Name: Monitoring Cell-autonome circadiane klok Rhythms of genexpressie met behulp van Luciferase Bioluminescentie Reporters (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Leer hoe je luciferase-reportercellijnen genereert en circadiane ritmen monitort met bioluminescentie. Deze methode biedt stabiele integratie en efficiëntie voor circadiaan biologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd mede ondersteund door de National Science Foundation (IOS-0920417) (ACL).

1. Bouw van Lentivirale Luciferase Reporters Een zoogdier circadiane reporter construct bevat gewoonlijk een expressie-cassette waarin een circadiane promoter gefuseerd met het luciferase gen. Zowel ligatie en recombinatie gebaseerde strategieën worden gebruikt voor DNA klonering. Als voorbeeld beschrijven we een recombinatie gebaseerde Gateway kloneringswerkwijze voor het genereren van P (Per2)-d Luc reporter lentivirale, waarin het gedestabiliseerd luciferase (Luc d) onder controle van de muis Per2 promoter. <ol><li> Klonering van Per2 promoter. Gebruik PCR de Per2 promoter DNA-fragment van 526 bp amplificeren, stroomopwaarts van de transcriptie startplaats van een muis Per2 BAC kloon 9-13, met een voorwaartse primer (5&#39;-CTCGAGCGGATTACCGAGGCTGGTCACG TC-3 &#39;) en een reverse primer (5&#39; -CTCGAGTCCCTTGCTCGGCCCGTCAC TTGG-3 &#39;) en kloon in pENTR5&#39;-TOPO vector (Invitrogen) voor het genererenpENTR5&#39;-P (Per2). </li><li> Klonering van Luc d. De d Luc bevat het vuurvlieg luciferase gen en een C-terminale PEST sequentie voor snelle eiwitafbraak zoals eerder 21 beschreven. Gebruik de PCR d Luc DNA fragment en kloon in pENTR / D-TOPO vector (Invitrogen) te versterken tot pENTR / Dd Luc genereren. </li><li> Bouw van de reporter vector. Meng de twee pENTR plasmiden, pENTR5&#39;-P (Per2) en pENTR / Dd Luc, met de lentivirale vector bestemming pLV7-bsd (BSD, blasticidine resistentiegen), en voer de recombinatie reactie met behulp van Clonase een pLV7-bsd-P genereren (Per2)-Luc reporter d (Figuur 1). pLV7-Bsd is een gemodificeerde versie (in ons laboratorium) van pLenti6/R4R2/V5-DEST (Invitrogen) waarin de bosmarmot hepatitis virus post-transcriptionele regulatoire element (WPRE) sequenties werden 22 direct stroomafwaarts van de expressie ca<html> ssette om genexpressie te versterken. </li></ol> 2. Productie van lentivirale deeltjes 1. Seed 293T cellen (dag 1) <ol><li> Groeien humane embryonale nier (HEK) 293T cellen tot 90-100% confluentie regelmatig DMEM aangevuld met 10% FBS en 1x penicilline-streptomycine-glutamine (PSG) op 10 cm kweekschalen. (Snel groeiende cellen met een lage passage nummer zijn van cruciaal belang voor een efficiënte transfectie.) </li><li> Voorafgaand aan enten van de cellen voor transfectie coat 6-well kweekplaten door 1 ml van 0,001% poly-L-lysine in PBS aan elk putje en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Zuig de oplossing en spoel eenmaal met 1x PBS voor gebruik. </li><li> Dissociëren 293T cellen met trypsine en zaad 0,75 x 10 6 cellen op elk putje van de pre-beklede platen met 2 ml DMEM regelmatige. Schud de platen zorgvuldig tot een gelijkmatige verdeling van cellen te verkrijgen in elk putje. Groeien de cellen in de incubator bij 37 ° C geroerd. </li></ol>tap &quot;&gt; 2. Transiënte transfectie Via Capo 4 / DNA precipitatie (dag 2) <ol><li> Let op de gezaaide cellen vanaf dag 1. Cell moeten bereiken samenvloeiing van 80-90%. </li><li> Bereid plasmide transfectie mix in een 1,5 ml microcentrifugebuis door 2 pg van een lentivirale reporterplasmide DNA (bijvoorbeeld pLV7-P (Per2)-Luc d, Liu lab) en de 3 verpakking vectoren (1,3 ug Gag / Pol, 0,5 ug rev, en 0,7 ug VSVG, Invitrogen). Als controle voor zowel transfectie en de daaropvolgende infectie we gewoonlijk een extra goed in transfectie voor een lentivirale GFP expressie vector, pLV156-CMV-EGFP (Figuur 1A), herbergt versterkt groen fluorescent eiwit (EGFP) onder de controle van de CMV promoter zoals eerder 20 beschreven. </li><li> Voeg 100 ul van 0,25 M CaCl2 (verdund met DNase / RNase-vrij ddH 2 O van 2,5 M voorraad) om het plasmide mix in stap 2 en meng. Voeg 100 ul 2x BBS oplossing (50 mM BES, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na 