Name: Een protocol voor het analyseren van hepatitis C virus replicatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 4 s
Description: Leer een protocol voor het analyseren van hepatitis C virus replicatie met behulp van celtransfectie en virologische assays. Deze methode ondersteunt onderzoek naar virale replicatiecyclus en therapeutische strategieën.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken F. Chisari voor het verstrekken van de Huh-7.5.1-cellijn. Wij willen Justine Ho bedanken voor het bewerken van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door Cedars-Sinai Medical Center Institutioneel Programmatisch Onderzoeksaward en National Center for Advancing Translational Sciences, Grant UL1TR000124 aan V.A.

Een algemeen overzicht van het protocol is geïllustreerd in figuur 1. 1. Cellen <ol><li> Bereid compleet groeimedium dat 10-15% foetaal runderserum (FBS), 10 mM niet-essentiële aminozuren, 10 mM Hepes, penicilline (100 eenheden / ml), streptomycine (100 mg / ml) en 2 mM L-glutamine bevat. </li><li> Handhaaf Huh-7.5.1 cellen 13 volledig groeimedia die de hierboven supplementen voor in vitro analyse van hepatitis C virale replicatiecyclus. </li><li> Cultuur virusstammen in Huh-7.5.1 cellen met de gespecificeerde aangevuld kweekmedium bij 37 ° C met 5% CO2. </li></ol> 2. Virus en plasmideconstructen <ol><li> Genereer de complementaire DNA (cDNA) vorm van HCV RNA en het kloneren in een plasmide vector voor het gemak van genetische manipulatie. Opmerking: De ontdekking van de Japanse fulminante hepatitis 1, JFH-1 (HCV genotype 2a), isoleer heeft kritisch voor onderzoek HCV geweest envoornamelijk voor het HCV replicatiecyclus 11-13 bestuderen. Inter-en intragenotypic chimère virussen gebaseerd op JFH-1 HCV worden vaak gebruikt in onderzoek 14-18. Bouw van synthetische intragenotype 2a chimere virus, FNX-HCV, en een monocistronische chimere reporter stam was eerder 19 en bouwdetails vallen buiten het bestek van dit protocol beschreven. </li><li> Gebruik pFNX-HCV intragenotype 2a virus als het bevat een 5&#39;NTR structurele gebieden en p7, en een deel van de NS2 niet-structurele gebieden (nucleotiden 1-2878) van de J6CF ouderstam (toegangsnummer NCBI Nr. AF177036), zoals alsook de niet-structurele componenten van de JFH-1 virale stam (NCBI toetreding geen. AB047639). Opmerking: FNX-HCV werd gesynthetiseerd gebaseerd op de sequentie van Jc1 intragenotype 2a chimere HCV eerder gerapporteerd 15. </li><li> Genereer een monocistronisch chimere reporter viraal construct, de pFNX-Rluc basis van de pFNX-HCV-stam (aangehaald in stap 2.2) door er een Renilla luciferasegen tussen de 5 &#39;NTR en core-gen (tussen nt 388 en 389). Vervolgens sluit u de luciferasegen en core-gen van deze constructie gebruik van een mond-en klauwzeer virus 2A (F2A) peptide sequentie, die zou werken als een decollete signaal. </li><li> Ingenieur het RNA-polymerase-null (Pol-) virale construct met behulp van de pFNX-HCV of het pFNX-Rluc virale achtergrond. Vervang de NS5B polymerase katalytische residuen GDD (aa 2759-2761; nt 8615-8623), een van deze virale backbones met AAG aminozuurresten. </li></ol> 3. In vitro HCV RNA transcriptie <ol><li> Gebruik een intragenotype 2a chimere virus FNX-HCV en FNX-HCV Pol null (Pol-) HCV voor de evaluatie van virale replicatie (Figuur 2A). </li><li> Lineariseren de virale plasmiden met restrictie-enzym XbaI en daarna behandelen met mung bean nuclease om stompe uiteinden te genereren. Zuiver het verteerd plasmiden door anionenwisselingschromatografie. Controleer de integriteit of het gelineariseerde plasmide-DNA door het onderwerpen gelelektroforese (figuur 2B) agarose. </li><li> Transcriberen de gelineariseerde virale plasmiden met de T7-RNA polymerase. </li><li> Zuiver het nieuw gesynthetiseerde DNase behandelde RNA met een RNA zuiveringskit. </li><li> Controleer de RNA productie door agarose gelelektroforese (figuur 2C). </li><li> Kwantificeren van de RNA door spectrofotometrie. </li><li> Bewaar de gegenereerde RNA -80 ° C in 10 ug aliquots werken. Opmerking: variatie RNA kwaliteit minimaliseren binnen elke proefopzet transcriberen alle RNA voor elk monster en virale controle tegelijk. </li></ol> 4. HCV RNA Transfectie en Sample Collection <ol><li> Oogst de Huh-7.5.1 cellen met behulp van trypsine. </li><li> Om cellen, centrifuge spoelen en resuspendeer de schorsing tweemaal met koude laag serum media. Resuspendeer de cellen in laag serum media 1 x 10 7 cellen per ml. </li><li> Meng een totaal van 10 &amp; #956, g getranscribeerd viraal RNA met 400 ul van geresuspendeerde cellen (4 x 10 6 cellen) in een 0,4 cm elektroporatie-cuvette. Transfecteren de cellen via elektroporatie bij 270 V, 100 Ω en 950 uF. </li><li> Resuspendeer de geëlektroporeerde cellen in 10 ml compleet kweekmedium met 15% FBS. Opmerking: Verhoogde overlevingsvermogen van geëlektroporeerde cellen wordt gezien wanneer de Huh-7.5.1-cellen werden gekweekt in 15% foetaal runderserum. </li><li> Plaat de cellen in zowel T-25 kolven (~ 1,2 x 10 6 cellen per kolf) en 48 putjes (1 x 10 4 cellen per putje) voor elk van de volgende tijdstippen: 4, 48 en 96 uur. </li><li> Vervang het medium bij 4-8 uur na transfectie met verse AANGEVULD groeimedium met 10% FBS om dode celresten uit de gekweekte kolven en platen te verwijderen. </li><li> Oogst celcultuur supernatanten op 48, 96 uur tijdstippen en cellulaire resten te verwijderen van verzamelde monsters door centrifugering van cellen bij 1500 rpm gedurende 10 min bij 4 º C. </li><li> Bewaar de cel-vrije supernatanten bij -80 º C. Lyseren van de cellen op eiwit en RNA analyse door Western blot en omgekeerde transcriptie-kwantitatieve PCR op de aangegeven tijdstippen. </li></ol> 5. Reverse transcriptie-kwantitatieve PCR (RT-qPCR) voor het beoordelen van de HCV-exemplaren