Name: Het benutten van de Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloadditiereacties voor Pretargeted PET Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-03T15:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Leer een bioorthogonale inverse-electron-demand Diels-Alder cycloadditiereactie voor pretargeted PET-beeldvorming bij colorectale kanker. Deze methode biedt hoge contrastbeelden met lagere stralingsdoses dan traditionele technieken.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken Prof. Ralph Weissleder, Dr. Pat Zanzonico en Dr. NagaVaraKishore Pillarsetty voor nuttige gesprekken en de NIH voor financiering (BMZ: 1K99CA178205-01A1)

ETHIEK STATEMENT: Alle van de in vivo dierproeven beschreven werden uitgevoerd volgens een goedgekeurd protocol en onder de ethische richtlijnen van het Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC). 1. Synthese van Tz-Bn-NOTA <ol><li> In een klein reactievat, ontbinden 7 mg NH 2 -BN-NOTA (1,25 x 10 -2 mmol) in 600 ul NaHCO3 buffer (0,1 M, pH 8,1). Controleer de pH van de oplossing. Indien nodig, de pH van de oplossing tot 8,1 met kleine hoeveelheden van 0,1 M Na 2 CO 3. </li><li> Voeg de NH2 -BN-NOTA oplossing 0,5 mg Tz-NHS (1,25 x 10 -3 mmol) in een 1,7 ml microcentrifugebuis. OPMERKING: De Tz-NHS kan ofwel worden afgewogen droog of toegevoegd vanuit een stockoplossing van droge DMF of DMSO (&lt;50 pi). </li><li> Laat de verkregen reactieoplossing reageren gedurende 30 min bij KTonder zacht roeren. </li><li> Na 30 min, zuivert het product met omgekeerde fase C18 HPLC chromatografie gereageerde NH2 -BN-NOTA verwijderen. De NH2 -BN-NOTA kunnen worden gevolgd bij een golflengte van 254 nm, terwijl de Tz-NHS en Tz-Bn-NOTA best gevolgd bij een golflengte van 525 nm. OPMERKING: De retentietijden zijn uiteraard sterk afhankelijk van de HPLC-uitrusting opstart van elk laboratorium (pompen, kolommen, buizen, enz.). Echter, om een voorbeeld te presenteren, als een gradiënt van 0: 100 MeCN / H2O (beide met 0,1% TFA) tot 100: 0 MeCN / H2O gedurende 25 min en een analytisch 4,6 x 250 mm C 18 kolom gebruikt , de retentietijden van Tz-Bn-NOTA, Tz-NHS, en NH 2 -BN-NOTA zal ongeveer 15 min, 16,5 min en 10 min, respectievelijk. Het product kan worden gezuiverd van de andere reactiecomponenten in een enkele run of meerdere runs met een semi-preparatieve of preparatieve C 18 HPLC-kolom. 1H-NMR, analeytical HPLC, en ESI-MS zijn alle methoden die kunnen worden gebruikt om de zuiverheid van de voltooide Tz-Bn-NOTA precursor controleren. 11 </li><li> Bevries de verzamelde HPLC eluens met behulp van vloeibare stikstof. </li><li> Wikkel de collectie buis in ondoorzichtige aluminiumfolie. </li><li> Leg de bevroren collectie buis in een vriesdrogen vat O / N om het HPLC mobiele fase te verwijderen. </li><li> Bewaar het gezuiverde product (heldere roze vaste stof) in het donker bij -80 ° C. Opmerking: Dit is een aanvaardbare stopplaats in de procedure. De voltooide Tz-Bn-NOTA precursor is stabiel gedurende tenminste 1 jaar onder deze omstandigheden. </li></ol> 2. Voorbereiding van huA33-TCO immuunconjugaat <ol><li> In een 1,7 ml microcentrifugebuis, stelt een 1 mg / ml (2,7 mM) oplossing van TCO-NHS in droge DMF. </li><li> In een 1,7 ml microcentrifugebuis, stelt een 2 mg / ml (13,3 uM) oplossing van huA33 in 1 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing, pH 7,4 (0,01 M PO 4 3- </sub&gt; 0.154 M NaCl). </li><li> Gebruik van kleine hoeveelheden (&lt;5 ui) 0,1 M Na 2 CO 3, de pH van het antilichaam oplossing 8,8-9,0. Gebruik ofwel pH-papier of een pH-meter met een micro-elektrode om de pH te controleren, en wees voorzichtig niet om de pH boven pH 9,0 te stijgen. </li><li> Zodra het antilichaam oplossing de juiste pH, voeg een volume van de TCO-NHS die overeenkomt met 8 molaire equivalenten van de geactiveerde ester. Voeg bijvoorbeeld 7.9 ul van de 1 mg / ml TCO-NHS oplossing (1,07 x 10 -7 mol TCO-NHS) tot 1 ml 2 mg / ml huA33 antilichaam oplossing (1,33 x 10 -8 mol huA33). Niet meer dan 5% DMF per volume in de oplossing. </li><li> Meng