2 HPO 4, pH 6,95) en meng voorzichtig maar grondig. Incubeer de DNA mix bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. </li><li> Tijdens het wachten, aspireer medium van 293T-cellen en veranderen in 2 ml vers medium. De plaat terug in de incubator gedurende ten minste 10 min tot pH evenwicht medium voor transfectie. </li><li> Voeg transfectie mix van stap 3 tot en met 293T cellen druppelsgewijs. Swirl de plaat voorzichtig en let deeltjesvorming onder een microscoop. Incubeer bij 5% CO2, 37 ° C overnacht. (Schone deeltjesvorming van Capo 4 / DNA precipitaat is cruciaal voor efficiënte transfectie.) </li></ol> 3. Oogst virale deeltjes (dagen 3-4) <ol><li> Ongeveer 16 uur na transfectie (dag 3) tegen die tijd moeten cellen tot 100% confluentie zuigen medium van cellen en vervangen door 2 ml vers DMEM regelmatige. Incubeer bij 37 ° C geroerd. </li><li> Op dag 4, beoordelen transfectie-efficiëntie door het observeren van EGFP expressie in transfection controle cellen (transfectie-efficiëntie van 90-100% met een hoge EGFP expressie is een betrouwbare voorspeller van een goede virale prep.) </li><li> Verzamel het medium dat uitgescheiden, infectieuze virusdeeltjes. Centrifugeer bij&gt; 2000 xg gedurende 5 minuten om resterende 293T cellen te verwijderen en de virus-bevattende supernatant verzameld. Alternatief kan het medium worden gewist met een 0,45 urn membraanfilter. De virale deeltjes zijn klaar voor gebruik in infectie. </li></ol> 3. Infectie van cellen 3T3 1. Seed 3T3 cellen (dag 3) Split en zaad juiste nummer (~ 12.000) van de 3T3 cellen op een 12-well plaat tot 20-30% confluentie te krijgen door het volgende dag. Incubeer bij 37 ° C geroerd. 2. Infect 3T3 cellen (dag 4) <ol><li> Let op de gezaaide cellen. Samenvloeiing van 20-30% (minder dan 50%) gewenst is voor infectie. </li><li> Voeg polybreen tot een eindconcentratie van 5 pg / ml om de verzamelde medium die viraledeeltjes. Meng goed door pipetteren. </li><li> Zuigen medium van 3T3-cellen en voeg 1 ml van de bovenstaande virale mengsel per well. Incubeer bij 37 ° C geroerd. (Polybreen wordt gebruikt om infectie-efficiëntie te verbeteren, maar is niet absoluut noodzakelijk. Aangezien het soms giftig zijn voor bepaalde cellen, voorafgaand testen aanbevolen.) </li></ol> 3. Selecteer geïnfecteerde cellen (dag 5 en hoger) <ol><li> Vierentwintig uur na de infectie, te zuigen medium dat virus en polybreen uit de geïnfecteerde cellen eenmaal gewassen met 1x PBS en veranderen vers medium. Incubeer bij 37 ° C overnacht voor herstel en groei. </li><li> Wanneer confluent (gewoonlijk 1-2 dagen later), de cellen en incubeer gesplitst bij 37 ° C geïncubeerd. </li><li> De volgende dag opgezogen medium van cellen (&lt;50% confluentie gewenst is) en vervangen door vers medium dat 10 ug / ml Blasticidine te selecteren op stabiel getransduceerde cellen. (Blasticidine kill-curve moet empirisch worden bepaald voor een bepaalde cellijn.) </li><li&gt; Ga verder met vers medium met Blasticidine om de 2-3 dagen voor continue selectie van antibiotica-resistente cellen die klok verslaggevers (meestal 4-6 dagen in totaal). </li></ol> 4. Registratie van bioluminescentie Reporter Cells 1. Zaad reporter cellen Propageren Blasticidine-resistente reporter cellen en splitsen op 35-mm cultuur gerechten. Incubeer bij 37 ° C tot confluent. We meestal voor te bereiden ≥ 3 gerechten voor elke reporter cellijn onder elke voorwaarde voor circadiane fenotypering. 2. Synchronisatie en wijziging opnamemedium <ol><li> Zuigen medium van confluente reporter cellen eenmaal gewassen met PBS, en vervangen met DMEM dat 10 pM forskoline (of 200 nM dexamethason). Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur om de cellen te synchroniseren. (Als alternatief kunnen cellen worden gesynchroniseerd door de temperatuur cycli 23 of serum shock 24.) </li><li> Tijdens het wachten, voor te bereiden opnemening medium voor 3T3 cellen als volgt: 1x DMEM (HyClone) met 10% FBS, 1x Pen / Strep / Gln, 1 uM forskoline, 1 mM luciferine, 25 mM HEPES, pH 7,4. Serum en forskoline concentratie kan empirisch worden bepaald. Voor zeer zwak cellen kunnen fenolrood-vrij medium gebruikt. </li><li> Eind forskoline behandeling zuigen medium en vervangen met vers gemaakte opnamemedium. </li></ol> 3. Bioluminescentie opname van cellen reporter <ol><li> Na medium verandering, bedek de cultuur gerechten met 40 mm steriele dekglaasjes en afdichting op zijn plaats met vacuüm vet om verdamping te voorkomen. </li><li> Plaats de gerechten op de LumiCycle luminometer, die binnen een set incubator bewaard bij 36 ° C zonder H 2 O of CO 2. </li><li> Start real-time bioluminescentie opname. We nemen meestal ritmen voor 1 week, gevolgd door medium verandering en voortdurende opname van een tweede week (zie Savelyev et al.. Voor details) 25. (Voor het opnemen van 96-wijll platen, Synergy SL2 werd gebruikt als de opname-inrichting, zie Discussion 1.1 voor details). </li></ol> 5. Data-analyse en presentatie Reporter cellen vergemakkelijken hoge resolutie kwantitatieve luminescentie-opname, van cruciaal belang voor het bepalen van fenotypische effecten op de circadiane klok functie. Om circadiane parameters, inclusief fase, periode lengte, ritme amplitude en remcilinder te verkrijgen, gebruiken we de LumiCycle Analysis programma (Actimetrics) te analyseren bioluminescentie data 5,14. Kort ruwe data zijn gemonteerd volgens basislijn eerste en basislijn-gecorrigeerde data worden gemonteerd op een sinusgolf waarvan de parameters worden bepaald. Voor monsters die hardnekkige ritmes, goodness-of-fit van&gt; 90% wordt gewoonlijk bereikt te tonen. Vanwege de hoge voorbijgaande bioluminescentie op medium verandering, we meestal uitgesloten van de eerste cyclus van de gegevens van de analyse. Voor de presentatie van gegevens, we meestal plotten ruwe data (bioluminescentie, tellingen / sec) tegen time (dagen). Noodzakelijk is, kan de basislijn-gecorrigeerde gegevens worden uitgezet om amplitude en fase te vergelijken. 6. Representatieve resultaten 1. Fase-specifieke circadiane verslaggevers De circadiane klok is gebaseerd op een biochemisch mechanisme van negatieve feedback 1. De kern bestaat uit terugkoppellus transcriptieactivatoren Bmal1 en CLOCK, en repressoren pers en Crys, die inwerken op de circadiane E / E&#39;-box enhancer elementen ritmische genexpressie (met ochtend fase, bijvoorbeeld Rev-erb α) produceren. De kern loop regelt en integreert ten minste twee andere circadiane cis-elementen de DBP/E4BP4 inbindelement (D-box, voor dagen fase, bijvoorbeeld Per3) en de ROR / REV-ERB binding element (RRE, voor nacht fase, bijvoorbeeld Bmal1) 17. Combinatoriële regulatie door meerdere circadiane elementen genereren nieuw tussenproduct fasen. Bijvoorbeeld Cry1 transcriptietie wordt gemedieerd door drie circadiane elementen (bijvoorbeeld E / E&#39;-box en D-box elementen in de promoter en RREs in het eerste intron van het gen Cry1), die tot de afzonderlijke Cry1 avond-fase 13. Op basis van deze mechanismen van genregulatie genereerden we vier verschillende reporter constructen: P (Per2)-d Luc en P (Cry1)-d Luc reporters die zowel E / E&#39;-box en D-box elementen in het regulerende gebied 17, 26,27, P (Cry1) - Intron-d Luc vertegenwoordigen combinatorische verordening door alle drie elementen (dwz, E / E&#39;-box, D-box, en RRE) 13,17, en P (Bmal1)-d Luc gereglementeerde uitsluitend RRE 9,17,19,21. We deze rapporteurs ingebracht in 3T3-cellen de verwachte afzonderlijke fasen van reporterexpressie (figuur 2) te produceren. 2. Gene knockdown via RNAi en farmacologisch active verbindingen Wanneer transfectie-efficiëntie hoog is, kunnen synthetische siRNA tijdelijk worden getransfecteerd in cellen af ​​te breken genexpressie. Bij transfectie is technisch moeilijk kan een shRNA expressievector stabiel getransduceerd in cellen via lentivirale infectie, zodat shRNA door de cel wordt verwerkt tot siRNA voor gen knockdown (KD). We presenteren KD effecten van Cry1 en Cry2 genen gebruik siRNA in U2OS cellen (Figuur 3A) en shRNA in 3T3 cellen met een expressievector pLL3.7 Gateway 9 (Fig. 3B). Naast 3T3 cellen, is de U2OS model wordt een prominente cellulaire klok model grotendeels omdat het de belangrijkste vereisten voor high-throughput screening van commercieel verkrijgbare humane siRNA bibliotheken (bijvoorbeeld menselijke oorsprong, kunnen genereren robuuste circadiaanse ritmes, gevalideerde functie voldoet alle bekende klokgenen, en vatbaar voor efficiënte transfectie enkwantitatieve luminescentie opname). In beide celtypen, RNAi-gemedieerde KD geleid klok fenotypes overeenstemming met eerdere muis knockout (KO) en cellulaire KD studies 5,10,11,28. Bijvoorbeeld, Cry1 KD verkort periode lengte en vermindert ritme volharding nodig, terwijl Cry2 KD verlengt periode. Bovendien kunnen kleine moleculen geselecteerd worden om farmacologisch doel en verstoren eiwitfunctie (Figuur 3C). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/4234/4234fig1.jpg" /> Figuur 1. De lentivirus gemedieerde genafgiftesysteem. (A) Schematische weergave van twee lentivirale P (Per2)-d Luc reporter vectoren en een CMV-EGFP construeren. Alleen het gebied voor integratie in het gastheercelgenoom wordt. In beide reporter-constructen, de transcriptie van d Luc staat onder directe controle van de Per2 promotor. In de pLV7-BSD-P (Per2)-d Luc vector (recombinatie gebaseerde klonen), een co-expressie gebracht Blasticidine resistentiegen (BSD) faciliteert selectie van geïnfecteerde cellen. In de pLV156-P (Per2)-d Luc vector (ligatie gebaseerde klonen), wordt EGFP vertaling gemedieerd door een interne ribosoom ingangsplaats (IRES) stroomafwaarts van d Luc, waardoor visuele waarneming en FACS sortering van geïnfecteerde cellen. Daarnaast is een SV40 promoter / terminator (P / T) wordt gebruikt als een isolator (zie bespreking 1.3). In de CMV-EGFP controlevector, EGFP expressie onder controle van een sterke CMV promoter. (B) fluorescerende beelden van getransfecteerde en geïnfecteerde GFP tot expressie brengende cellen. Typisch bereiken wij een hoge efficiëntie, zowel in transiënte transfectie van 293T-cellen en lentivirale infectie van cellijnen van onze interesse, zoals door GFP-expressie in deze cellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4234/4234fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om groter bedrag bekijken</a> . <img alt="Figuur 2" src = &quot;/ files/ftp_upload/4234/4234fig2.jpg&quot; /&gt; Figuur 2. Fase-specifieke expressie van bioluminescentie reporters in 3T3 cellen De lentivirale reporter vectoren die in dit experiment zijn pLV7-Bsd-P (Per2)-d Luc, P (Cry1)-d Luc, P (Cry1) -. Intron-d Luc, en P (Bmal1)-d Luc. Elke reporter er een duidelijke fase van oscillatie, zoals aangegeven door de pijlen. Terwijl de Per2 en Cry1 promotors rijden piek bioluminescentie &#39;s morgens-dag fasen en de Bmal1 promotor&#39; s nachts fase, combinatorische regulering door de P (Cry1) - Intron herbergen E-box, D-box, en RRE elementen verleent avond fase van piek bioluminescentie . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4234/4234fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/4234/4234fig3.jpg" /> Figuur 3. Genetische en farmacologisch verstoring van circadiane ritmen bij bioluminescentie reporter cellen. (A) Effecten van Cry1 en Cry2 knockdown door siRNA&#39;s op cellulair ritmes van U2OS reporter cellen. De LumiCycle luminometer werd gebruikt voor bioluminescentie opnemen van cellen in 35 mm schalen. Figuur is ingericht van Reference # 10, met toestemming van Elsevier (2009). (B) Effecten van Cry2 knockdown door shRNAs op cellulaire ritmes van 3T3 reporter cellen. Een pLL3.7 Gateway vector die een shRNA U6-cassette werd gebruikt voor Cry2 gen knockdown. shRNA2 een betere efficiëntie dan knockdown shRNA1 zoals bepaald door Western blot analyse (gegevens niet getoond). Een Synergy luminometer werd gebruikt voor bioluminescentie opname van cellen in een 96-well plaat. De instellingen voor opname zijn:. Incubator temperatuur 33 ° C, integratietijd, 15 sec; interval van 30 min (C) Effecten van kleine molecule inhibitoren op cellular ritmes van U2OS reporter cellen. Chir99021 en roscovitine remmers tegen GSK-3 en CDK respectievelijk. Het ViewLux systeem (Chir99021 assay) en een Tecan luminometer (roscovitine assay) werden gebruikt voor bioluminescentie opnamen van cellen in 384 putjes. Figuur is een bewerking van Reference # 19 (Copyright 2008 National Academy of Sciences, USA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4234/4234fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> .

