Name: Gekoppelde Nanoinjection en Elektrofysiologie test voor het screenen op bioactiviteit van verbindingen met behulp van de Drosophila melanogaster Giant Fiber System (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Leer nanoinjectie en elektrofysiologie voor het testen van neuromodulerende verbindingen met behulp van het Giant Fiber System van Drosophila melanogaster. Deze methode maakt real-time monitoring van bioactiviteit mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij willen de leden van de Mari-lab en de Godenschwege lab, te erkennen in het bijzonder Aline Yonezawa, voor commentaar en hulp bij dit protocol. Dit werk werd gefinancierd door het Nationaal Instituut voor Neurologische Aandoeningen en Stroke subsidie ​​R21NS06637 naar FM-en TAG; AB werd gefinancierd door de National Science Foundation Award nummer 082925, URM: Integratieve Biologie voor toekomstige onderzoekers.

1. Elektrofysiologie Rig Set-up <ol><li> De benodigde apparatuur voor de elektrofysiologie rig set-up wordt in detail beschreven door Augustin et al.. In dit Journal 14. Raadpleeg dit artikel voor een uitgebreide uitleg van de benodigde elektrofysiologische apparaten. </li><li> Wijzig de eerder beschreven elektrofysiologie rig set-up 14 door het toevoegen van een zesde micromanipulator, die de nanoinjector houdt. Voor een gemakkelijke toegang tot de kop van het dier dient te worden geplaatst tussen de twee elektrode micromanipulators zoals weergegeven in figuur 2. </li><li> Voordat het experiment dat een comfortabel reeks alle draaiingsassen met micromanipulators, en dat alle elektroden en de injectie micropipet (stap 2) kan het dier komen. </li></ol> 2. Nanoinjection Set-up <ol><li> De nanoinjection set-up vereist een Nanoliter2000 (Precisi Wereldop instrumenten, Sarasota, FL, USA) of een dergelijke injector dat gecontroleerde injecties kunnen in nanoliter hoeveelheden. </li><li> Bereid injectienaald met behulp van de glazen micropipetten die bij de injector door te trekken ze naar een weerstand van 80-100 MΩ met een elektrode trekker. </li><li> Voor een soepele injecties het nodig te schuinen micropipetten een 11-17 micrometer opening een hoek van 45 graden (figuur 3). </li><li> Langzaam plantgat de injectie micropipet met synthetische olie met behulp van een injectiespuit Hamilton in opdracht van de Nanoliter2000 handleiding, ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen aanwezig zijn. </li><li> Zorgvuldig zet de micropipet op de nanoinjector en bereid het aan de verbinding te laden door het legen van het teveel aan olie in opdracht van de Nanoliter2000 handleiding. </li><li> Plaats de injector op de micromanipulator en laad de verbinding volgens de instructies in de Nanoliter2000 handleiding. Zorg ervoor dat het uiteinde van de micropipet niet breekt tijdens dezeprocedure. </li><li> Stel de gewenste hoeveelheid nanoliters te injecteren in de controle van de injector box van de instructies van de Nanoliter2000 handleiding. Let op dat de totale hoeveelheid geïnjecteerde niet 100 nl overschrijden. We hebben gevonden dat grotere hoeveelheden zout besturingsoplossingen kan de functie van de SBO circuit beïnvloeden. </li><li> Het is cruciaal om de injector losgekoppeld van de schakelkast tijdens opname verkrijging met uitzondering van de injectie zelf, daar de voeding van de nanoinjector interfereert met de opnamen, die zichtbaar is als ruis (figuur 4). Echter, de voeding niet los van de controle box omdat het opnieuw instellen. </li></ol> 3. Drosophila melanogaster Voorbereiding <ol><li> Verdoof 2 tot 6 dagen oud vliegen met CO 2 of op ijs zoals eerder beschreven 14,15. </li><li> Na immobiel, gebruik dan een pincet om het dier over te dragen aan een plaatje wie zachte tandartsen door het ophalen in haar benen. Houd er rekening mee dat een mannelijke fruitvlieg ongeveer 1,0 mg weegt en een vrouwelijke fruitvlieg weegt ongeveer 1,2 mg, dus stof-to-body gewicht verhouding is anders dan bij mannelijke versus vrouwelijke vliegen. Daarom is het aan te raden om slechts een geslacht te gebruiken voor de experimenten. </li><li> Zoals eerder beschreven 14,15, monteert de vlieg dorsale zijde naar boven en ervoor te zorgen dat de borstkas en het hoofd worden geïmmobiliseerd met een zachte tandartsen geplaatst rond het lichaam. Buig de vleugels uit, zodat ze loodrecht te maken op de thorax (figuur 2, C). De vlieg moeten met zo weinig mogelijk schade. </li></ol> 4. Gekoppelde Nanoinjection / elektrofysiologie <ol><li> Plaats de gemonteerde vlieg op de elektrofysiologie rig met zijn hoofd naar de stimulatie-elektroden. </li><li> Doorboor het dier met de bijbehorende stimulerende, grond-en registratie-elektroden zoals eerder beschreven 14,15 (Figure 2 C). Tenzij anders gewenst is, plaatst u een registratie-elektrode in de DLM en de andere in de TTM spier. De DLM spier bevindt zich in de borstkas tussen de voorste Dorso-Centraal haren en de middellijn van de vlieg. De TTM spier is gelegen nabij de vleugel bijlagen, tussen de achterste en voorste Supra-Alar haren van de vlieg 7. </li><li> Lijn de injectie micropipet die de verbinding met de middelste van de drie ocelli gelegen op de mediale achterste deel van de kop, maar nog niet injecteren (figuur 2 C). </li><li> Voor samengestelde injectie het verkrijgen van een baseline-opname van de GF aan TTM en GF in de routes van de Giant Fiber System (GFS, figuur 1) via hersenstimulatie DLM. Om dit te doen, activeert u de Giant Fibers (GFS) met 10 treinen van 10 stimuli (40-50 mV) elk gegeven voor een duur van 0,03 ms bij 100 Hz met een 1 seconde tussen de treinen 14,15 (figuur 4). Wild-type vliegt shOuld in staat zijn om een-op-een te volgen in dit tempo van de stimulatie