van het genoom <ol><li> Voer een twee-staps RT-qPCR aan de HCV RNA genoom aantal kopieën te bepalen. </li><li> Reverse transcriptie 1 ug totaal cellulair RNA met behulp van reverse transcriptase en een primer specifiek voor HCV sense streng die bindt aan 5&#39;NTR (JFH RTQ R: 5&#39;CCTATCAGGCAGTACCACA-3 &#39;) of een primer specifiek voor huishoud-gen peptidylprolyl isomerase G (R PPIG : 5&#39;-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3 &#39;). Ook reverse transcriberen FNX-HCV-RNA (gegenereerd in stap 3) van bekende exemplaren van het genoom (10 januari-10 september-standaard) met sense HCV streng primer. </li><li> Verricht qPCR met behulp van 50 ng van de resulterende getranscribeerd cDNA met behulp van specifieke primers HCV (JFH RTQF: 5&#39;CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5&#39;CCTATCAGGCAGTACCACA-3 &#39;) en DNA bindende groene kleurstof bevattende qPCR super mix. Voer qPCR voor huishoud-gen PPIG evenals (primers PPIG F: 5&#39;-GAAGAGTGCGATCAAGAACCCATGAC-3 &#39;; PPIG R: 5&#39;-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3&#39;) Opmerking: Voor de berekening van accurate intracellulair HCV-RNA-niveau in monsters, gebruiken cellulaire huishoud-gen, PPIG , expressie (Ct cyclus) voor normalisatie. Gebruik het aantal kopieën van de FNX-HCV-genoom als de standaard voor het aantal kopieën bepalen. </li><li> Gebruik de volgende voorwaarden bij het uitvoeren van qPCR HCV RNA aantal kopieën te bepalen: 95 º C gedurende 15 seconden en 60 &#160; º C gedurende 30 sec (40 cycli) met behulp van real-time PCR-systeem. </li><li> Zie Figuren 3A en 3B voor genoomreplicatie resultaten. </li></ol> 6. Western blot analyse voor het detecteren van HCV-eiwitexpressie (figuur 3C) <ol><li> Gebruik cellysaten frOM viraal RNA getransfecteerd bij 96 uur na transfectie voor eiwit western blotting analyse. </li><li> Los het cellysaat met SDS-PAGE en transfer naar polyvinylideendifluoride (PVDF) membraan. </li><li> Blokkeer het membraan met behulp van een blokkerende oplossing die 5% magere melk, 0,2% Tween 20 in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). </li><li> Incubeer het membraan met primaire muis monoklonaal antilichaam NS3 (1 op 1000 verdunning) en beta-actine (1 op 5000 verdunning). </li><li> Add geit anti-muis IgG geconjugeerd aan mierikswortelperoxidase (1 in 5000 verdunning) en gedetecteerd door chemiluminescentie. </li></ol> 7. Immunofluorescentietest (IFA) <ol><li> Bevestig de HCV-geïnfecteerde en getransfecteerde cellen met methanol gedurende 30 minuten bij -20 ° C voor immunofluorescentie assay. </li><li> Was de cellen met PBS drie keer en blokkeren met IFA blokkerende buffer. </li><li> Gebruik konijn polyklonaal anti-NS5A primair antilichaam (vriendelijk verschaft door Dr Dasgupta, UCLA) of muizen monoklonale anti-DSRNA antilichaam J2 bij een verdunning van 1:200 (1 ug / ml) en incubeer gedurende 5 uur &#39;s nachts bij 4 º C. </li><li> Was de cellen met PBS driemaal na het primaire antilichaam. </li><li> Add geit anti-konijn IgG polyklonaal 488 secundair antilichaam of geit anti-muis IgG polyklonaal 594 secundair antilichaam bij een 1:1000 verdunning (1 ug / ml) en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Was de cellen met PBS drie keer en vlek kernen met behulp van Hoechst kleurstof en bekijken met behulp van fluorescentie microscoop (Figuur 3D). </li></ol> 8. Meten virustiter <ol><li> Plate naïeve Huh-7.5.1 cellen bij ongeveer 3 x 10 3 cellen / putje met een 96-wells plaat. De volgende dag voeren 10-voudige seriële verdunningen van celvrij supernatant geoogst van HCV RNA getransfecteerde cellen met kweekmedium en beënt in drievoud op Huh-7.5.1 cellen. </li><li> Fix cellen op 72 uur na infectie met behulp van methanol (30 minuten bij -20 </sup&gt; º C) en immunostain voor HCV NS5A eiwit zoals vermeld in het hoofdstuk 7. </li><li> Gebruik de hoogste verdunning te tellen voor de NS5A positieve brandpunten en bereken het gemiddelde aantal van de focus vormende eenheid (FFU) per milliliter. Zie Figuur 4 voor HCV titer. </li></ol> 9. Renilla luciferasereporter test voor virale genoom replicatie en besmettelijkheid <ol><li> Voor evaluatie virale genoom replicatie, plaat HCV-RNA geëlektroporeerd Huh-7.5.1 cellen in drievoud in 48 putjes (1 x 10 4 cellen / putje). </li><li> Lyseren van de cellen met 75 ul van passieve lysis buffer bij de 6 uur, 48 uur en 96 uur na transfectie. </li><li> Schud de platen voorzichtig gedurende 15 min bij kamertemperatuur en bewaar bij -80 ° C. </li><li> Om de Renilla luciferase enzymatische activiteit te meten, dooi lysaat eiwit en Renilla luciferase assay reagens op kamertemperatuur. </li><li> Voeg 20 ul van eiwit lysaat per putje van een 96-wel<html> l witte luminescentie plaat en plaats de plaat in een lichtmeter. </li><li> Doseer 100 ul Renilla luciferasetest reagens (coelenterazine substraat + buffer) per goed en na 2 sec pre-lezen vertraging; integreren het uitgezonden licht gedurende 10 sec. </li><li> Bereken het gemiddelde en standaardafwijking voor elk monster uit de luciferase waarden van biologische drievoud en onderwerpt de gegevens aan statistische analyse (figuur 5). </li><li> Ter beoordeling van infectiviteit, enten 500 ui celvrij supernatant, verkregen uit HCV-RNA-getransfecteerde cellen voor de aangegeven tijdstippen (48 uur en 96 uur) in drievoud op naïeve Huh-7.5.1 cellen in 48-well platen. </li><li> Vervang de virale inoculum met 500 ul vers medium per well na 6 uur na infectie. </li><li> Lyse van de cellen op 48 uur na infectie en onderworpen aan Renilla luciferase assay zoals beschreven in stap 8,2-8,7 (figuur 5). </li></ol>TITEL &quot;&gt; 10. Statistische analyse <ol><li> De fout bars in de grafieken geven standaarddeviaties (SD). De P-waarden werden berekend door de ongepaarde t-test. </li></ol>