Geen belangenconflicten verklaard.

1. Wijzigingen aan huidige protocol 1.1 Opname apparaten en doorvoer overwegingen Vanwege de commerciële beschikbaarheid, heeft de LumiCycle (Actimetrics) uitgegroeid tot de meest gebruikte automatische luminometer apparaat voor real-time opname 4,5,9,19,29-31. De LumiCycle werken fotomultiplicatorbuizen (PMTs) als lichtdetectoren, die zeer hoge gevoeligheid en weinig ruis 14 te verschaffen, en is daarom bijzonder geschikt voor data-acquisitie va...

<table border="1"><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> HyClone </td><td> SH30243FS </td><td> Voor reguliere celgroei </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12100-046 </td><td> Voor luminometry </td></tr><tr><td> FBS </td><td> HyClone </td><td> SH3091003 </td><td></td></tr><tr><td> Pen / Strep / Gin (100x) </td><td> HyClone </td><td> SV3008201 </td><td></td></tr><tr><td> B-27 </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> D-Luciferin </td><td> Biosynth </td><td> L-8220 </td><td></td></tr><tr><td> Poly-L-lysine </td><td> Sigma </td><td> P4707 </td><td></td></tr><tr><td> Polybreen </td><td> Millipore </td><td&gt; TR-1003-G </td><td></td></tr><tr><td> Forskoline </td><td> Sigma </td><td> F6886 </td><td></td></tr><tr><td> Alle andere chemicaliën </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Uitrusting </td></tr><tr><td> Weefselkweek incubator </td><td></td><td></td><td> 5% CO2 bij 37 ° C </td></tr><tr><td> Weefselkweek kap </td><td></td><td></td><td> BSL-2 gecertificeerd </td></tr><tr><td> Light &amp; fluorescentiemicroscoop </td><td></td><td></td><td> Fasecontrast optionele </td></tr><tr><td> LumiCycle </td><td> Actimetrics </td><td></td><td></td></tr></table>