de oplossing door het omkeren van de microcentrifugebuisje meerdere malen. </li><li> Wikkel de microcentrifugebuisje in ondoorzichtige aluminiumfolie. </li><li> Laat de oplossing geïncubeerd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur onder zacht roeren. </li><li> Na 1 uur bij KT, zuiveren de resulterende immunoconjugaat met een voorverpakte wegwerp SIZe uitsluiting ontzoutingskolom. Ten eerste spoel de grootte-uitsluiting beschreven door de leverancier conserveringsmiddelen aanwezig op de kolom tijdens opslag te verwijderen. Voeg vervolgens het reactiemengsel om de grootte-uitsluiting, spoel de kolom met 1,5 ml 0,9% steriele zoutoplossing, en vervolgens het product met 2 ml 0,9% steriele zoutoplossing als elutiemiddel verzamelen. OPMERKING: Deze stap zal het ingevulde huA33-TCO opleveren als een 2 ml oplossing. </li><li> Meet de concentratie van de verkregen huA33-TCO op een UV-Vis spectrofotometer. </li><li> Als een hogere concentratie gewenst, concentreren de huA33 TCO-oplossing met behulp van een centrifugale filtereenheid met een 50.000 molecuulgewicht cut-off. Opmerking: Het is belangrijk op te merken dat terwijl huA33 en diverse andere bekende antilichamen (bijvoorbeeld bevacizumab, trastuzumab, cetuximab en J591) zijn zeer tolerant geconcentreerd, aggregatie en precipitatie kan optreden bij concentraties in andere gevallen. Onderzoekers wordt geprobeerd dit procedure een nieuw antilichaam moet vertrouwen op de literatuur en hun eigen kennis van het antilichaam in kwestie met betrekking tot of het antilichaam concentreren. </li><li> Bewaar de ingevulde huA33-TCO immuunconjugaat bij 4 ° C in het donker. Opmerking: Dit is een aanvaardbare stopplaats in de procedure. De voltooide mAb-TCO conjugaat moet stabiel zijn gedurende ten minste 3 maanden onder deze opslagomstandigheden. </li></ol> 3. 64 Cu Radioactief merken van Tz-Bn-NOTA Opmerking: deze stap van het protocol omvat de behandeling en manipulatie van radioactiviteit. Voordat u deze stappen - of het uitvoeren van enig ander werk met radioactiviteit - onderzoekers moeten overleggen met Radiation Safety Department hun eigen instelling. Neem alle mogelijke stappen om de blootstelling aan ioniserende straling te minimaliseren. <ol><li> In een 1,7 ml microcentrifugebuis Bereid een 0,5 mg / ml (723 pM) oplossing van Tz-Bn-NOTA. </li><li> In een 1,7 ml MicroCentrifuge buis, voeg 10 ul van de Tz-Bn-NOTA oplossing (5 ug) 400 gl 0,2 M NH4 OAc pH 5,5 buffer. </li><li> In het belang van een goede radiochemische nota boekhouding, meten en registreren van de hoeveelheid radioactiviteit in het monster met een dosiskalibrator vóór en na de daaropvolgende stappen in de onderstaande protocol (3,4-3,8). Dit zal helpen bij de nauwkeurige bepaling van radiochemische opbrengsten. </li><li> Voeg 2,000 uCi (74 MBq) van 64 Cu de Tz-Bn-NOTA oplossing. OPMERKING: Typisch [64 Cu] CuCl2 wordt in een klein volume (&lt;30 pi) 0,1 N HCl, en aldus slechts kleine hoeveelheden (&lt;10 pi) van deze voorraadoplossing nodig voor radiolabeling reactie. Als grotere volumes van de [64 Cu] CuCl2 voorraad nodig zijn, de radiomerking reactie is tolerant ten opzichte van het totale volume reactie verhogen. Toch moet de pH van de radioactief reactieoplossing zorgvuldig worden gecontroleerd om te waarborgendat niet onder pH 4,0 valt. </li><li> Laat de oplossing geïncubeerd gedurende 10 min bij kamertemperatuur onder zacht roeren. </li><li> Na 10 min incubatie, zuivert het product middels tegenfase-C18-HPLC chromatografie. De retentietijden zijn uiteraard sterk afhankelijk van de HPLC-uitrusting opstart van elk laboratorium (pompen, kolommen, buizen, enz.). Echter, om een voorbeeld te presenteren, als een gradiënt van 5:95 MeCN / H2O (beide met 0,1% TFA) tot 95: 5 MeCN / H2O gedurende 15 min wordt gebruikt, de retentietijd van 64 Cu-Tz- Bn-NOTA moet ongeveer 9,8 min, terwijl vrij, ongecomplexeerde 64 Cu elueren met het oplosmiddel voorzijde rond 2-4 min. </li><li> Met een roterende verdamper, verwijder de HPLC eluent. </li><li> Los het 64 Cu-Tz-Bn-NOTA