Monitoring Cell-autonome circadiane klok Rhythms of genexpressie met behulp van Luciferase Bioluminescentie Reporters

Dit protocol beschrijft in detail het genereren van luciferase-reportercellijnen en de daaropvolgende monitoring van celautonome circadiane ritmes van bioluminescentie-expressie. Constructeer eerst lentivirale luciferase-expressiereporters en produceer lentivirale deeltjes, om vervolgens de gewenste cellen te infecteren en geselecteerde culturen te amplificeren. Monitor daarna de bioluminescentie-expressie in gesynchroniseerde reportercellen met behulp van een geschikt registratieapparaat.

Uiteindelijk wordt de registratie van bioluminescentie gebruikt om celautonome circadiane ritmes aan te tonen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals transiënte transfectie en kiemlijnprotectie, is dat VIR-gemedieerde genintegratie zorgt voor een stabiele integratie in het genoom van de cellen, evenals een grotere efficiëntie en veelzijdigheid.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van onderzoek naar circadiane klokken. Zijn er bijvoorbeeld weefselspecifieke circadiane klokken? Zo ja, wat zijn de eigenschappen van deze weefselspecifieke circadiane klokken?

Hoewel deze methode inzicht kan bieden in klokmechanismen, kan zij ook worden toegepast op andere systemen, zoals de dynamiek van de celcyclus, tumorgenese, enzovoort. We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we besloten om weefsel- of celtypespecifieke biologische klokken te bestuderen.

De procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. Chita Norm Napkin, postdoc-onderzoeker, en Sandra, een promovendus uit mijn laboratorium Atory. Normaal gesproken bevat een mammaliaans circadiaan reporterconstruct een expressiecassette waarin een circadiane promotor is gefuseerd met het luciferase-gen. In deze lentivirale reporter staat de gedestabiliseerde luciferase onder controle van de muis per2-promotor.

Raadpleeg voor gedetailleerde instructies over het construeren van reportervectoren via recombinatiereacties het bijbehorende manuscript voor efficiënte transfectie. Begin met een cultuur van menselijke embryonale niercellen met een laag passagegetal die 90 tot 100% confluent zijn. We gaan nu over tot het coaten van zeswelts cultuurplaten.

Voeg voor de transfectie één milliliter 0,001% poly-L-lysine toe aan elke put, laat dit 20 minuten incuberen bij kamertemperatuur en spoel eenmaal met PBS. Oogst vervolgens de cellen met trypsine en zaai de cellen uit over elke put van de vooraf gecoate platen. Schud de platen rond om een gelijkmatige verdeling van de cellen te verkrijgen.

Verifieer of de gezaaide cellen een confluentie van 80 tot 90% hebben bereikt in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Bereid het plasmidtransfectiemengsel van een lentiviraal reporterplasmid, DNA en de drie packagingvectoren voor als controle voor zowel de transfectie als de daaropvolgende infectie. Voeg een extra well toe voor een lentivirale GFP-expressievector die het enhanced green fluorescent protein bevat onder controle van de CMV-promotor.

Voeg vervolgens 100 µL 0,25 M calciumchloride toe aan de plasmiden en meng dit grondig. Voeg daarna 100 µL 2X BBS-oplossing toe en meng voorzichtig maar grondig. Incubeer het DNA-mengsel gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.

Vervang tijdens het wachten het medium van de 2 9 3 T-cellen door twee milliliters vers medium. Plaats de plaat gedurende ten minste 10 minuten terug in de incubator om de pH van het medium te laten equilibreren. Voeg vervolgens de transfectiemix druppelgewijs toe aan de cellen, draai de plaat voorzichtig rond, observeer de vorming van partikels onder een microscoop en plaats de cellen daarna gedurende de nacht in een incubator.

Ongeveer 16 uur na transfectie wordt het medium aangevuld met twee milliliters vers DMEM en wordt dit gedurende de nacht gecultiveerd. Beoordeel vervolgens de EGFP-expressie in de transfectiecontrolecellen om de transfectie-efficiëntie vast te stellen. Een transfectie-efficiëntie van 90 tot 100% met een hoge EGFP-expressie is een betrouwbare voorspeller voor een goede virale preparatie.

Oogst het medium dat de uitgescheiden infectieuze virusdeeltjes bevat, centrifugeer dit om de resterende 293T-cellen te verwijderen en verzamel het virushoudende supernatant. Zaai op dag drie ongeveer 12 000 293T-cellen uit op een 12-wells plaat, cultiveer deze gedurende de nacht tot een confluentie van 20 tot 30% en observeer de cellen op dag vier. Voeg op dag vier polybrene toe aan het verzamelde medium met virusdeeltjes en meng dit goed door te pipetteren.