voor zowel DLM en TTM paden. Gooi de vlieg als de GF om DLM en GF om TTM paden komen de 100 Hz stimulatie niet volgen in een verhouding van 1:1. </li><li> Naar continu stimulatie van de GF met enkele pulsen 1 Hz (figuur 4). </li><li> Snel de stekker van de injector in de schakelkast. Ook al achtergrondgeluid zal interfereren met de 1 Hz stimulatie-opnamen, niet stop te zetten. </li><li> Steek de injectie micropipet in de kop capsule van de vlieg net onder de cuticule, en injecteer de gewenste hoeveelheid van de verbinding in de hemolymfe van de vlieg met behoud van de 1 Hz stimulatie (figuur 4). Door de open bloedsomloop van de vlieg, wordt de gehele zenuwstelsel worden blootgesteld aan de verbinding binnen enkele seconden. Hoewel een bepaalde injectie is niet kritisch voor verbindingen leveren in de hemolymfe vinden we het gebied van de ocelli, die lokaliserend mediale op de rugzijde van het hoofd capsule, een geschikte plaats waardoor een gemakkelijke injectie die leidt tot snelle en gelijkmatige verdeling van de verbinding zijn. </li><li> Verwijder onmiddellijk injectie micropipet van plaats van injectie en trek de injector van de bedieningskast tijdens de voortzetting van de 1 Hz GF stimulatie tot 1 min na injectie (figuur 4). </li><li> Met het oog op meer subtiele effecten van verbindingen op de GFS onthullen, benadrukken de Giant Fibers (GFS) met 10 treinen van 10 stimuli bij 100 Hz met een 1 seconde tussen de treinen. Verdere de functie van de GF paden testen dit paradigma elke 5 minuten tot 15 minuten (figuur 4). Echter, kortere of langere tijd controle zijn ook mogelijk. </li><li> Om te testen of de verbinding een effect op de neuromusculaire verbindingen (NMS) van de SBO heeft, en mogelijk beperken van de effecten van de verbinding, ga dan naar de motorische neuronen richting te activerentgevoerd door thoracale stimulatie. Hiervoor verwijderen stimulerende elektroden van de ogen en vervangen op de voorste zijde van de thorax om de neuronen stimuleren met 10 treinen 10 stimuli bij 100 Hz. </li></ol> Opmerking: Het elektrofysiologische sporen in beeld niet overeen met de werking van zuivere kleurstof injectie. 5. Representatieve resultaten Effect van een antagonist op de PSI naar synaps van de Giant Fiber System DLM Methyllycaconitine citraat (MLA) is een nAChR antagonist dat specifiek is voor α7 nAChR subtypes. De PSI te synaps DLMn in de GF-DLM route is afhankelijk van de Dα7 nAChR subtype voor een goede functie, terwijl genetische verwijdering van Dα7 nAChR subtype heeft geen effect op de GF-TTM weg 5,6. Om de specificiteit en gevoeligheid van assay tonen we geïnjecteerd MLA verschillende concentraties (0, 0,02, 0,04, 0.08 0,12 ng / mg, 46 nl geïnjecteerd) in de kop van het dier (n = 10 verbinding behandeling n = 15 voor zout behandeling). Alleen mannelijke vliegen (van het wild type genotype wild 10E) gebruikt, en het effect van de verbinding werd gedurende in totaal 15 minuten na injectie. Figuur 5 is het verschil tussen basislijnregistratie verkregen vóór de injectie en die verkregen na injectie in reactie op de MLA en zout controle oplossing. We hebben gevonden dat injectie van MLA resulteerde in het onvermogen van de GF-DLM weg naar een op een volgen 100 Hz bij stimulatie van de SBO in de hersenen tijdens de GF-TTM route onaangetast. (Figuur 5, Top en middelste spoor, t-test uitgevoerd tussen zout controles [0 ng / mg] en de verschillende concentraties van MLA op elk tijdstip, tenzij de gegevens zijn niet-parametrische [normaliteit en gelijke varianties getest], anders maken we gebruik een Mann-Whitney Rank Sum Test. * p &lt;0,001). Echter een een-op-een response van het DLM werd waargenomen wanneer de motorische neuronen werden direct gestimuleerd (Figuur 5, onder spoor), waaruit blijkt dat de NMJ functie van de DLM en TTM niet wordt beïnvloed door MLA. MLA leek het maximale effect te bereiken 1 minuut na de injectie voor 0,04, 0,08 en 0,12 ng / mg van de MLA geïnjecteerd, omdat er geen verdere significante veranderingen werden waargenomen tijdens de volgende 15 minuten testperiode. Bovendien de verbinding bereikte effect op 0,08 ng / mg aangezien sterker reacties werden niet waargenomen met de hogere dosering van 0,12 ng / mg. <img src="/files/ftp_upload/3597/3597fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. De Giant Fiber System Schema van de Giant Fiber System (GFS). De Giant Vezels (GFS, aangegeven in rood) synaps elektrisch (gap junctions) als chemisch (cholinerge) op een Perifere Synapsing Interneuron (PSI, weergegeven in groen) en de Tergo Trochanteral Muscle neuron (TTMn, weergegeven in geel) 5. De PSI tot en met DLMn (Dorsale Longitudinale Muscle neuron, weergegeven in blauw) aansluiting is afhankelijk van Dα7 nAChR subtype 6. Tot slot de neuromusculaire synaps (NMS) van de TTMn en de DLMn op de sprong (TTM, te zien in paars) en de vlucht spieren (DLM, weergegeven in het paars) is glutamaat. Opmerking: De GF aan PSI-verbinding is zowel elektrische en chemische. In shakB mutanten (welke spleet kruispunten missen) geen reactie worden opgenomen van de DLM bij stimulatie van de SBO in de hersenen, waaruit blijkt dat de chemische component in afwezigheid van elektrische aansluitingen niet voldoende is om een actiepotentiaal van de oproepen PSI 5,16-18. Omdat de GF om PSI-verbinding is gap junction afhankelijk is, dit figuur toont alleen de GAP-kruising bij de synaps voor de eenvoudigheid. <img src="/files/ftp_upload/3597/3597fig2.jpg" alt="Figuur 2" /> Figuur 2. Micromanipulators set-up. <ol class="ualpha"><li> Een gewijzigde opstelling van eerder gepubliceerd protocol 14 wordt de injectie micromanipulator geschikt voor gekoppeld GFS opnamen met gelijktijdige