product in 0,9% steriele zoutoplossing. OPMERKING: Aangezien 12.7 hr fysische halveringstijd van 64 Cu, is dit niet aanvaardbaar stopplaats in de procedure. Voer de synthese van 64 Cu-Tz-Bn-NOTEen onmiddellijk voorafgaand aan de injectie van de radioactieve, en volg stap 3.7 onmiddellijk voor stap 4.5. </li></ol> 4. In Vivo Pretargeted PET Imaging OPMERKING: Net als in Protocol afdeling 3, deze stap van het protocol heeft betrekking op de behandeling en manipulatie van radioactiviteit. Voordat u deze stappen onderzoekers moeten overleggen met Radiation Safety Department hun eigen instelling. Neem alle mogelijke stappen om de blootstelling aan ioniserende straling te minimaliseren. <ol><li> In een vrouwelijke athymische naakt muis, subcutaan implantaat 1 x 10 6 SW1222 colorectale kanker cellen en laat deze uit te groeien tot een 100-150 mm 3 xenogreffe (9-12 dagen na inenting). 11 </li><li> Verdun een aliquot van de huA33 TCO-oplossing van protocol van 2 tot een concentratie van 0,5 mg / ml in 0,9% steriele zoutoplossing. </li><li> Injecteer 200 ui van het huA33-TCO (100 ug) in de staartader van de xenograft-dragende muis. </li><li> Wacht 24 uur voor de accumulatie van de huA33-TCO in de tumor van de muis. </li><li> Verdun de 64 Cu-Tz-Bn-NOTA radioligand tot een concentratie van 1,5 mCi / ml in 0,9% steriele zoutoplossing. </li><li> Injecteer 200 ui van de 64 Cu-Tz-Bn-NOTA radioligand oplossing (300 uCi, 11,1 MBq 1,6 nmol 64 Cu-Tz-Bn-NOTA, uitgaande van een specifieke activiteit van 6,7 MBq / nmol) in de staartader van de xenograft-dragende muizen. </li><li> Op het gewenste beeldvormende tijdstip (bijvoorbeeld 2, 6, 12 of 24 uur na injectie), verdoven de muis met een 2% isofluraan: zuurstof gasmengsel. </li><li> Plaats de muis op het bed van de kleine dieren PET-scanner. Handhaaf anesthesie tijdens de scan met behulp van een 1% isofluraan: zuurstof gasmengsel. Voorafgaand aan het plaatsen van het dier op de scanner bed, controleren verdoving met behulp van de teen-snuifje methode en veterinaire zalf voor de ogen van de muis om te drogen tijdens anesthesie te voorkomen. </li><li> Verwerven van de PET-gegevens voor de muis via een statischescannen met een minimum van 20 miljoen samenvallende gebeurtenissen met behulp van een energie raam van 350-700 keV en een toeval timing raam van 6 nanoseconden. Na het voltooien van de overname van het beeld, hoeft de muis niet onbeheerd achter en plaats het niet in een kooi met andere muizen tot hij weer bij bewustzijn is. </li></ol>

<ol><li>Wu, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+and+antimatter%3A+The+resurgence+of+immuno-PET%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">Antibodies and antimatter: The resurgence of immuno-PET.</a> Journal of Nuclear Medicine. 50, 2-5 (2009).</li>
<li>Zeglis, B. M., Lewis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+the+construction+of+radiometallated+bioconjugates+for+positron+emission+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Dalton+Transactions%22%5BJournal%5D)">A practical guide to the construction of radiometallated bioconjugates for positron emission tomography.</a> Dalton Transactions. 40, 6168-6195 (2011).</li>
<li>Hollander, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bispecific+antibodies+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Bispecific antibodies for cancer therapy.</a> Immunotherapy. 1, 211-222 (2009).</li>
<li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+pretargeting+in+mice+using+99mTc-labeled+morpholino%2C+a+DNA+analog%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tumor pretargeting in mice using 99mTc-labeled morpholino, a DNA analog.</a> Journal of Nuclear Medicine. 43, 384-391 (2002).</li>
<li>Boerman, O. C., van Schaijk, F. G., Oyen, W. J. G., Corstens, F. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretargeted+radioimmunotherapy+of+cancer%3A+Progress+step+by+step%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pretargeted radioimmunotherapy of cancer: Progress step by step.</a> Journal of Nuclear Medicine. 44, 400-411 (2003).</li>
