio-Rad Totaal RNA Kit

Leer hoe je Illumina mRNA-Seq bibliotheken maakt van slechts 10 nanogram totaal RNA met T7 lineaire amplificatie. Deze methode maakt genexpressieanalyse mogelijk van moeilijk verkrijgbare celpopulaties.

Single Lees en Gepaarde End mRNA-Seq Illumina Bibliotheken van 10 nanogram Totaal RNA

Meer video's verkennen