<ol><li>Alter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((J.+Epidemiology+of+hepatitis+C%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology.%22%5BJournal%5D)">J. Epidemiology of hepatitis C.</a> Hepatology.. 26(3 Suppl 1), (1997).</li>
<li>Alter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((J.+Epidemiology+of+hepatitis+C+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">J. Epidemiology of hepatitis C virus infection.</a> World J Gastroenterol. 13 (17), 2436-2441 (2007).</li>
<li>Lavanchy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+burden+of+hepatitis+C%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Int%22%5BJournal%5D)">The global burden of hepatitis C.</a> Liver Int. 29 (Suppl 1), 74-81 (2009).</li>
<li>Lindenbach, B. D., Thiel, H. J., Rice, C. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLindenbach%2C+BD+%22Flaviviridae%3A+viruses+and+their+replication+in+Fields+Virology%22">Flaviviridae: viruses and their replication in Fields Virology</a>. , Philadelphia, PA. 1101-1152 (2007).</li>
<li>Ciesek, S., Manns, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+in+2010%3A+the+dawn+of+a+new+era+in+HCV+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Hepatitis in 2010: the dawn of a new era in HCV therapy.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8 (2), 69-71 (2011).</li>
<li>Ghany, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update+on+treatment+of+genotype+1+chronic+hepatitis+C+virus+infection%3A+2011+practice+guideline+by+the+American+Association+for+the+Study+of+Liver+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">An update on treatment of genotype 1 chronic hepatitis C virus infection: 2011 practice guideline by the American Association for the Study of Liver Diseases.</a> Hepatology. 54 (4), 1433-1444 (2011).</li>
<li>Choo, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+cDNA+clone+derived+from+a+blood-borne+non-A%2C+non-B+viral+hepatitis+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome.</a> Science. 244 (4902), 359-362 (1989).</li>
<li>Kolykhalov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+of+hepatitis+C+by+intrahepatic+inoculation+with+transcribed+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transmission of hepatitis C by intrahepatic inoculation with transcribed RNA.</a> Science. 277 (5325), 570-574 (1997).</li>
<li>Lohmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+subgenomic+hepatitis+C+virus+RNAs+in+a+hepatoma+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line.</a> Science. 285 (5424), 110-113 (1999).</li>
<li>Blight, K. J., Kolykhalov, A. A., Rice, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+initiation+of+HCV+RNA+replication+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Efficient initiation of HCV RNA replication in cell culture.</a> Science. 290 (5498), 1972-1974 (2000).</li>
<li>Lindenbach, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+replication+of+hepatitis+C+virus+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Complete replication of hepatitis C virus in cell culture.</a> Science. 309 (5734), 623-626 (2005).</li>
<li>Wakita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+infectious+hepatitis+C+virus+in+tissue+culture+from+a+cloned+viral+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome.</a> Nat Med. 11 (7), 791-796 (2005).</li>
<li>Zhong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+hepatitis+C+virus+infection+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Robust hepatitis C virus infection in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (26), 9294-9299 (2005).</li>
<li>Yi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensatory+mutations+in+E1%2C+p7%2C+NS2%2C+and+NS3+enhance+yields+of+cell+culture-infectious+intergenotypic+chimeric+hepatitis+C+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Compensatory mutations in E1, p7, NS2, and NS3 enhance yields of cell culture-infectious intergenotypic chimeric hepatitis C virus.</a> J Virol. 81 (2), 629-638 (2007).</li>
<li>Pietschmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+characterization+of+infectious+intragenotypic+and+intergenotypic+hepatitis+C+virus+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Construction and characterization of infectious intragenotypic and intergenotypic hepatitis C virus chimeras.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (19), 7408-7413 (2006).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+full-length+hepatitis+C+virus+genotype+1+%28strain+TN%29+infectious+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Highly efficient full-length hepatitis C virus genotype 1 (strain TN) infectious culture system.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (48), 19757-19762 (2012).</li>
<li>Yi, M., Lemon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotype+1a+HCV+%28H77S%29+infection+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genotype 1a HCV (H77S) infection system.</a> Methods Mol Biol. 510, 337-346 (2009).</li>
<li>Gottwein, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+hepatitis+C+reporter+viruses+with+genotype+1+to+7+core-nonstructural+protein+2+%28NS2%29+expressing+fluorescent+proteins+or+luciferase+in+modified+JFH1+NS5A%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Development and application of hepatitis C reporter viruses with genotype 1 to 7 core-nonstructural protein 2 (NS2) expressing fluorescent proteins or luciferase in modified JFH1 NS5A.</a> J Virol. 85 (17), 8913-8928 (2011).</li>
<li>Arumugaswami, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+functional+profiling+of+hepatitis+C+virus+genome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">High-resolution functional profiling of hepatitis C virus genome.</a> PLoS Pathog. 4 (10), (2008).</li>
<li>Chu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+enhancer+and+critical+cis-acting+RNA+elements+in+the+protein-encoding+region+of+the+hepatitis+C+virus+genome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome.</a> J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).</li>
<li>Salloum, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab18+binds+to+hepatitis+C+virus+NS5A+and+promotes+interaction+between+sites+of+viral+replication+and+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Rab18 binds to hepatitis C virus NS5A and promotes interaction between sites of viral replication and lipid droplets.</a> PLoS Pathog. 9 (8), (2013).</li>
<li>Gonzalez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+an+optimal+RNA+transfection+reagent+and+comparison+to+electroporation+for+the+delivery+of+viral+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Selection of an optimal RNA transfection reagent and comparison to electroporation for the delivery of viral RNA.</a> J Virol Methods. 145 (1), 14-21 (2007).</li>
<li>Phan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+C+virus+NS2+protein+contributes+to+virus+particle+assembly+via+opposing+epistatic+interactions+with+the+E1-E2+glycoprotein+and+NS3-NS4A+enzyme+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Hepatitis C virus NS2 protein contributes to virus particle assembly via opposing epistatic interactions with the E1-E2 glycoprotein and NS3-NS4A enzyme complexes.</a> J Virol. 83 (17), 8379-8395 (2009).</li>
<li>Schaller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+hepatitis+C+virus+superinfection+exclusion+by+using+novel+fluorochrome+gene-tagged+viral+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Analysis of hepatitis C virus superinfection exclusion by using novel fluorochrome gene-tagged viral genomes.</a> J Virol. 81 (9), 4591-4603 (2007).</li>
<li>Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+hepatitis+C+virus+lacking+the+envelope-encoding+genes+for+single-cycle+infection+by+providing+homologous+envelope+proteins+or+vesicular+stomatitis+virus+glycoproteins+in+trans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Production of hepatitis C virus lacking the envelope-encoding genes for single-cycle infection by providing homologous envelope proteins or vesicular stomatitis virus glycoproteins in trans.</a> J Virol. 85 (5), 2138-2147 (2011).</li>
<li>Jones, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+C+virus+p7+and+NS2+proteins+are+essential+for+production+of+infectious+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Hepatitis C virus p7 and NS2 proteins are essential for production of infectious virus.</a> J Virol. 81 (16), 8374-8383 (2007).</li>
<li>Steinmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+C+virus+p7+protein+is+crucial+for+assembly+and+release+of+infectious+virions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Hepatitis C virus p7 protein is crucial for assembly and release of infectious virions.</a> PLoS Pathog. (7), (2007).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Deze illustratie beschrijft een werkwijze voor het analyseren van het hepatitis C virus replicatie cyclus. HCV is een menselijk pathogeen en het voorgeschreven protocol inzake bioveiligheid moeten strikt worden opgevolgd. Besmettelijke HCV celkweek systemen zijn eerder 11-13,16,17 beschreven. Er zijn enkele cruciale punten die we bij het volgen van de geïllustreerde protocol te implementeren. Ten eerste is het van groot belang om een ​​goede kwaliteit van intacte volledige lengte viraal genomisch RNA voor dow...