<li>Goldenberg, D. M., Sharkey, R. M., Paganelli, G., Barbet, J., Chatal, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+pretargeting+advances+cancer+radioimmunodetection+and+radioimmunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Antibody pretargeting advances cancer radioimmunodetection and radioimmunotherapy.</a> Journal of Clinical Oncology. 24, 823-834 (2006).</li>
<li>Sharkey, R. M., Chang, C. H., Rossi, E. A., McBride, W. J., Goldenberg, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretargeting%3A+taking+an+alternate+route+for+localizing+radionuclides%5BTitle%5D)+AND+%22Tumor+Biology%22%5BJournal%5D)">Pretargeting: taking an alternate route for localizing radionuclides.</a> Tumor Biology. 33, 591-600 (2012).</li>
<li>Sharkey, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+delivery+of+radionuclides+for+imaging+and+therapy+of+cancer+using+pretargeting+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Improving the delivery of radionuclides for imaging and therapy of cancer using pretargeting methods.</a> Clinical Cancer Research. 11, 7109-7121 (2005).</li>
<li>Schultz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tetravalent+single-chain+antibody-streptavidin+fusion+protein+for+pretargeted+lymphoma+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A tetravalent single-chain antibody-streptavidin fusion protein for pretargeted lymphoma therapy.</a> Cancer Research. 60, 6663-6669 (2000).</li>
<li>Lewis, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+evaluation+of+pretargeted+64Cu+for+tumor+imaging+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo evaluation of pretargeted 64Cu for tumor imaging and therapy.</a> Journal of Nuclear Medicine. 44, 1284-1292 (2003).</li>
<li>Zeglis, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pretargeted+PET+imaging+strategy+based+on+bioorthgonal+Diels-Alder+click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">A pretargeted PET imaging strategy based on bioorthgonal Diels-Alder click chemistry.</a> Journal of Nuclear Medicine. 54, 1389-1396 (2013).</li>
<li>Blackman, M. L., Royzen, M., Fox, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrazine+ligation%3A+fast+bioconjugation+based+on+inverse+electron+demand+Diels-Alder+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Tetrazine ligation: fast bioconjugation based on inverse electron demand Diels-Alder reactivity.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 13518-13519 (2008).</li>
<li>Devaraj, N. K., Upadhyay, R., Hatin, J. B., Hilderbrand, S. A., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+sensitive+pretargeted+labeling+of+cancer+cells+through+a+tetrazine%2Ftrans-cyclooctene+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie-International+Edition%22%5BJournal%5D)">Fast and sensitive pretargeted labeling of cancer cells through a tetrazine/trans-cyclooctene cycloaddition.</a> Angewandte Chemie-International Edition. 48, 7013-7016 (2009).</li>
<li>Devaraj, N. K., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomedical+applications+of+tetrazine+cycloadditions%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Biomedical applications of tetrazine cycloadditions.</a> Accounts of Chemical Research. 44, 816-827 (2011).</li>
<li>Devaraj, N. K., Weissleder, R., Hilderbrand, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrazine-based+cycloadditions%3A+application+to+pretargeted+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tetrazine-based cycloadditions: application to pretargeted live cell imaging.</a> Bioconjugate Chemistry. 19, 2297-2299 (2008).</li>
<li>Keliher, E. J., Reiner, T., Turetsky, A., Hilderbrand, S., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yielding%2C+two-step+18F+labeling+strategy+for+18F-PARP1+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22ChemMedChem%22%5BJournal%5D)">High-yielding, two-step 18F labeling strategy for 18F-PARP1 inhibitors.</a> ChemMedChem. 6, 424-427 (2011).</li>