nanoinjections. De gemonteerde vlieg voorbereiding is georiënteerd met het hoofd van de vlieg naar de experimentator. De injectie micromanipulator (# 1) is geplaatst voor de experimentator tussen de twee voor het hanteren van het wolfraam stimulerende elektroden (2 # # en 3). De twee micromanipulators de glazen opname elektroden (# 4 en # 5) op de links en rechts respectievelijk. De micromanipulator van de wolfraam aardelektrode (# 6) wordt geplaatst verst in de rug of links (hier) of aan de rechterzijde. </li><li> Een close-up van de top van de regeling van de verschillende elektroden en injectie micropipet. </li><li> Een goed gemonteerde D. melanogaster gespietst met elektroden en injectie micropipet klaar voor injectie. Merk op dat het dier het lichaamwordt gemonteerd met zijn thorax horizontaal en zijn vleugels uitgespreid. De was wordt ingepakt in het lichaam te voorkomen dat het dier bewegen. Bovendien is de aardelektrode (# 6 in de buik) het glas opname elektroden (# 4 en # 5 in de thorax gemarkeerd door donkere lijnen) en stimulerende elektroden (# 2 # 3, een in elk oog ) worden doorboord in plaats zoals eerder beschreven 14. De injectie micropipet (# 1) is uitgelijnd met de middelste van de drie ocelli (omcirkeld). Het inbrengen van de injectie micropipet moeten worden geplaatst op dit gebied. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3597/3597fig3.jpg" alt="Figuur 3" /> Figuur 3. Schuine injectie micropipet. Een schematische voorstelling van een goed afgeschuind micropipet wordt hier getoond. De elektrode opening moet worden afgeschuind in een hoek van 45 graden en hebben een opening tussen 11 en 17 urn. Een goede schuine injectie micropipet is cruciaal voor een soepele injectie met een minimum aan dSchade aan de vlieg. <img src="/files/ftp_upload/3597/3597fig4.jpg" alt="Figuur 4" /> Figuur 4. Algemeen schema van de nanoinjection / elektrofysiologie-protocol. Een vertegenwoordiger diagram van de algemene regeling voor de nanoinjection / elektrofysiologie protocol. Begin met het verkrijgen van een baseline-opname door het stimuleren van de Giant Fibers (GFS) bij 100 Hz met 10 treinen van 10 stimuli per stuk (maar een trein hier afgebeeld). Vóór injectie moet beginnen met de 1 Hz stimulaties een seconde uit elkaar. Tijdens de injectie (terwijl injector is aangesloten op de schakelkast), zult u in acht belangrijke achtergrond geluid, maar niet stoppen met de opnames. Na de injectie (en injector niet is aangesloten op schakelkast), voortzetting van de 1 Hz stimulatie voor ongeveer 1 minuut. Tenslotte gaat de SBO wijzen met 10 treinen 10 stimuli 100 Hz en de functie van de GF paden testen dit paradigma elke 5 minuten tot 15 minuten voortgezet. Opmerking: opnames wvoordat gemanipuleerd om de algemene regeling te maken en niet slechts een specifiek resultaat verkregen. Niet op schaal, zijn niet alle sporen weergegeven. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3597/3597fig4large.jpg">Klik hier voor een grotere afbeelding</a> . <img src="/files/ftp_upload/3597/3597fig5.jpg" alt="Figuur 5" /> Figuur 5. De effecten van MLA in het SBO. <ol class="ualpha"><li> Een grafische voorstelling van de effecten van de α7 nAChR antagonist Methyllycaconitine citraat (MLA) van de GF-DLM route van de fruitvlieg in verschillende concentraties (0, 0,02, 0,04, 0,08, 0,12 ng / mg n = 10 per verbinding behandeling.; n = 15 voor zout behandeling). Slechts een minuut na injectie werd een significante en onmiddellijke effect te zien met 0,04 ng / mg van de MLA. Een significant effect werd ook gezien met 0.8ng/mg en 0.12ng/mg van de MLA bij 100 Hz stimulatie van de SBO. Werd geen significant verschil geconstateerd tussen de zoutoplossing controles en 0,02 ng / mg van de MLA. Bovendien, geen verandering in effect werd waargenomen na 1 minuut na injectie in de tijd onderzocht (15 minuten). A t-test werd uitgevoerd tussen zoutoplossing controle (0 ng / mg) en verschillende concentraties MLA op elk tijdstip. Levels worden gerapporteerd als gemiddelde + / - SEM, * p &lt;0,001. </li><li> Voorbeeld sporen van de DLM reacties op 100 Hz stimulatie. Top spoor toont de reacties van de spier voor MLA injectie bij GF stimulatie in de hersenen. Merk op dat de spier kan reageren elke stimulus een op een 100 Hz. Midden-trace toont de reacties van de DLM na MLA injectie (0,12 ng / mg). Merk op dat de spier niet kan reageren elke stimulus een op een 100 Hz. (Sterretjes). Bodemspoor toont de reacties van de DLM van hetzelfde preparaat (0,12 ng / mg) bij directe stimulatie van de motorische neuronen in de thorax. Omdat DLM reageert een op een 100 Hz met thoracale stimulatie kan het falen van de reacties met hersenen stimulatie worden toegeschreven aan de cholinerge PSI-DLMn verbinding. </li><li> Een grafische voorstelling van de effecten met verschillende MLA concentraties (0, 0,02, 0,04, 0,08, 0,12 ng / mg) op de GF-TTM route. Er werden geen significante effecten waargenomen tussen zout (0 ng / mg) en samengestelde injecties op elk gewenst tijdstip. A t-test werd uitgevoerd tussen zoutoplossing controle (0 ng / mg) en verschillende concentraties MLA op elk tijdstip, * p &lt;0,001. </li><li> Voorbeeld sporen van de TTM reacties op 100 Hz stimulatie. Top spoor toont de reacties van de spier voor MLA injectie bij GF activering met stimulatie in de hersenen. Merk op dat de spier kan alle meer reageren bij 100 Hz. Midden-trace toont de reacties van de DLM na MLA injectie (0,12 ng / mg). Reacties van het TTM spier stimulatie van de GF in de hersenen blijven een op een. Bodemspoor toont de reacties van de TTM van dezelfde voorbereiding tot 100 Hz stimulatie van de motorische neuronen in de thorax (0,12 ng / mg). </li></ol>