Hepatitis C virus (HCV) veroorzaakt cirrose en leverkanker. Het treft 170 miljoen mensen wereldwijd met 350.000 mensen sterven jaarlijks 1-3. HCV is een positieve streng RNA-virus met een genoom grootte van 9,6 kb. Het HCV-genoom wordt vertaald als een polyproteïne van ~ 3000 aminozuurresten die proteolytisch wordt gesplitst door verschillende cellulaire en virale proteasen in 10 polypeptiden. HCV is het prototype virus in het geslacht Hepacivirus en behoort tot de familie Flaviviridae 4. Bij blootstelling HCV vestigt een chronische infectie bij 80% van de individuen. De infectie is meestal asymptomatisch en tijdige diagnose kan therapeutische interventie aan de lever achteruitgang te voorkomen toe te staan. Huidige behandeling niet optimaal en er geen vaccin beschikbaar is 5,6. De etiologie van hepatitis C werd eerst beschreven in 1989 7. Bestuderen HCV replicatie is belangrijk voor hepatitis C vaccin en behandelingsonderzoek, maar het waslang gehinderd door het ontbreken van een efficiënt viraal kweeksysteem. Een moleculaire kloon van HCV werd aangetoond besmettelijk bij chimpansees op intrahepatische inoculatie 8 zijn. Vervolgens werden sub-genomische HCV replicons beschreven, waardoor het virale genoom replicatie stadium ontleden in een celkweeksysteem 9,10. Ontdekking van een genotype 2a HCV isoleren JFH-1 (Japanse Fulminante hepatitis-1), kunnen infecteren celkweek nieuwe wegen geopend voor HCV replicatie onderzoek 11-13. Genotype 2a stam JFH-1 gebaseerde inter-en intra-genotypische chimere virussen en genotype 1 HCV gebaseerd besmettelijke cultuur systemen zijn ook beschikbaar 14-18. We hebben met succes gebruik JFH-1 stam en HCV intragenotype 2a chimere virus aan de hoge-resolutie functionele profilering kaart van eiwit domeinen en cis-werkende RNA elementen 19,20 te verkrijgen. Volgens deze hier beschrijven we een effectieve systeem routinematig gebruikt waarmeebestuderen van verschillende stadia van de HCV replicatiecyclus en gastheer-pathogeen interactie. We presenteren virologische assays virale genoom replicatie en de novo infectiviteit van intragenotype 2a HCV en Renilla luciferase reportergen HCV beoordelen.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&rsquo;s modified Eagle&rsquo;s medium (DMEM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>Non essential amino acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25025CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Reduced Serum Medium,no Phenol Red</td><td>Life Technologies</td><td>11058-021</td><td></td></tr><tr><td>Huh-7.5.1</td><td>The Scripps Research Institute</td><td></td><td>The cell line was kindly provided by Dr. Francis Chisari to Dr. Arumugaswami under executed MTA between The Scripps Research Institute and Cedars-Sinai Medical Center</td></tr><tr><td>Plasmids (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc, and pFNX-Rluc Pol null)&nbsp;</td><td>Cedars-Sinai Medical Center</td><td></td><td>The HCV plasmids were synthesized by Dr. Arumugaswami using overlapping oligo-nucleotides.&nbsp;</td></tr><tr><td>XbaI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>Mung Bean Nuclease</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>M0250S</td><td></td></tr><tr><td>T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System</td><td>Promega</td><td>P1320</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation Cuvette (4 mm)</td><td>Bioexpress</td><td>E-5010-4</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell Total System</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2660</td><td></td></tr><tr><td>mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2&nbsp;</td><td>English &amp; Scientific Consulting Kft.</td><td>10010200</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594</td><td>Life Technologies</td><td>A11020</td><td></td></tr><tr><td>PVDF membrane package</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0263</td><td></td></tr><tr><td>Blotting Grade Blocker Non Fat Dry Milk</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6404XTU</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6531XTU</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [8 G-2]</td><td>Abcam</td><td>ab65407</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [H23]</td><td>Abcam</td><td>ab13830</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG conjugated with horseradish peroxidase (HRP)&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td><td>115-035-003</td><td></td></tr><tr><td>Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagents&nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>RPN2236</td><td></td></tr><tr><td>SUPERSCRIPT III RT&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>18080085</td><td></td></tr><tr><td>SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX</td><td>Life Technologies</td><td>11744500</td><td></td></tr><tr><td>ViiA 7 real-time PCR system</td><td>Life Technologies</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Renilla Luciferase Assay System kit</td><td>Promega</td><td>E2810</td><td></td></tr><tr><td>RNase-Free DNase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>GloMax-Multi Detection System (Luminometer)</td><td>Promega</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