<li>Reiner, T., Earley, S., Turetsky, A., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioorthogonal+small-molecule+ligands+for+PARP1+imaging+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Bioorthogonal small-molecule ligands for PARP1 imaging in living cells.</a> ChemBioChem. 11, 2375-2377 (2010).</li>
<li>Reiner, T., Keliher, E. J., Earley, S., Marinelli, B., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+in+vivo+imaging+of+a+18F-labeled+PARP1+inhibitor+using+a+chemically+orthogonal+scavenger-assisted+high-performance+method%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Synthesis and in vivo imaging of a 18F-labeled PARP1 inhibitor using a chemically orthogonal scavenger-assisted high-performance method.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50, 1922-1925 (2011).</li>
<li>Taylor, M. T., Blackman, M., Dmitrenko, O., Fox, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+synthesis+of+highly+reactive+dienophiles+for+the+tetrazine-trans-cyclooctene+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Design and synthesis of highly reactive dienophiles for the tetrazine-trans-cyclooctene ligation.</a> Journal of the American Chemical Society. 133, 9646-9649 (2011).</li>
<li>Selvaraj, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrazine-trans-cyclooctene+ligation+for+the+rapid+construction+of+integrin+alpha%28v%29beta%283%29+targeted+PET+tracer+based+on+a+cyclic+RGD+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+and+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Tetrazine-trans-cyclooctene ligation for the rapid construction of integrin alpha(v)beta(3) targeted PET tracer based on a cyclic RGD peptide.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 21 (3), 5011-5014 (2011).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+18F+labeling+of+cysteine-containing+peptides+and+proteins+using+tetrazine-trans-cyclooctene+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">Efficient 18F labeling of cysteine-containing peptides and proteins using tetrazine-trans-cyclooctene ligation.</a> Molecular Imaging. 12, 121-128 (2013).</li>
<li>Han, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+bioorthogonal+and+highly+efficient+conjugation+method+for+quantum+dots+using+tetrazine-norbornene+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Development of a bioorthogonal and highly efficient conjugation method for quantum dots using tetrazine-norbornene cycloaddition.</a> Journal of the American Chemical Society. 132, 7838-7839 (2010).</li>
<li>Zeglis, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+strategy+for+the+construction+of+radiometalated+antibodies+for+positron+emission+tomography+based+on+inverse+electron+demand+Diels-Alder+click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Modular strategy for the construction of radiometalated antibodies for positron emission tomography based on inverse electron demand Diels-Alder click chemistry.</a> Bioconjugate Chemistry. 22, 2048-2059 (2011).</li>
<li>Zeng, D., Zeglis, B. M., Lewis, J. S., Anderson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growing+impact+of+bioorthogonal+click+chemistry+on+the+development+of+radiopharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">The growing impact of bioorthogonal click chemistry on the development of radiopharmaceuticals.</a> Journal of Nuclear Medicine. 54, 829-832 (2013).</li>
<li>Reiner, T., Zeglis, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inverse+electron+demand+Diels-Alder+reaction+in+radiochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Labeled+Compounds+and+Radiopharmaceuticals%22%5BJournal%5D)">The inverse electron demand Diels-Alder reaction in radiochemistry.</a> Journal of Labeled Compounds and Radiopharmaceuticals. 57, 285-290 (2014).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrazine-trans-cyclooctene+ligation+for+the+rapid+construction+of+18-F+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Tetrazine-trans-cyclooctene ligation for the rapid construction of 18-F labeled probes.</a> Chemical Communications. 46, 8043-8045 (2010).</li>
