Generatie van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen uit perifeer bloed Met behulp van de STEMCCA lentivirale vector

Het protocol demonstreert hoe menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen efficiënt kunnen worden gegenereerd uit vier milliliters perifeer bloed. Isoleer en expandeer op dag nul de mononucleaire cellen uit het perifere bloedmonster. Transduceer de primaire cellen met de herprogrammerings-stem-co-vector.

Ga op dag negen over tot het uitplaten van de getransduceerde cellen op geïnactiveerde embryonale fibroblasten van muis en kweek deze gedurende ongeveer drie weken. Selecteer de HESC-achtige kolonies voor expansie en karakterisering. Resultaten van immunofluorescentiekleuring voor de expressie van pluripotentiemarkers zoals SSEA4, TRA-1-60 en TRA-1-81.

Demonstreer de efficiënte generatie van geïnduceerde humane pluripotente stamcellen. Het gebruik van de stemcel-antivirale vector om humane geïnduceerde pluripotente stamcellen te genereren biedt verschillende voordelen ten opzichte van andere bestaande methoden. Wellicht het meest aantrekkelijk is de algehele eenvoud van de benadering, aangezien deze enkel toegang tot donorweefsel vereist, waarmee ik bedoel gemakkelijk verkrijgbare monsters van perifeer bloed.

De belangrijkste kenmerken van deze methode zijn de efficiëntie van de rep-programmering en de kwaliteit van de verkregen iPS-celklonen. De procedure wordt gedemonstreerd door Andrea January Summer, een postdoctoral fellow in mijn lab, en Sarah Rozelle, een promovendus in het lab van George Murphy. Alles op dag nul.

Trek vier milliliters perifeer bloed op in een vacutainer-celpreparatiebuis met natriumcitraat. Keer de buis acht tot 10 keer om binnen twee uur na afname. Centrifugeer het monster bij 1 800 G gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur om de mononucleaire cellen te verzamelen.

Zuig het plasma af en pipetteer de buffy coat (de cellaag tussen de gelbarrière en het plasma) weg. Overbreng de buffy coat naar een steriele conische centrifugebuis van 15 milliliter en vul het totale volume aan tot 10 milliliters met steriele PBS. Keer de buizen meerdere keren om en centrifugeer bij 300 G gedurende 15 minuten.

Resuspendeer de celpellet in 10 milliliters steriele PBS, voer een celtelling uit en breng vervolgens één tot twee maal 10^6 cellen over in een steriele 15 milliliter conische centrifugebuis. Oogst de cellen door middel van centrifugatie en resuspendeer de pellet in twee milliliters expansiemedium. Zaai vervolgens de geïsoleerde mononucleaire cellen in één putje van een 12-wellplaat en kweek deze bij 37 °C en 5% CO2.

Oogst de resterende cellen door centrifugatie en vries op dag drie en zes voorraden in te vriezen van ongeveer 2 × 10⁶ cellen per vial in FBS met 10% DMSO. Breng de cellen over naar een steriele conische buis van 15 milliliter en was de well één keer met één milliliter QBSF 60 stamcelmedium om de adherente cellen te verzamelen.

Oogst de cellen door middel van centrifugatie en resuspendeer de celpellet in twee milliliter em. Breng de celsuspensie vervolgens over naar één putje van een 12-wellplaat en plaats de cultuur op dag negen terug in de incubator. Breng de cellen over naar een steriele conische buis van 15 milliliter en was het putje één keer met één milliliter QB SF 60 stamcelmedium. Om de adherente cellen te verzamelen, wordt de cultuur gecentrifugeerd bij 300 G gedurende 10 minuten.

Resuspende vervolgens de celpellet in één milliliter vers EM dat vijf microgram per milliliter poly brain en STEM-lentivirus bevat voor een MOI van 1 tot 10. Draag de suspensie daarna over naar één putje van een 12-wellplaat en centrifugeer 90 minuten bij 2.250 RPM bij 25 °C. Voeg een extra milliliter vers EM toe dat vijf microgram per milliliter poly brain bevat, voor een totaal van twee milliliter EM, en plaats de plaat op dag 10 in de celkweekincubator.