een protocol voor het analyseren van hepatitis c virus replicatie

A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication

Hepatitis C virus (HCV) treft 3% van de wereldbevolking en veroorzaakt ernstige leverkwalen waaronder chronische hepatitis, cirrose en leverkanker. HCV is een omhuld RNA-virus van de familie Flaviviridae. Voor deze behandeling niet volledig effectief en veroorzaakt bijwerkingen. Er is geen HCV-vaccin. Aldus is verdere inspanningen vereist voor een vaccin te ontwikkelen en betere therapie. Een HCV celcultuur systeem is essentieel voor het bestuderen van verschillende groeistadia HCV waaronder virale binnenkomst, genoom replicatie, verpakking en uitgang. In de huidige werkwijze voorgesteld, gebruikten we een wildtype intragenotype 2a chimeer virus, FNX-HCV, en een recombinant FNX-Rluc virus met een Renilla luciferase reportergen de virusreplicatie te bestuderen. Een menselijke hepatoomcellijn (Huh-7 gebaseerde) werd gebruikt voor transfectie in vitro getranscribeerde RNA HCV genoom. Celvrije kweeksupernatanten, eiwit lysaten en total RNA werden geoogst op verschillende tijdstippen na transfectie groei HCV beoordelen. HCV-genoom replicatie status werd geëvalueerd door kwantitatieve RT-PCR en visualiseren van de aanwezigheid van HCV dubbelstrengs RNA. De HCV-eiwitexpressie werd bevestigd door Western blot en immunofluorescentie assays met antilichamen specifiek voor HCV NS3 en NS5A eiwitten. HCV RNA getransfecteerde cellen vrijgegeven infectieuze deeltjes in de cultuur supernatant en de virale titer werd gemeten. Luciferasebepalingen werden gebruikt om de replicatie niveau en de besmettelijkheid van reporter HCV beoordelen. Samenvattend stellen wij diverse virologische assays voor het karakteriseren van verschillende stadia van de HCV replicatie cyclus.