monitoring cell-autonome circadiane klok rhythms of genexpressie met behulp van luciferase bioluminescentie reporters

Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

In zoogdieren, zijn veel aspecten van het gedrag en de fysiologie, zoals slaap-waak cyclus en de lever metabolisme gereguleerd door endogene circadiane klokken (beoordeeld 1,2). De circadiane tijdwaarneming systeem is een hiërarchisch multi-oscillator-netwerk, met de centrale klok in de suprachiasmatische kern (SCN) synchroniseren en coördineren van extra-SCN en perifere klokken elders 1,2. Individuele cellen de functionele eenheden voor het genereren en onderhouden van circadiane ritmes 3,4, en deze oscillatoren van verschillende weefseltypen in het organisme hebben een opmerkelijk vergelijkbare biochemische mechanisme van negatieve feedback. Vanwege interacties op het neurale netwerk niveau in de SCN en door ritmische, systemische signalen op de organismaal niveau worden circadiane ritmes op organismaal niveau niet noodzakelijk cel-autonome 5-7. Vergeleken met traditionele studies van bewegingsactiviteit in vivo en ex vivo SCN explantaten, cell-gebaseerd in vitro assays zorgen voor ontdekking van cel-autonome circadiane gebreken 5,8. Strategisch, cel-gebaseerde modellen zijn meer experimenteel handelbaarder voor fenotypische karakterisering en snelle ontdekking van de fundamentele klokmechanismen 5,8-13. Omdat circadiaanse ritmes zijn dynamische, zijn longitudinale metingen met een hoge temporele resolutie die nodig is om klokfunctie te beoordelen. In de afgelopen jaren is real-time opname met bioluminescentie vuurvlieg luciferase reporter als een gebruikelijke techniek voor het bestuderen circadiane ritmes in zoogdieren 14,15, omdat het zorgt voor het onderzoek van de persistentie en dynamica van moleculaire ritmes. Om cel-autonome circadiane ritmes van genexpressie controleren, kan luciferase reporters in cellen worden geïntroduceerd via transiënte transfectie 13,16,17 of stabiele transductie 5,10,18,19. Hier beschrijven we een stabiele transductie protocol met lentivirus gemedieerde genafgifte. Thij lentivirale vector systeem superieur aan traditionele methoden zoals voorbijgaande transfectie en kiemlijntransmissie vanwege de efficiëntie en de veelzijdigheid en maakt het mogelijk efficiënte levering en stabiele integratie in het gastheergenoom van zowel delende als niet-delende cellen 20. Zodra een reporter cellijn wordt vastgesteld, kan de dynamiek van klokfunctie worden onderzocht door middel van bioluminescentie opname. We beschrijven eerst de generatie van P (Per2)-d Luc reporter lijnen, en vervolgens presenteren van gegevens uit deze en andere circadiane verslaggevers. In deze testen worden 3T3 muisfibroblasten en U2OS menselijke osteosarcoomcellen als cellulaire modellen. We bespreken ook de verschillende manieren van het gebruik van deze klok modellen in circadiane studies. Hier beschreven methoden kunnen worden toegepast op een grote verscheidenheid aan celtypen om de cellulaire en moleculaire basis van biologische klok bestuderen en kan nuttig zijn in de aanpak van problemen in andere biologische systemen.

