Een protocol voor het analyseren van hepatitis C virus replicatie

Het algemene doel van deze procedure is om verschillende stadia van de replicatiecyclus van het hepatitis C-virus te onderzoeken. Dit wordt bereikt door eerst HCV-genomisch RNA te genereren, transcripten van gelinieerde HCV-plasmideconstructies. De tweede stap is het transfecteren van de cellen met H-C-V-R-N-A.

Vervolgens worden de cellen voor verschillende tijdstippen en assays geplaatst. De laatste stap is het verzamelen van het celcultuursupernatant voor het meten van het virale titer en het oogsten van getransfecteerde cellen voor eiwit en RNA. Uiteindelijk worden reverse transcriptie, PCR, Western blotting, immunofluorescentie-assay en HCV-titer uitgevoerd en tonen een robuust HCV-infectieus celcultuursysteem aan.

Het belangrijkste voordeel van dit infectieuze hepatitis C-virus celcultuursysteem ten opzichte van het HCV-replicantsysteem is dat de virale binnenkomst via assemblage en uittreding kunnen worden onderzocht. Dit protocol kan helpen bij het beantwoorden van de belangrijkste vragen in het gebied van hepatitis C-virologie, zoals Vion, morfogenese en gastheer-pathogeen-interactie. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot vaccinontwikkeling omdat het de karakterisering van geattenueerde virale stammen mogelijk maakt die kunnen worden geëvalueerd als mogelijke vaccinkandidaten.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in het hepatitis C-virus, kan deze ook worden toegepast op andere RNA-virussen in de familie van lab verde. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode worden geconfronteerd met de uitdaging om hoogwaardig HCV-genomisch RNA te genereren voor studie. De volledige replicatiecyclus van HCV werd haalbaar in celcultuur na de ontdekking van een genotype twee A HCV Japanse fulminante Hepatitis een isolaat.

Visuele demonstratie van virologisch assay is cruciaal omdat de assay expertise vereist in zowel moleculaire als cellulaire technieken. Gebruik een intra genotype twee A chimerisch virus, F-N-X-H-C-V en F-N-X-H-C-V poll null HCV voor evaluatie van virale replicatie. Lineairiseer eerder gegenereerde virale plasmiden door middel van digestie met XBA een restrictie-enzym in een twee milliliterbuis. Behandel vervolgens de plasmiden met mung bone nuclease om stompe uiteinden te genereren.

Zuiver de gedigesteerde plasmiden door middel van anionenuitwisselingschromatografie. Controleer de integriteit van het gelinieerde plasmide door DNA te onderwerpen aan AROS gelelektroforese. Voeg vervolgens het gelinieerde plasmide DNA-sjabloon toe aan een 0,2 milliliterbuis die T zeven RNA-polymerasereactiecomponenten bevat om HCV-genomisch RNA-transcripten te synthetiseren.

Zuiver de nieuw gesynthetiseerde DNA's behandelde RNA met behulp van een RNA-zuiveringskit. Controleer vervolgens de RNA-productie door middel van Agros gelelektroforese. Kwantificeer het RNA vervolgens door middel van spectrale fotometrie.

Los HU zeven gebaseerde adhesieve cellen los met behulp van trypsine-enzymbehandeling en verzamel de cellen in een 50 milliliter kegel. Twee volgende centrifugatiesus. Suspendeer het cellenpellet met koud laag serum media Na herhaling van de centrifugatie, suspendeer de cellen in laag serum media bij een tijd van 10 tot de zeven cellen per milliliter.

Vervolgens meng je een totaal van 10 microgram getranscribeerd virologisch RNA met 400 microliter resuspendeerde cellen in een voorgekoelde 0,4 centimeter elektroporatievet. Lever het virale RNA in de cellen af met behulp van een elektroporatie op 270 volt, 100 ohm en 950 micro ferres. Wanneer je klaar bent, suspendeer de elektroporeerde cellen in 10 milliliter volledig groeimedium met 15%FBS op dit punt. Plaats de cellen in zowel T 25 kolven bij ongeveer 1,2 keer 10 tot de zes cellen per kolf en 48 welborden bij een keer 10 tot de vierde cellen per put voor 4 48 en 96 uur tijdstippen. Vervang het medium bij vier tot acht uur na transfectie met vers aangevuld groeimedium met 10%FBS om dood celdebris uit de gekweekte kolven en borden te verwijderen.

Gebruik een serologische pipet om de celcultuursupernatanten bij de 48 N 96 uur tijdstippen te oogsten in een 15 milliliter kegelbuis. Vervolgens verwijder je celdebris van de verzamelde monsters door centrifugatie bij 15.000 RPM gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius na centrifugatie. Bewaar de celvrije supernatanten bij min 80 graden Celsius.

Lyseer de cellen voor eiwit- en RNA-analyse door middel van western blot en reverse transcriptie kwantitatieve PCR of R-T-Q-P-C-R op de aangegeven tijdstippen. Reverse transcribeer één microgram van totaal cellulair RNA met behulp van reverse transcriptase-enzym en een specifiek primer voor de HCV-zinsschakelaar die bindt aan de vijf prime onvertaalde regio in een 0,2 milliliterbuis. Reverse transcribeer ook F-N-X-H-C-V-R-N-A van bekende genoomkopieën met behulp van een HCV-zinsschakelaar primer met behulp van een realtime PCR-systeem.

Voer QPCR uit door 50 nanogram van de resulterende getranscripeerde CD NA te gebruiken met specifieke HCV-primers en DNA-bindend groen kleurstof bevattende QPCR-supermix. Gebruik de volgende voorwaarden bij het uitvoeren van QPCR om het H-C-V-R-N-A-kopienummer na QPCR te bepalen. Los het cellysaat op van het virale RNA dat is getransfecteerd bij 96 uur.

Gebruik na transfectie SDS-pagina. Breng vervolgens de opgeloste eiwitten in de gel over naar een polyvinyldifluoridemembraan door middel van de transplot turbo-methode. Blokkeer het membraan met behulp van een blokkeringsoplossing die 5% magere melk en 0,2% tween 20 in PBS bevat en plaats het in een container.

Incubeer het membraan met primaire muis monoklonale antilichamen en S3 bij een verdunning van één op 1000 en beta-actine bij een verdunning van één op 5000 in een koude kamer van vier graden Celsius. Voeg na incubatie geitenanti-muis immunoglobuline G geconjugeerd aan paardenradensperoxidase toe bij een verdunning van één op 5000 en detecteer door middel van chemiluminescentie. Fixeer op dit punt de H-C-V-R-N-A getransfecteerde cellen met methanol gedurende 30 minuten bij min 20 graden Celsius voor de immunofluorescentie-assay.

Was de cellen