<ol><li>Koehn, F. E., Carter, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolving+role+of+natural+products+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">The evolving role of natural products in drug discovery.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 4, 206-220 (2005).</li>
<li>Miljanich, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ziconotide%3A+neuronal+calcium+channel+blocker+for+treating+severe+chronic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Ziconotide: neuronal calcium channel blocker for treating severe chronic pain.</a> Curr. Med. Chem. 11, 3029-3040 (2004).</li>
<li>Layer, R. T., Wagstaff, J. D., White, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conantokins%3A+peptide+antagonists+of+NMDA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Conantokins: peptide antagonists of NMDA receptors.</a> Curr. Med. Chem. 11, 3073-3084 (2004).</li>
<li>Lewis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conotoxins+as+selective+inhibitors+of+neuronal+ion+channels%2C+receptors+and+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Conotoxins as selective inhibitors of neuronal ion channels, receptors and transporters.</a> IUBMB Life. 56, 89-93 (2004).</li>
<li>Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, M. A., Phelan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+an+escape%3A+development+and+function+of+the+Drosophila+giant+fibre+system%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Making an escape: development and function of the Drosophila giant fibre system.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 17, 31-41 (2006).</li>
<li>Fayyazuddin, A., Zaheer, M. A., Hiesinger, P. R., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nicotinic+acetylcholine+receptor+Dalpha7+is+required+for+an+escape+behavior+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">The nicotinic acetylcholine receptor Dalpha7 is required for an escape behavior in Drosophila.</a> PLoS biology. 4, e63(2006).</li>
<li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-glutamate+as+an+excitatory+transmitter+at+the+Drosophila+larval+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">L-glutamate as an excitatory transmitter at the Drosophila larval neuromuscular junction.</a> The Journal of physiology. 262, 215-236 (1976).</li>
<li>Usherwood, P. N., Machili, P., Leaf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-Glutamate+at+insect+excitatory+nerve-muscle+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">L-Glutamate at insect excitatory nerve-muscle synapses.</a> Nature. 219, 1169-1172 (1968).</li>
<li>Marrus, S. B., Portman, S. L., Allen, M. J., Moffat, K. G., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+localization+of+glutamate+receptor+subunits+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Differential localization of glutamate receptor subunits at the Drosophila neuromuscular junction.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 1406-1415 (2004).</li>
<li>Petersen, S. A., Fetter, R. D., Noordermeer, J. N., Goodman, C. S., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+glutamate+receptors+in+Drosophila+reveals+a+retrograde+signal+regulating+presynaptic+transmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of glutamate receptors in Drosophila reveals a retrograde signal regulating presynaptic transmitter release.</a> Neuron. 19, 1237-1248 (1997).</li>
<li>Qin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+different+subunits+are+essential+for+expressing+the+synaptic+glutamate+receptor+at+neuromuscular+junctions+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Four different subunits are essential for expressing the synaptic glutamate receptor at neuromuscular junctions of Drosophila.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 3209-3218 (2005).</li>
<li>Schuster, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+an+invertebrate+glutamate+receptor+subunit+expressed+in+Drosophila+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of an invertebrate glutamate receptor subunit expressed in Drosophila muscle.</a> Science. 254, 112-114 (1991).</li>
<li>Tanouye, M. A., Wyman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+outputs+of+giant+nerve+fiber+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of%22%5BJournal%5D)">Motor outputs of giant nerve fiber in Drosophila.</a> Journal of. 44, 405-421 (1980).</li>
<li>Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+Recordings+from+the+Giant+Fiber+Pathway+of+D.+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster.</a> J. Vis. Exp. (47), e2412(2011).</li>
<li>Allen, M. J., Godenschwege, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAllen%2C+MJ+%22Drosophila+Neurobiology%22">Drosophila Neurobiology</a>. Zhang, B., Freeman, M. R., Waddell, S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 215-224 (2010).</li>
<li>Blagburn, J. M., Alexopoulos, H., Davies, J. A., Bacon, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Null+mutation+in+shaking-B+eliminates+electrical%2C+but+not+chemical%2C+synapses+in+the+Drosophila+giant+fiber+system%3A+a+structural+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Null mutation in shaking-B eliminates electrical, but not chemical, synapses in the Drosophila giant fiber system: a structural study.</a> J. Comp. Neurol. 404, 449-458 (1999).</li>