Nadat de cellen zijn geoogst zoals eerder beschreven, wordt het celpellet geresuspendeerd in twee milliliters EM-medium. De getransduceerde cellen in één putje van een 12-wells plaat op dag 11 worden gebruikt om de putjes van een 6-wells plaat te coaten met 0,1% gelatine, waarna geïnactiveerde embryonale muis-fibroblasten in meth-medium worden uitgeplaat met een dichtheid van twee keer 10⁵ cellen per putje. Bereid drie putjes per infectie.

Oogst de volgende dag de getransduceerde mononucleaire cellen zoals eerder beschreven. Resuspendeer na centrifugatie de celpellet in drie milliliters meth-medium met BFGF, ascorbinezuur en groeifactoren.

Aspire nu het medium uit de MES-plaat, één milliliter van de MC's per put OFMs. Voeg vervolgens 1,5 milliliter compleet meth-medium toe en centrifugeer de plaat bij 500 RPM bij 25 °C gedurende 30 minuten. Cultureer daarna bij 37 °C en 5% koolstofdioxide gedurende twee dagen, vanaf dag 14.

Vul het medium om de dag aan met 2,5 milliliters meth-medium dat 10 nanograms per milliliter BFGF en 50 micrograms per milliliter ascorbinezuur bevat, maar geen groeifactoren. Rond dag 20, zodra er kleine kolonies verschijnen, moeten de cellen dagelijks worden gevoed met twee milliliters medium voor humane embryonale stamcellen tussen dag 30 en 40. Selecteer elke kolonie en breng deze over naar individuele putjes van een 12-wells plaat, vooraf behandeld met geïnactiveerde maths die één milliliter HESC-medium plus ROCK-inhibitor bevatten; voed de cellen dagelijks.

Vervolgens, met één milliliter HESC-medium zonder de rock-inhibitor, zijn de uit menselijke monocyten afgeleide pluripotente stamcellen nu klaar voor immunofluorescentiekleuring van pluripotentiemarkers en voor excisie van de geïntegreerde herprogrammeringscassette. Tijdens dit protocol ondergaan de cellen verschillende morfologische veranderingen van P BMCs naar de generatie van menselijke I PSCs. Op dag nul worden de geïsoleerde mononucleaire cellen uit perifeer bloed na negen dagen gekweekt in expansiemedium.

Er worden trossen druiven waargenomen, vergelijkbaar met celclusters, wat erop wijst dat de cellen gezond zijn en prolifereren vóór de transductie. Rond dag 21 na het uitplaten van de cellen op MAs vormen zich kolonies. Op dag 30 vertonen de IPSC-kolonies een typische morfologie die lijkt op die van menselijke embryonale stamcellen.

Deze immunofluorescentieanalyse van IPC's gegenereerd uit pbmc laat de expressie zien van de pluripotentiemarkers SSEA four, trial one 60 en trial 180 1. De I PSC's kleuren daarnaast positief voor alkalische fosfatase. Deze afbeeldingen tonen de stappen om transgene-vrije IPC's te genereren door transfectie met een plasmid coex dat CRE-recombinase en een purmycine-resistentiegen tot expressie brengt, zoals beschreven door summers et al. 2010; in vergelijking met IPC's vóór transfectie wordt celdood waargenomen.

Na twee dagen purmycine-selectie ontstaan er nieuwe kolonies uit resistente cellen, ongeveer 10 dagen na transfectie. Southern blot-analyses van geselecteerde kolonies bevestigen de excisie van het transgen. Banen 1, 3, 5 en 7 tonen de aanwezigheid van het transgen in iPSC-klonen vóór de excisie. Deze banden zijn afwezig in banen 2, 4, 6 en 8 na excisie van het transgen. Na het bekijken van deze video zou u in staat moeten zijn om consistent en robuust hoogwaardige, normale of ziektespecifieke menselijke iPS-cellen te genereren uit kleine hoeveelheden perifeer bloed van elk individu.

Deze aanpak vereenvoudigt het proces van rep-programmering om het breed toegankelijk te maken voor de stamcelgemeenschap. Tegelijkertijd biedt het een basislijn voor de generatie van een meer homogene populatie stamcellijnen.