Hepatitis C virus is een RNA-virus. Aldus genetische manipulatie Daartoe heeft de HCV genome cDNA gekloneerd in een bacterieel plasmide vector. Een T7 RNA polymerase promotersequentie werd onmiddellijk voor het einde van het HCV genoom van de 5 &#39;geïntroduceerd. Een algemeen overzicht van de analyse HCV werkstroom weergegeven in figuur 1. HCV RNA genoom genereren nauwkeurige 3 &#39;uiteinde, is het HCV-genoom bevattende plasmide geknipt met XbaI restrictie-enzym en de gegenereerde enkelstren...

Hepatitis C Virus (HCV) is een belangrijk humaan pathogeen dat leveraandoeningen veroorzaakt, inclusief cirrose en kanker. Een HCV-infectieus celkweeksysteem is essentieel voor het begrijpen van het moleculaire mechanisme van HCV-replicatie en het ontwikkelen van nieuwe therapeutische benaderingen. Hier beschrijven we een protocol om verschillende stadia van de HCV-replicatiecyclus te onderzoeken.

Een protocol voor het analyseren van hepatitis C virus replicatie

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and ...

Het algemene doel van deze procedure is het onderzoeken van verschillende fasen van de replicatiecyclus van het hepatitis C-virus. Dit wordt bereikt door eerst HCV-genomische RNA-transcripten te genereren uit gelineariseerde HCV-plasmideconstructen. De tweede stap is het transfecteren van de cellen met H-C-V-R-N-A. Vervolgens worden de cellen uitgeplaat voor verschillende tijdspunten en assays. De laatste stap is het verzamelen van het supernatant van de celkweek voor het meten van de virale titer en het oogsten van de getransfecteerde cellen voor eiwit- en RNA-analyse. Ten slotte worden reverse transcription-PCR, Western blotting, een immunofluorescentie-assay en de HCV-titer bepaald, wat aantoont dat er sprake is van een robuust infectieus HCV-celkweeksysteem.Het belangrijkste voordeel van dit celcultuursysteem voor het infectieuze hepatitis C-virus ten opzichte van het HCV-repliconsysteem is dat de stappen van virale entry, virionassemblage en egress kunnen worden onderzocht. Dit protocol kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de hepatitis C-virologie, zoals virionmorfogenese en de interactie tussen gastheer en pathogeen. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de ontwikkeling van vaccins, omdat het de karakterisering mogelijk maakt van geattenueerde virale stammen die kunnen worden geëvalueerd als potentiële vaccinkandidaten.Hoewel deze methode inzicht kan bieden in het hepatitis C-virus, kan deze ook worden toegepast op andere RNA-virussen uit de familie van de Flaviviridae. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode voor de uitdaging staan om genomisch HCV-RNA van hoge kwaliteit te genereren. Het bestuderen van de volledige replicatiecyclus van HCV werd haalbaar in celcultuur na de ontdekking van een genotype-2A HCV Japans fulminant Hepatitis one isolaat. Visuele demonstratie van de virologische assay is essentieel, omdat de assay expertise vereist in zowel moleculaire als cellulaire technieken.Gebruik een intra-genotype 2A chimeer virus, F-N-X-H-C-V en een F-N-X-H-C-V pol-null HCV voor de evaluatie van virale replicatie; lineariseer hiervoor eerder gegenereerde virale plasmiden door digestie met het restrictie-enzym XBA-one in een buisje van twee milliliter. Behandel de plasmiden vervolgens met mungboon-nuclease om blunt ends te genereren.Zuiver de gedigesteerde plasmiden middels anionenuitwisselingschromatografie. Verifieer de integriteit van het gelineariseerde plasmide door het DNA te onderwerpen aan agarosegelelektroforese. Voeg vervolgens het gelineariseerde plasmide-DNA-template toe aan een buisje van 0,2 milliliter met reactiecomponenten voor T-seven RNA-polymerase om HCV genomische RNA-transcripten te synthetiseren.Zuiver het nieuw gesynthetiseerde, met DNase behandelde RNA met behulp van een RNA-zuiveringskit. Verifieer vervolgens de RNA-productie via agarosegelelektroforese. Kwantificeer daarna het RNA door middel van spectrofotometrie.Los Huh-7 adherente cellen los met een trypsinebehandeling en verzamel de cellen in een conische buis van 50 milliliter. Resuspendeer na twee opeenvolgende centrifugaties de celpellet in koud medium met een laag serumgehalte. Herhaal de centrifugatie en resuspendeer de cellen vervolgens in medium met een laag serumgehalte op een concentratie van 1 × 10⁷ cellen per milliliter.Meng vervolgens in totaal 10 µg getranscribeerd viraal RNA met 400 µL geresuspendeerde cellen in een vooraf gekoelde electroporatiecuvet van 0,4 cm. Breng het virale RNA de cellen in via electroporatie bij 270 V, 100 Ω en 950 µF. Resuspendeer de geëlectroporeerde cellen na afloop in 10 mL compleet groeimedium met 15% FBS. Plaats de cellen op dit punt in zowel T 25-kolfjes met ongeveer 1,2 × 10⁶ cellen per kolfje als in 48-wells platen met 1 × 10⁴ cellen per well voor tijdspunten van 4, 48 en 96 uur. Vervang het medium vier tot acht uur na transfectie door vers aangevuld groeimedium met 10% FBS om dode celresten uit de gekweekte kolfjes en platen te verwijderen.Oogst de supernatanten van de celcultuur op de tijdstippen van 48 en 96 uur met een serologische pipette in een conische buis van 15 milliliter. Verwijder vervolgens celresten uit de verzamelde monsters door centrifugatie bij 15.000 rpm gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Bewaar de celvrije supernatanten na centrifugatie bij negatief 80 graden Celsius.Lyseer de cellen voor eiwit- en RNA-analyse via western blot en reverse transcriptase kwantitatieve PCR of RT-qPCR op de aangegeven tijdstippen. Zet één microgram totaal cellulair