<li>Thomas, J. B., Wyman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+altering+synaptic+connectivity+between+identified+neurons+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mutations altering synaptic connectivity between identified neurons in Drosophila.</a> J. Neurosci. 4, 530-538 (1984).</li>
<li>Baird, D. H., Schalet, A. P., Wyman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Passover+locus+in+Drosophila+melanogaster%3A+complex+complementation+and+different+effects+on+the+giant+fiber+neural+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Passover locus in Drosophila melanogaster: complex complementation and different effects on the giant fiber neural pathway.</a> Genetics. 126, 1045-1059 (1990).</li>
<li>Gorczyca, M., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+cholinergic+synapse+in+the+giant+fiber+pathway+of+Drosophila+using+conditional+mutations+of+acetylcholine+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">Identification of a cholinergic synapse in the giant fiber pathway of Drosophila using conditional mutations of acetylcholine synthesis.</a> J. Neurogenet. 1, 289-313 (1984).</li>
<li>Allen, M. J., Murphey, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+component+of+the+mixed+GF-TTMn+synapse+in+Drosophila+melanogaster+uses+acetylcholine+as+its+neurotransmitter%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">The chemical component of the mixed GF-TTMn synapse in Drosophila melanogaster uses acetylcholine as its neurotransmitter.</a> The European journal of neuroscience. 26, 439-445 (2007).</li>
<li>Mejia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+for+in+vivo+screening+of+toxins+using+the+Drosophila+Giant+Fiber+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicon%22%5BJournal%5D)">A novel approach for in vivo screening of toxins using the Drosophila Giant Fiber circuit.</a> Toxicon. 56, 1398-1407 (2010).</li>
<li>Stork, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+function+of+the+blood-brain+barrier+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organization and function of the blood-brain barrier in Drosophila.</a> J. Neurosci. 28, 587-597 (2008).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De nanoinjection / elektrofysiologie bioassay hier gepresenteerde zorgt voor een snelle screening van verbindingen in het zenuwstelsel van de fruitvlieg. Dit is een nieuwe in vivo techniek dat kleine hoeveelheden van een verbinding vereist invloed op een verscheidenheid van eiwitten wekken in een goed gekarakteriseerd neuronale circuit. Deze methode kan worden gebruikt om de biologische activiteit van verschillende verbindingen testen van onbekende toxinen in de handel verkrijgbare farmacologische agentia. ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Opname glaselektroden: borosilicaatglas haarvaten </td><td> Wereld Precision Instruments </td><td> 1B100F-4 </td><td> 1,0 mm OD, 0.58mm ID </td></tr><tr><td> Stimulator </td><td> Grass Instrumenten </td><td> Model S48 </td><td></td></tr><tr><td> Versterker </td><td> Getting Instruments Inc </td><td> Model 5A </td><td></td></tr><tr><td> Data acquisitie Software: Digidata </td><td> Molecular Devices </td><td> Model 1440A </td><td></td></tr><tr><td> Het verzamelen van gegevens software: pCLAMP </td><td> Molecular Devices </td><td> Versie 10 </td><td></td></tr><tr><td> Stereomicroscoop wet glasvezel microscoop ringlicht </td><td> AmScope </td><td> SM-4T Model HL250-AR </td><td></td></tr><tr><td> Het ontleden van ruimte voor de montage </td><td> AmScope </td><td> SM-2TZ </td><td></td></tr><tr><td> Kite Manual micromanipulator &amp; kantelen Base </td><td> Wereld Precision Instruments </td><td> Model # M3301 Kite: Model # KITE-M3-L </td><td></td></tr><tr><td> Drosophila melanogaster Wild 10E genotype (wild-type stam) </td><td> Bloomington Stock centrum </td><td> Stock # 3892 </td><td></td></tr><tr><td> Verticale pipet trekker </td><td> David Kopf Instrumenten </td><td> Model 700C </td><td></td></tr><tr><td> Injectie glas micropipetten: borosilicaatglas haarvaten </td><td> Wereld Precision Instruments </td><td> Catalogus # 4878 </td&gt; <td> 1.14mm OD, 0,5 mm ID </td></tr><tr><td> Silicon olie </td><td> Visser </td><td> Catalogus # S159-500 </td><td></td></tr><tr><td> Beveler </td><td> Sutter Instrument Co </td><td> KT Brown Type Model # BV-10 </td><td></td></tr><tr><td> Nanoliter2000 </td><td> Wereld Precision Instruments </td><td> Catalogus # B203XVY </td><td></td></tr><tr><td> Blauwe kleurstof </td><td> McCormick </td><td> N / A </td><td> Ingrediënten: Water, Propylene Glycol, FD &amp; C Blue 1, en 0,1% Propylparaben (conserveermiddel). </td></tr><tr><td> Methyllycaconitine citraat (MLA) </td><td> Tocris bio- </td><td> Catalogus # 1029 </td><td></td></tr><tr><td> Plastic wax sticks </td><td> Hygiënisch Corporation (Akron Ohio USA) </td><td></td><td></td></tr></tbody&gt; </table>