<li>Karver, M. R., Weissleder, R., Hilderbrand, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+evaluation+of+a+series+of+1%2C2%2C4%2C5-tetrazines+for+bioorthogonal+conjugation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Synthesis and evaluation of a series of 1,2,4,5-tetrazines for bioorthogonal conjugation.</a> Bioconjugate Chemistry. 22, 2263-2270 (2011).</li>
<li>Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioorthogonal+chemistry%3A+fishing+for+selectivity+in+a+sea+of+functionality%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Bioorthogonal chemistry: fishing for selectivity in a sea of functionality.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48, 6973-6998 (2009).</li>
<li>Bosch, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+strained+alkynes+for+Cu-free+click+reaction+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nuclear+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of strained alkynes for Cu-free click reaction in live mice.</a> Nuclear Medicine and Biology. 40, 415-423 (2013).</li>
<li>Rossin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+chemisry+for+pretargeted+tumor+imaging+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">In vivo chemisry for pretargeted tumor imaging in live mice.</a> Angewandte Chemie International Edition. 49, 3375-3378 (2010).</li>
<li>Ackerman, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A33+antigen+displays+persistent+surface+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+and+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">A33 antigen displays persistent surface expression.</a> Cancer Immunology and Immunotherapy. 57, 1017-1027 (2008).</li>
<li>Carrasquillo, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((124I-huA33+antibody+PET+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">124I-huA33 antibody PET of colorectal cancer.</a> Journal of Nuclear Medicine. 52, 1173-1180 (2011).</li>
<li>Sakamoto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+I+radioimmunolocalization+trial+of+humanized+monoclonal+antibody+huA33+in+patients+with+gastric+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">A phase I radioimmunolocalization trial of humanized monoclonal antibody huA33 in patients with gastric carcinoma.</a> Cancer Science. 97, 1248-1254 (2006).</li>
<li>Rossin, R., Lappchen, R., vanden Bosch, S. M., LaForest, R., Robillard, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diels-Alder+reaction+for+tumor+pretargeting%3A+In+vivo+chemistry+can+boost+tumor+radiation+dose+compared+with+directly+labeled+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">Diels-Alder reaction for tumor pretargeting: In vivo chemistry can boost tumor radiation dose compared with directly labeled antibody.</a> Journal of Nuclear Medicine. 54, 1989-1995 (2013).</li>
<li>Rossin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+reactive+trans-cyclooctene+tags+with+improved+stability+for+Diels-Alder+chemistry+in+living+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Highly reactive trans-cyclooctene tags with improved stability for Diels-Alder chemistry in living systems.</a> Bioconjugate Chemistry. 34, 1210-1217 (2014).</li>
<li>Emmetiere, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((18F-labeled-bioorthogonal+liposomes+for+in+vivo+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">18F-labeled-bioorthogonal liposomes for in vivo targeting.</a> Bioconjugate Chemistry. 24, 1784-1789 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het belangrijkste voordeel van deze pretargeted PET strategie is dat het in staat is afbakenen tumoren met target-to-background beeldcontrast slechts een fractie van de achtergrondstraling dosis geproduceerd door direct gemerkte antilichamen. Bijvoorbeeld, in de colorectale kanker beeldvormingssysteem beschreven, gegevens van acute experimenten van biologische verdeling werden toegepast voor dosimetrische berekeningen voor de 64 Cu gebaseerde pretargeting strategie voeren met direct gelabelde 64 Cu...