RNA om in cDNA met behulp van het reverse transcriptase-enzym en een specifieke primer voor de HCV-sense-streng die bindt aan de 5'-niet-vertaalde regio in een buisje van 0,2 milliliter. Zet daarnaast F-N-X-H-C-V-R-N-A van bekende genoomkopieën om in cDNA met behulp van een HCV-sense-strengprimer. Voer qPCR uit met een real-time PCR-systeem door 50 nanogram van het resulterende cDNA te gebruiken, samen met specifieke HCV-primers en een qPCR-supermix die DNA-bindende groene kleurstof bevat. Gebruik de volgende condities bij het uitvoeren van de qPCR om het H-C-V-R-N-A-kopiegetal te bepalen. Scheid na de qPCR het cellysaat van het virale RNA dat 96 uur na transfectie is getransfecteerd met behulp van SDS-PAGE. Transfer de gescheiden eiwitten in de gel vervolgens naar een polyvinylideenfluoride-membraan via de trans-blot turbo-methode. Blokkeer het membraan met een blokkeringsoplossing bestaande uit 5% magere melk en 0,2% Tween-20 in PBS en plaats dit in een container.Incubeer het membraan met primaire muis monoklonale antilichaam NS3 in een verdunning van 1:1000 en bèta-actine in een verdunning van 1:5.000 in een koelkamer van 4 °C. Voeg na incubatie geit anti-muis immunoglobuline-G geconjugeerd aan mierikswortelperoxidase toe in een verdunning van 1:5.000 en detecteer middels chemiluminescentie.Fix op dit punt de met HCV-RNA getransfecteerde cellen met methanol gedurende 30 minuten bij -20 °C voor de immunofluorescentie-assay. Was de cellen na afloop drie keer met PBS. Gebruik na blokkeren met immunofluorescentie-assay blokkeringsbuffer het konijn polyklonaal anti-NS5A primaire antilichaam en het muis monoklonaal anti-dsRNA antilichaam J2 in een verdunning van 1:200 en incubeer dit gedurende vijf uur tot overnacht in een koelruimte van 4 °C. Was de cellen na de incubatie drie keer met PBS na het primaire antilichaam. Voeg vervolgens geit anti-konijn immunoglobuline-G 488 polyklonaal secundair antilichaam en geit anti-muis immunoglobuline 594 polyklonaal secundair antilichaam toe in een verdunning van 1:1000 en incubeer dit gedurende één uur bij kamertemperatuur op een tafelrocker. Kleur na het drie keer wassen van de cellen met PBS de kernen met Hoechst-kleurstof en observeer deze met een fluorescentiemicroscoop.Zaai vervolgens naïeve Huh7.5.1-cellen uit in een 96-wells plaat met ongeveer 3 × 10³ cellen per well. Voer de volgende dag een tienvoudige seriële verdunning uit van celvrij cultuursupernatans, geoogst van HCV-RNA-getransfecteerde cellen, met gebruik van groeimedium en inoculeer dit in triplo op de Huh7.5.1-cellen. Fixeer de cellen 72 uur na infectie gedurende 30 minuten met methanol bij -20 °C. Nadat de cellen uit de vriezer zijn gehaald, worden ze immunogekleurd voor het HCV NS5A-eiwit volgens de eerder beschreven condities. Tel met een fluorescentiemicroscoop de NS5A-positieve cel-foci in de well met de hoogste virale verdunning en bereken het gemiddelde aantal focus-forming units per milliliter.De kwaliteit van het gelineariseerde HCV-plasmide werd beoordeeld via gelelektroforese. Het HCV-DNA werd onderworpen aan in vitro transcriptie gemedieerd door T7 RNA-polymerase, wat resulteerde in een enkel RNA-product van 9,6 kb. RT-qPCR-resultaten gaven aan dat het wildtype-virus het genoom efficiënt repliceerde. Het wildtype vertoonde een één tot drie log hogere mate van genoomreplicatie vergeleken met het pol-null-virus.Het wildtypevirus produceerde het NS3-eiwit dat betrokken is bij de virale eiwitsplitsing en genoomreplicatie. Het wildtypevirus expressieerde ook het NS5A-eiwit, waarbij het NS5A-eiwit en dubbelstrengs RNA colokaliseerden in het cellulaire cytoplasma van wildtype-getransfecteerde cellen, wat wijst op actieve virale replicatie. Metingen van de virustiter gaven aan dat het wildtypevirus infectieus is en meer dan 10.000 foci forming units per milliliter infectieuze deeltjes produceert. Zes uur na transfectie vertoonden zowel het wildtype- als de pol-null-virussen vergelijkbare luciferase-activiteiten, wat aangeeft dat een vergelijkbaar inputniveau van getransfecteerd RNA was vertaald. Echter, 48 uur en 96 uur na transfectie vertoonde het wildtypevirus verhoogde niveaus van genoomreplicatie in vergelijking met het pol-null-virus. Het wildtypevirus produceerde tevens viraal NS3-eiwit. Het pol-null-virus vertoonde een basale luciferase-activiteit, terwijl het wildtypevirus een twee tot drie log hogere replicatiegraad had in vergelijking met het pol-null-reportervirus. Zodra men hierin vaardig is, kunnen virologische assays voor Hepatitis-C in twee weken worden voltooid, mits ze correct worden uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om robuuste cellen en hoogwaardige HCV-genomische RNA-transcripten te gebruiken. Na deze procedure kunnen gekarakteriseerde HCV-stammen worden getest in diermodelssystemen om de in vivo fitness en gastheer-pathogeeninteracties te onderzoeken.De ontwikkeling van een infectieus HCV-celcultuursysteem heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers om de virion-morfogenese en de stappen van virale egress in de HCV-replicatiecyclus te bestuderen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in het uitvoeren van verschillende virologische assays voor het karakteriseren van diverse stadia van de replicatiecyclus van het hepatitis-C-virus. Vergeet niet dat werken met het hepatitis-C-virus extreem gevaarlijk kan zijn en dat er altijd veiligheidsvoorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het dragen van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen, tijdens het uitvoeren van deze procedure.