gekoppelde nanoinjection en elektrofysiologie test voor het screenen op bioactiviteit van verbindingen met behulp van de drosophila melanogaster giant fiber system

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Screening verbindingen in vivo activiteit kan worden gebruikt als eerste stap kandidaten die kunnen worden ontwikkeld tot farmacologische agentia 1,2 identificeren. We ontwikkelden een nieuwe nanoinjection / elektrofysiologische test die de detectie van bioactieve modulerende effecten van stoffen op de functie van een neuronale circuit dat bemiddelt de ontsnapping respons bij Drosophila melanogaster 3,4 mogelijk maakt. De in vivo assay gebruikt Drosophila Giant vezelsysteem (GFS, figuur 1) kan screening van verschillende verbindingen, zoals kleine moleculen of peptiden en vereist slechts minimale hoeveelheden te wekken effect. Daarnaast is de Drosophila GFS biedt een grote verscheidenheid van mogelijke moleculaire doelwitten op neuronen en spieren. De Giant Fibers (GFS) synaps elektrisch (gap junctions) als chemisch (cholinerge) op een Perifere Synapsing Interneuron (PSI) en de Tergo Trochanteral Muscle neuron (TTMn) 5 </sup&gt;. De PSI naar DLMn (Dorsale Longitudinale Muscle neuron) aansluiting is afhankelijk van Dα7 nicotine acetylcholine receptoren (nAChRs) 6. Ten slotte is de neuromusculaire knooppunten (NMJ) van de TTMn en de DLMn met de sprong (TTM) en vliegspieren (DLM) zijn glutamaat 7-12. Hier hebben we laten zien hoe je nanoliter hoeveelheden van een stof te injecteren, terwijl het verkrijgen van elektrofysiologische intracellulaire opnames van de Giant Fiber System 13 en hoe de effecten van de verbinding op de functie van dit circuit te controleren. We tonen specificiteit van de test met methyllycaconitine citraat (MLA), een nAChR antagonist, die de PSI om de verbinding DLMn maar niet de GF om verbinding of de functie van de NMJ op de sprong of vlucht spieren TTMn verstoort. Alvorens te beginnen met deze video is het belangrijk dat je zorgvuldig in de gaten en vertrouwd raken met de Jove video met de titel &quot;elektrofysiologische registraties van de Giant Fiber Pathway van D. Melanogaster &quot;van Augustin et al. 7 de video hier gepresenteerde is bedoeld als een uitbreiding van deze bestaande techniek. Hier elektrofysiologische opnames methode en focus gebruiken in bijzonderheden over de toevoeging van de gepaarde nanoinjections en meettechniek.