Circadiane klokken functioneren binnen de individuele cellen, dat wil zeggen, ze zijn cel-autonoom. We beschrijven werkwijzen voor het genereren van cel-autonome klok modellen niet-invasieve, luciferase-gebaseerde real-time bioluminescentie technologie. Reporter cellen handelbaar, functionele modelsystemen voor het bestuderen van circadiane biologie.

Monitoring Cell-autonome circadiane klok Rhythms of genexpressie met behulp van Luciferase Bioluminescentie Reporters

Bij zoogdieren worden veel aspecten van het gedrag en de fysiologie, zoals slaap-waakcycli en het levermetabolisme, gereguleerd door endogene circadiane klokken ...

Dit protocol beschrijft in detail het genereren van luciferase-reportercellijnen en de daaropvolgende monitoring van celautonome circadiane ritmes van bioluminescentie-expressie. Constructeer eerst lentivirale luciferase-expressiereporters en produceer lentivirale deeltjes, om vervolgens de gewenste cellen te infecteren en geselecteerde culturen te amplificeren. Monitor daarna de bioluminescentie-expressie in gesynchroniseerde reportercellen met behulp van een geschikt registratieapparaat.Uiteindelijk wordt de registratie van bioluminescentie gebruikt om celautonome circadiane ritmes aan te tonen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals transiënte transfectie en kiemlijnprotectie, is dat VIR-gemedieerde genintegratie zorgt voor een stabiele integratie in het genoom van de cellen, evenals een grotere efficiëntie en veelzijdigheid.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van onderzoek naar circadiane klokken. Zijn er bijvoorbeeld weefselspecifieke circadiane klokken? Zo ja, wat zijn de eigenschappen van deze weefselspecifieke circadiane klokken?Hoewel deze methode inzicht kan bieden in klokmechanismen, k

monitoring-cell-autonomous-circadian-clock-rhythms-gene-expression

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De circadiane klok regelt ongeveer een derde van de Arabidopsis transcriptoom, maar het percentage van genen die te gebruiken bij tijdwaarneming blijft onbekend. Hier visualiseren we een methode om circadiane fenotypes snel te beoordelen in welke mutant lijn van Arabidopsis met behulp van lichtgevende beeldvorming van een circadiaan reporter tijdelijk tot expressie gebracht in protoplasten.

Snelle analyse van het circadiaans fenotypes in Arabidopsis protoplasten getransfecteerd met een Lichtgevende klok Reporter

Hier beschrijven we instellingen om parallel de circadiane bioluminescentie en de secretoire activiteit van humane eilandcellen en primaire myotubes te monitoren. Hiervoor gebruikten we lentivirale genoverdracht van een luciferase kernklok reporter, gevolgd door in vitro synchronisatie en het verzamelen van uitstroommedium door continue celperfusie.