a-protocol-for-analyzing-hepatitis-c-virus-replication

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Er zijn twee methoden van Heterokaryon vorming van HCV Beperking Factoren Ontdek

Source: Allaire, A., et al. Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus. J. Vis. Exp. (2015).The video demonstrates the procedure for preparing cells to assess the intracellular uptake and activity of an antiviral agent against the hepatitis C virus.

Preparing Cells to Analyze Intracellular Uptake and Activity of an Antiviral Agent

Source: Ren, S., et al. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (2014).This video demonstrates the procedure for quantifying Hepatitis C viral RNA using quantitative reverse transcription PCR to measure viral load in infected cell cultures.

Measuring Hepatitis C Viral Load Using Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

Source: Ren, S., et al. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (2014).This video demonstrates an immunofluorescence-based method to detect Hepatitis C virus replication in infected hepatoma cells. The protocol involves cell fixation, antibody staining for viral protein and double-stranded RNA, and visualization using fluorophore-tagged secondary antibodies. Dual signal detection under a fluorescence microscope confirms active viral replication within the host cells.

Immunofluorescence Assay to Detect Hepatitis C Virus Replication Complexes in Infected Cells

This video demonstrates a viral attachment assay for screening antiviral compounds. Using genetically modified hepatitis C virus and luciferase, it assesses inhibitory effects on viral attachment, as indicated by lower light intensity in co-treated wells compared to wells treated with the virus alone.

A Viral Attachment Assay for Screening of Antiviral Compounds

This video demonstrates an assay to evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry into host cells and fusion with the endosome. The cells are incubated at a low temperature and then infected with HCV. The low temperature permits viral binding to host cells but inhibits internalization via endocytosis. The test antiviral compound is added, and the cells are incubated at physiological temperature. This shift to a higher temperature facilitates viral entry and allows...

An Assay to Evaluate the Effect of Test Compounds on Viral Entry and Fusion in Host Cells

Hier beschrijven we een nieuw ontwikkelde hepatitis B-virus (HBV) reportersysteem de vroege stadia van de levenscyclus HBV controleren. Deze vereenvoudigde in vitro systeem zal helpen bij het screenen van anti-HBV middelen met een high-throughput strategie.

Ontwikkeling van een Hepatitis B Virus reportersysteem de vroege stadia van de replicatiecyclus Monitor

Vetdruppels belangrijke organellen voor de replicatie van verschillende pathogenen, waaronder het hepatitis C virus (HCV). We beschrijven een methode om lipidedruppeltjes voor de kwantitatieve massaspectrometrie van geassocieerde eiwitten te isoleren; kan worden gebruikt onder verschillende omstandigheden, zoals virusinfectie, omgevingsstress of geneesmiddelbehandeling.

Lipide Druppeltje Isolatie kwantitatieve massaspectrometrie Analyse

We beschrijven hier de in vitro generatie HBV DNA via een Hepatitis B-virus infectie-systeem en de zeer gevoelige detectie van de integratie van de (1 – 2 kopieën) met behulp van inverse genest PCR.

Detectie van lage exemplaar nummer geïntegreerde viraal DNA gevormd door In Vitro Hepatitis B-infectie

Het doel van dit protocol is bedoeld als een stapsgewijze handleiding om uit te voeren van de experimenten van de 3-D "lever-on-a-chip" infectie met het hepatitis B-virus.

"Lever-on-a-Chip" culturen van primaire hepatocyten en Kupffer cellen voor Hepatitis B-virusinfectie

Het protocol beschrijft een methode voor het introduceren van controleerbare genetische diversiteit in het genoom van het hepatitis C-virus door de synthese van mutant RNA over de volledige lengte te combineren met behulp van foutgevoelige PCR en omgekeerde genetica. De methode biedt een model voor fenotypeselectie en kan worden gebruikt voor 10 kb lange positive-sense RNA-virusgenomen.

Omgekeerde genetica om varianten van het RNA-virus met positieve zin te ontwikkelen

Leer een protocol voor het analyseren van hepatitis C virus replicatie met behulp van celtransfectie en virologische assays. Deze methode ondersteunt onderzoek naar virale replicatiecyclus en therapeutische strategieën.

Een protocol voor het analyseren van hepatitis C virus replicatie

Meer video's verkennen