Een snelle<em&gt; In vivo</em&gt; Test om te testen op neuromodulatory verbindingen met behulp van de Giant Fiber System (GFS) van<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Beschreven. Nanoinjections in de kop van het dier, samen met elektrofysiologische opnames van de SBO kan onthullen bioactiviteit van verbindingen op neuronen en spieren.

Gekoppelde Nanoinjection en Elektrofysiologie test voor het screenen op bioactiviteit van verbindingen met behulp van de Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Het screenen van verbindingen op in vivo activiteit kan worden gebruikt als eerste stap om kandidaten te identificeren die kunnen worden ontwikkeld tot farmacologische middelen1,2. Wij ...

In deze video laten we zien hoe literhoeveelheden van een verbinding kunnen worden geïnjecteerd terwijl elektrofysiologische registraties van het reuzenfibersysteem worden verkregen, en hoe de effecten van de verbinding op de functie van dit circuit kunnen worden gemonitord. Voordat u met deze video begint, is het essentieel dat u zorgvuldig de JoVE-video bekijkt en se familiariseert met de video getiteld Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of the Melanogaster for Augustine Etal. Aangezien de hier gepresenteerde video bedoeld is als een uitbreiding van deze bestaande techniek, wordt de benodigde apparatuur voor de opstelling van de elektrofysiologie-rig in detail beschreven door Augustine Al. Pas in dit journal de eerder beschreven opstelling van de elektrofysiologie-rig aan door een zesde micromanipulator toe, waarin een ano-injector is geplaatst.Voor een gemakkelijke toegang tot de kop van het dier dient dit tussen de twee micromanipulatoren van de stimulerende elektroden te worden geplaatst. De opstelling voor nano-injectie vereist een Nanoliter 2000 of een soortige injector; bereid de injectienaald voor door de bij de injector geleverde glazen micropipetten te trekken tot een weerstand van 80 tot 100 megas met een elektrode-trekker. Voor gladde injecties is het noodzakelijk om de micropipetten schuin af te snijden tot een opening van 11 tot 17 micrometer onder een hoek van 45 graden.Vul de injectiemicro-pipet langzaam van achteren met synthetische olie met behulp van een Hamilton-spuit, zoals beschreven in de handleiding van de Nanoliter 2000, en zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn. Bevestig de micro-pipet zorgvuldig op de nano-injector en bereid deze voor op het laden van de verbinding door overtollige olie te verwijderen, zoals beschreven in de handleiding van de Nanoliter 2000. De verbinding zoals beschreven in de handleiding van de Nanoliter 2000.Zorg ervoor dat de punt van de micropipet tijdens deze procedure niet breekt. Stel het gewenste aantal nanoliters dat geïnjecteerd moet worden in op in de bedieningsunit van de injector, zoals beschreven in de handleiding van de NANOLITER 2000. Let op dat de totale geïnjecteerde hoeveelheid 100 nanoliters niet mag overschrijden.Plaats een Nanoliter 2000 op de micromanipulator tussen de twee micromanipulatoren van de stimulerende elektroden. Koppel de injector tijdens de opname van de registraties los van de controlebox, met uitzondering van de injectie zelf. Koppel echter de stroomvoorziening van de controlebox niet los, omdat dit tot een reset zal leiden; anesthetiseer vliegen van twee tot zes dagen oud met CO2 of ijs zoals eerder beschreven.Zodra het dier beweeglijk is, wordt het met een pincet overgebracht naar een klein plaatje met zachte dentale was door het dier bij de poten op te pakken zoals eerder beschreven. Monteer de vlieg voorzichtig met de dorsale zijde naar boven en zorg ervoor dat het thorax en de kop worden geïmmobiliseerd met zachte dentale was rondom het lichaam. Spreid de vleugels voorzichtig uit zodat ze loodrecht op het thorax liggen.Plaats de gemonteerde vlieg op de elektrofysiologische opstelling met de kop richting de stimulerende elektroden en penetreer het dier met de overeenkomstige stimulerende, aardings- en registratie-elektroden. Zoals eerder beschreven, bevindt de DLM-spier zich in de thorax tussen de anterieure dorsale centrale haren en de middellijn van de vlieg. De TTM-spier bevindt zich nabij de vleugelbevestigingen tussen de posterieure en anterieure interieure en interieure supra-allaire haren van de vlieg. Lijn de injectiemicropipet met de verbinding uit met het centrum van de drie osli die zich op het mediale posterieure deel van de kop bevinden, maar injecteer nog niet. Verkrijg vóór de injectie van de verbinding een basislijnregistratie van de giant fiber-naar-TTM- en giant fiber-naar-DLM-paden van het giant fiber-systeem via hersenstimulatie door de giant fibers te activeren met 10 treinen van 10 stimuli bij 100 hertz.Met een vertraging van één seconde tussen de treinen. Een wildtype vlieg zou bij deze stimulatiesnelheid in staat moeten zijn om één-op-één te volgen voor zowel de DLM- als de TTM-paden. Verwijder de vlieg.Indien de reuzelvezelbanen naar de DLM en TTM de 100 hertz stimulatie niet in een één-op-één verhouding volgen, schakel dan over op continue stimulatie van de reuzelvezel met enkelvoudige pulsen bij één hertz. Sluit de injector snel aan op de controlebox, ondanks dat achtergrondruis de opnames van de één hertz stimulatie zal verstoren.Stop dit niet abrupt. Voer de injectie-micropipet net onder het oppervlak in de kopcapsule van de vlieg in. Injecteer de gewenste hoeveelheid verbinding terwijl de stimulatie van 1 Hz wordt gehandhaafd.Verwijder onmiddellijk de injectiemicropipet uit de injectieset en koppel de injector los van de controlebox, terwijl de giant fiber-stimulatie van 1 Hz wordt voortgezet tot één minuut na de injectie. Om subtielere effecten van verbindingen op het giant fiber-systeem aan te tonen, worden de giant fibers belast met 10 trains van 10 stimuli bij 100 Hz, met een vertraging van één seconde tussen de trains. Test de functie van de giant fiber-paden elke vijf minuten tot 15 minuten met dit paradigma.In het hier getoonde voorbeeld bleef het traject van de reuzenvezel naar de TTM onbeïnvloed na injectie van de verbinding, terwijl het traject van de reuzenvezel naar de DLM wel werd beïnvloed. Om te testen of de verbinding een effect heeft op de neuromusculaire juncties van het reuzenvezelsysteem en om de effecten van de verbinding mogelijk verder te preciseren, kunnen de motorneuronen hiervoor direct worden geactiveerd door middel van thoracale stimulatie. Verwijder de stimulerende elektroden van de ogen en plaats deze op de anterieure zijden van de thorax om de motorneuronen te stimuleren met 10 trains van 10 stimuli bij 100 hertz. In dit voorbeeld faalt het DLM-traject om betrouwbaar te volgen wanneer de stimulatie via de hersenen wordt toegediend.Echter, de respons van de DLM-neuromusculaire overgang is één-op-één bij 100 hertz bij thoracale stimulatie, wat de neuromusculaire overgang uitsluit als specifiek doelwit van de geïnjecteerde verbinding; het doelwit van de verbinding kan vervolgens worden beperkt tot de verbindingen tussen de reuzenvezel en PSI, of van PSI naar het DLM-motorneuron.

