Monitoring Cell-autonome circadiane klok Rhythms of genexpressie met behulp van Luciferase Bioluminescentie Reporters

Dit protocol beschrijft de generatie van luciferase reporter cellijnen en het daaropvolgende monitoren van cel autonoom circadiane ritmes van bioluminescentie expressie. Eerst constructeer lentivirale luciferase expressie reporters en produceer lentivirale deeltjes, ga door naar het infecteren van de cellen van belang en versterk geselecteerde culturen. Vervolgens monitor de bioluminescentie expressie in gesynchroniseerde reporter cellen met behulp van een geschikt opname apparaat.

Uiteindelijk wordt bioluminescentie opname gebruikt om cel autonoom circadiane ritmes te demonstreren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals transiente transfectie en de germinale bescherming is dat VIR wordt gemedieerd. Gen biedt stabiele integratie in het cel genoom, evenals grotere efficiëntie en veelzijdigheid.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van biologische klok onderzoek. Bijvoorbeeld, zijn er weefselspecifieke circadiane klokken? Als dat zo is, wat zijn de eigenschappen van weefselspecifieke circadiane klokken?

Hoewel deze methode inzicht kan geven in klok mechanismen. Het kan ook worden toegepast op andere systemen zoals dynamica van de celcyclus, tumorgenese, enzovoort. We hadden eerst het idee voor deze methode toen we besloten om weefsel of cel type specifiek veilige klokken te bestuderen.

Het demonstreren van de procedure zal Dr. Chita Norm Napkin, een postdoc fellow, en Sandra, een afstudeer student uit mijn lab Atory zijn. Typisch bevat een zoogdier circadiane reporter construct een expressie cassette waarin een circadiane promotor is gefuseerd met het luciferase gen. In deze lentivirale reporter staat de gedestabiliseerde luciferase onder de controle van de muis per twee promotor.

Voor gedetailleerde instructies over het construeren van reporter vectoren door recombinatie reactie, raadpleeg het bijbehorende manuscript voor efficiënte transfectie. Begin met een cultuur van humane embryonale niercellen met een laag passagenummer die 90 tot 100% confluent zijn. Nu om zes, wel cultuur platen te coaten.

Voor de transfectie, voeg een milliliter van 0,001% poly L lysine toe aan elke wel, incubeer het op kamertemperatuur gedurende 20 minuten en spoel eenmaal met PBS. Verzamel vervolgens de cellen met behulp van trypsine en zaai de cellen in elke wel van de vooraf gecoate platen. Draai de platen om een gelijkmatige verdeling van cellen te verkrijgen.

Controleer of de gezaaide cellen een confluëntie van 80 tot 90% hebben bereikt in een 1,5 milliliter micro centrifugeerbuisje. Bereid de plasmide transfectie mix voor van een lentivirale reporter plasmide, DNA en de drie verpakkingsvectoren als controle voor zowel transfectie als daaropvolgende infectie. Bevat een extra wel voor een lentivirale GFP expressie vector die het verbeterde groene fluorescente proteïne bevat onder de controle van de CMV promotor.

Voeg vervolgens 100 microliter van 0,25 molair calciumchloride toe aan de plasmiden en meng grondig. Voeg vervolgens 100 microliter van twee XBBS oplossing toe en meng voorzichtig maar grondig. Incubeer de DNA mix gedurende 15 minuten op kamertemperatuur.

Terwijl gewacht wordt, vervang het medium van de 2 9 3 T cellen met twee milliliter vers medium. Plaats de plaat terug in de incubator gedurende ten minste 10 minuten om de medium pH in evenwicht te brengen. Voeg vervolgens druppelsgewijs de transfectie mix toe aan de cellen, draai de plaat voorzichtig en observeer de vorming van deeltjes onder een microscoop, en plaats vervolgens de cellen in een incubator overnacht.

Ongeveer 16 uur na transfectie ververs het medium met twee milliliter vers DMEM en kweek overnacht. Om de transfectie efficiëntie te beoordelen, evalueer de EGFP expressie in de transfectie controle cellen. Een transfectie efficiëntie van 90 tot 100% met hoge EGFP expressie is een betrouwbare voorspeller van een goede virale voorbereiding.

Verzamel het medium dat gesecreteerde infectieuze virale deeltjes bevat, centrifugeer om de resterende 2 9 3 T cellen te verwijderen en verzamel het virus bevattende supernatant. Zaai op dag drie ongeveer 12, 003 T drie cellen op een 12 wel plaat, kweek overnacht tot 20 tot 30% confluëntie en observeer de cellen op dag vier. Nog steeds op dag vier, voeg polybrein toe aan het verzamelde medium dat virale deeltjes bevat en meng goed door te pipetteren.

Aspirier nu het medium van de drie T drie cellen en voeg een milliliter van viraal mengsel per wel toe. Incuber 37 graden Celsius overnacht na het wassen van de cellen eenmaal met PBS, ververs het medium en incubeer de cellen gedurende 37 graden Celsius overnacht voor herstel en groei. Wanneer confluënt splits de cellen en kweek de volgende dag overnacht.

Om de selectie van geïnfecteerde cellen te starten, voeg vers medium toe dat 10 microgram per milliliter bevat. Blastic aside, De blastzuur in kill car moet empirisch worden bepaald voor elke cellijn. Ververs het medium dat blastin bevat om elke twee tot drie dagen voor continue selectie van antibioticum resistente cellen.

Expressie van klok reporters. Na het propageren van de blastin resistente reporter cellen, kweek in 35 millimeter kweek schalen tot confluëntie, We bereiden meestal drie of meer schalen voor elke reporter cellijn onder elke voorwaarde voor sarcy fenotype. Na een wasbeurt met PBS voeg DMEM toe dat 10 micromolair forline of 200 nanomolair dexamethason bevat, incubeer gedurende 37 graden Celsius gedurende een uur om de cellen te synchroniseren.

Plaats nu de cellen in vers gemaakt opname medium. Bedek de kweek schalen met 40 millimeter steriele deksels en verzegel op hun plaats met vacuüm vet om verdamping te voorkomen. Laad de schalen op de lumous cyclus luminometer en start de realtime bioluminescentie.

Opname Voor opname 96 oude plaat. Met de GSR twee opname apparaat zie bijbehorend manuscript. We nemen gemakkelijk het ritme op voor vijf tot zeven dagen In het lum cyclus analyse programma.

Eerst baseline pas de ruwe data aan. Gebruik vervolgens de baseline afgetrokken data om aan te passen aan een sinusgolf en bepaal de vereiste parameters Voor monsters die aanhoudende ritmes vertonen. Een goedheid van voeten up data dan 90