Parallel Meting van de circadiane klok genexpressie en hormoon in Human primaire celculturen

Een in vitro bioluminescentie test om te bepalen van cellulaire circadiane ritme in de borstklier epitheliale cellen wordt gepresenteerd. Deze methode maakt gebruik van zoogdiercellen verslaggever plasmiden gedestabiliseerd luciferase onder de controle van de periode 2 gen promotor uitdrukken. Het kan worden aangepast aan andere celtypes te evalueren orgel-specifieke effecten op de circadiane ritme.

In Vitro Bioluminescentie Assay te karakteriseren Circadian Rhythm in borstklier epitheliale cellen

Genetisch gecodeerde luciferase is een populaire niet-invasieve verslaggever van genexpressie. Gebruik van een geautomatiseerde longitudinale luciferase imaging gas - en temperatuur-geoptimaliseerde recorder (ALLIGATOR) staat longitudinale opname van bioluminescente cellen onder een brede waaier van voorwaarden stelt. Hier laten we zien hoe ALLIGATOR kan worden gebruikt in het kader van circadiane ritmen onderzoek.

Flexibele meting van bioluminescente verslaggevers met behulp van een geautomatiseerde longitudinale Luciferase Imaging Gas - en temperatuur-geoptimaliseerde Recorder (ALLIGATOR)

Deze nieuw ontwikkelde fluorescentie gebaseerde technologie kan op lange termijn van de transcriptie van de circadiane klok genen in de suprachiasmatic kern (SCN) vrij bewegen muizen in real time en met een hoge temporele resolutie.

In Vivo Controle van de circadiane klok genexpressie in de muis Suprachiasmatic kern met behulp van fluorescentie verslaggevers

Hier presenteren we een protocol te analyseren van cel naar cel overdracht van oscillerende informatie door optogenetic control en live monitoring van genexpressie. Deze aanpak biedt een uniek platform om te testen een functionele betekenis van dynamische gen expressie programma's in meercellige systemen.

Een Optogenetic methode te controleren en analyseren van gen expressiepatronen in cel-naar-cel interacties

Neurale stam/voorlopercellen vertonen verschillende expressie dynamiek van Inkeping signalering componenten die leiden tot verschillende uitkomsten van cellulaire gebeurtenissen. Een dergelijke dynamische uitdrukking kan worden onthuld door real-time monitoring, niet door statische analyse, met behulp van een zeer gevoelig bioluminescentie beeldvormings systeem dat visualisatie van snelle veranderingen in genexpressies mogelijk maakt.

Real-time bioluminescentie beeldvorming van Inkeping signalering dynamiek tijdens Murine neurogenese

Circadiane ritmes, die in de meeste organismen voorkomen, reguleren de tijdelijke organisatie van biologische processen. 3D-organoïden zijn onlangs naar voren gekomen als een fysiologisch relevant in vitromodel . Dit protocol beschrijft het gebruik van bioluminescente reporters om circadiane ritmes in organoïden te observeren, waardoor in vitro onderzoek naar circadiane ritmes in meercellige systemen mogelijk wordt.

Circadiane oscillaties monitoren met een bioluminescentiereporter in organoïden

Dit rapport beschrijft een methode met een R-script in de open-source software RStudio om grootschalige datasets te analyseren die zijn verkregen uit tijdreeksexperimenten.

Een gebruiksvriendelijke en krachtige R-analyse van grootschalige datasets

Bacteriële Gene Expression analyse met behulp van Microarrays

Leer hoe je luciferase-reportercellijnen genereert en circadiane ritmen monitort met bioluminescentie. Deze methode biedt stabiele integratie en efficiëntie voor circadiaan biologisch onderzoek.

Monitoring Cell-autonome circadiane klok Rhythms of genexpressie met behulp van Luciferase Bioluminescentie Reporters

Meer video's verkennen