paired-nanoinjection-electrophysiology-assay-to-screen-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Hier beschrijven we elektrofysiologische methoden voor het meten van synaptische transmissie bij de neuromusculaire junctie van Drosophila larve. Evoked release wordt kunstmatig geïnitieerd door het stimuleren van de motorische neuron axonen, en de transmissie door middel van de NMJ kan worden gemeten door de postsynaptische respons opgeroepen in de spier.

Elektrofysiologische methoden voor opname Synaptic Potentials van de NMJ van Drosophila Larven

Met behulp van hoogfrequente elektrische stimulatie, beslag-achtige activiteit kan worden geïnduceerd...

Neurocircuit Testen voor epileptische aanvallen mutanten van Drosophila</em

Elektrofysiologische opname in de Drosophila Embryo

De Giant Fiber System is een eenvoudige neuronale circuit van de...

Elektrofysiologische opnames van de Giant Fiber Pathway van D. melanogaster</em

Het doel van dit protocol is om een ​​eenvoudige en goedkope aanpak te geven voor het verzamelen van Drosophila embryo's op middelgrote schaal (0,5-1 g) en het bereiden van eiwit extracten die kunnen worden toegepast in stroomafwaartse proteomische toepassingen, zoals affiniteitszuivering-massaspectrometrie (AP-MS ).

Middelgrote voorbereiding van<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo Extracten voor Proteomische Experimenten

Dit protocol beschrijft een methode om vast te leggen van de aflopende elektrische activiteit van het centrale zenuwstelsel van Drosophila melanogaster zodat de kosten-efficiënte en handige testen van farmacologische agenten, genetische mutaties van neurale eiwitten, en/of de rol van onontgonnen fysiologische trajecten.

Elektrofysiologische opname van de activiteit van het centrale zenuwstelsel van derde-Instar Drosophila Melanogaster

We presenteren een protocol met een voorwaartse genetische benadering van het scherm voor mutanten die neurodegeneratie in Drosophila melanogastertentoonstellen. Het bevat een klim test, histologie analyse, genmapping en DNA-sequencing om uiteindelijk nieuwe genen te identificeren die verband houden met het neuroprotectie proces.

In vivo genetisch scherm naar voren om nieuwe neuroprotectieve genen in Drosophila melanogaster te identificeren

Het huidige protocol beoordeelt de locomotorische activiteit van Drosophila door de beweging van vliegen in een handgemaakte arena te volgen en te analyseren met behulp van open-source software Fiji, compatibel met plug-ins om pixels van elk frame te segmenteren op basis van high-definition video-opname om parameters van snelheid, afstand, enz. Te berekenen.

Een eenvoudige techniek om locomotorische activiteit in Drosophila te testen

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol om de microtubuli-netwerken in neuromusculaire knooppunten en spiercellen te visualiseren. In combinatie met de krachtige genetische hulpmiddelen van Drosophila melanogaster, vergemakkelijkt dit protocol de genetische screening en de analyse van de microtubuli-dynamiek aanzienlijk voor de rol van regulerende eiwitten van het microtubuli-netwerk in het zenuwstelsel.

Drosophila-larvale neuromusculaire junctie en spiercellen gebruiken om het netwerk van microtubuli te visualiseren

Het protocol presenteert een high-throughput, kosteneffectieve methode voor het beoordelen van neurotoxiciteit in de fruitvlieg door middel van de kwantificering van locomotorische disfunctie als alternatief voor traditionele zoogdiermodellen. Het heeft tot doel de neurotoxische effecten van farmaceutische verbindingen, milieuagentia of genetische modificaties te evalueren met behulp van een gevoelig, reproduceerbaar en ethisch gunstig model.

Gedragsanalyse van locomotorische disfunctie bij Drosophila melanogaster als uitlezing voor neurotoxiciteit

Leer nanoinjectie en elektrofysiologie voor het testen van neuromodulerende verbindingen met behulp van het Giant Fiber System van Drosophila melanogaster. Deze methode maakt real-time monitoring van bioactiviteit mogelijk.

Gekoppelde Nanoinjection en Elektrofysiologie test voor het screenen op bioactiviteit van verbindingen met behulp van de Drosophila melanogaster Giant Fiber System (Video) | JoVE Journal

Gekoppelde Nanoinjection en Elektrofysiologie test voor het screenen op bioactiviteit van verbindingen met behulp van de Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Meer video's verkennen