Aspireer nu het medium uit de drie T3-cellen en voeg één milliliter viraal mengsel per well toe. Incubeer bij 37 °C gedurende de nacht. Nadat de cellen eenmaal zijn gewassen met PBS, wordt het medium aangevuld en worden de cellen gedurende de nacht bij 37 °C geïncubeerd voor herstel en groei. Wanneer de cellen confluent zijn, worden ze gesplitst en de volgende dag gedurende de nacht gecultiveerd.

Om de selectie van geïnfecteerde cellen te starten, voegt u vers medium toe dat 10 µg/mL bevat. De concentratie blasticidine die nodig is om de cellen te doden, moet empirisch worden bepaald voor elke cellijn. Vernieuw het medium met blasticine elke twee tot drie dagen voor de continue selectie van antibioticaresistente cellen.

Expressie van klok-reporters. Nadat de blasticine-resistente reportercellijn is uitgeplaat in cultuurschalen van 35 millimeter tot confluentie, bereiden we gewoonlijk drie of meer schalen voor per reportercellijn onder elke conditie voor het circadiane fenotype. Na één keer wassen met PBS voegen we DMEM toe dat 10 µM forskoline of 200 nM dexamethason bevat en incuberen we dit 1 uur bij 37 °C om de cellen te synchroniseren.

Plaats de cellen nu in vers bereid opnamemedium. Dek de kweekschalen af met steriele dekglasjes van 40 millimeter en sluit deze af met vacuümvet om verdamping te voorkomen. Plaats de schalen in de lumous cycle luminometer en start de realtime bioluminescentie.

Registratie Voor de registratie van 96 oude platen. Met het GSR twee registratieapparaat, zie het bijgevoegde manuscript. We registreren eenvoudig het ritme gedurende vijf tot zeven dagen in het lum cycle analyseprogramma.

Pas eerst een basislijn aan op de ruwe gegevens. Gebruik vervolgens de gegevens na aftrekking van de basislijn om een sinusgolf te fitten en de vereiste parameters te bepalen voor monsters die aanhoudende ritmes vertonen. Een fit-kwaliteit van meer dan 90% wordt eenvoudig bereikt vanwege de hoge transiënte luminantie.

Sensing opstarten en medium vervangen. Voor de presentatie van de gegevens sluiten we gewoonlijk de eerste cyclus van gegevens uit van onze analyse. Zet indien nodig de ruwe gegevens uit tegen de tijd.

Zet de baseline-gecorrigeerde gegevens uit om de amplitude en fase te vergelijken bij zowel de transiënte transfectie van 2 9 3 T-cellen als bij de infectie van cellijnen. Fluorescente beelden van de getransfecteerde en getransduceerde GFP-expresserende cellen geven aan dat het lentivirale genoverdrachtsysteem zeer efficiënt is. De centrale feedbackloop van een circadiane klok bestaat uit transcriptiefactoren die inwerken op circadiane enhancer-elementen om ritmische genexpressie te produceren.

Hier produceren vier verschillende reporterconstructen in drie T three-cellen verschillende fasen van reporterexpressie. Nieuwe tussenfasen kunnen worden gegenereerd met combinatorische regulatie door meerdere circadiane elementen met behulp van gene knockdown via RNAi en farmacologisch actieve verbindingen. In dit experiment werd de lum cycle luminometer gebruikt voor de bioluminescentie-registratie van cellen in 35 millimeter schaaltjes in U2 OS-cellen.

Irna werd gebruikt om de knockdown-effecten van de cry one- en cry two-genen te belichten. Hierbij werd een synergetische luminometer gebruikt voor de bioluminescentie-registratie van cellen. In een 96-wells plaat in drie T three-reportercellen.

RNA's werden gebruikt om de effecten van triune knockdown op cellulaire ritmes te evalueren. In dit voorbeeld werden het UX-systeem en een Tecan-luminometer gebruikt voor de bioluminescentie-registratie van cellen in 3 84. Terwijl platen werden geselecteerd zoals aangegeven, kunnen kleine moleculen de proteïnefunctie in de cellulaire ritmes van U2 OS-reportercellen farmacologisch targeten en verstoren.

Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoek binnen de circadiane biologie om klokmechanismen en fysiologie in verschillende cel- en weefseltypen te bestuderen. Na het bekijken van deze video zou men een goed begrip moeten hebben van hoe luciferase-reportercellijnen moeten worden gegenereerd en hoe de volumes moeten worden gemonitord.

Vergeet niet dat het werken met het virus uiterst gevaarlijk kan zijn, en dat voorzorgsmaatregelen, zoals persoonlijke beschermingsmiddelen en virale decontamination, altijd moeten worden genomen bij het uitvoeren van deze procedure.