In de afgelopen dertig jaar heeft positron emissie tomografie (PET) uitgegroeid tot een onmisbaar instrument in de klinische diagnostiek en behandeling van kanker. Antilichamen zijn lang beschouwd als veelbelovend vectoren voor het afgeven van positron emitterende radio-isotopen tumoren vanwege hun uitstekende affiniteit en specificiteit voor kanker biomarkers. 1,2 De relatief langzame in vivo farmacokinetiek van antilichamen draagt ​​het gebruik van radio-isotopen met meerdaagse de fysische halfwaardetijd. Deze combinatie kan een hoge stralingsdoses geven de niet-doelorganen patiënten, een belangrijke complicatie die van bijzonder klinisch belang omdat radioimmunoconjugaten intraveneus en daarom geïnjecteerd - in tegenstelling gedeeltelijke body CT scans - leiden tot geabsorbeerde doses in elk deel van het lichaam, ongeacht de ondervraagde weefsels. Om dit probleem te omzeilen, heeft aanzienlijke inspanningen werden gewijd aan de ontwikpment van PET-imaging strategieën die de radio-isotoop en het richtende deel los te koppelen, waardoor gebruik te maken van de gunstige eigenschappen van antilichamen en tegelijkertijd plinten hun intrinsieke farmacokinetische beperkingen. Deze strategieën - het vaakst genoemd pretargeting of multistep targeting - typisch dienst vier stappen: (1) de toediening van een antilichaam kan binden zowel een antigeen en een radioligand; (2) de accumulatie van het antilichaam in het doelweefsel en de klaring uit het bloed; (3) de administratie van een klein molecuul radioligand; en (4) het in vivo ligatie van de radioligand aan het antilichaam, gevolgd door de snelle klaring van overmaat radioligand. 3-8 In sommige gevallen een extra klaringsmiddel wordt geïnjecteerd tussen stap 2 en 3 om de uitscheiding van antilichaam versnellen die straks de tumor binden en blijft in het bloed. 5 In grote lijnen, two soorten pretargeting strategieën meest voor in de literatuur. Hoewel beide succesvol zijn gebleken in preklinische modellen, ze bezitten ook belangrijke beperkingen die hun klinische toepasbaarheid hebben belemmerd. De eerste strategie is gebaseerd op de hoge affiniteit tussen streptavidine-geconjugeerde antilichamen en biotine gemodificeerde radiolabels; De immunogeniciteit van de met streptavidine gemodificeerde antilichamen heeft bewezen een zorgwekkende problemen betreffende de vertaling,. 5,6,9,10 De tweede strategie daarentegen stelt bispecifieke antilichamen die zijn genetisch gemanipuleerde zowel kanker binden biomarker antigeen en een klein molecuul radioactief hapteen. 3,11-14 Hoewel dit laatste route zeker creatief is de brede toepasbaarheid beperkt door de complexiteit, kosten en gebrek aan modulariteit van het systeem. Onlangs hebben we ontwikkeld en publiceerde een pretargeted PET imaging methode op basis van de inverse elektron vraag Diels-Alder (IEDDA) cycloadditiereactie tussen trans -cyclooctene (TCO) en tetrazine (Tz;. Figuur 1) 11 Terwijl de reactie zelf is al decennia bekend, heeft IEDDA chemie een renaissance van de afgelopen jaren als een klik chemie bioconjugatie techniek, zoals geïllustreerd door het fascinerende werk van de groepen van Ralph Weissleder, Joseph Vos en Peter Conti onder anderen. 12-15 De IEDDA cycloadditiereactie heeft in een breed scala van instellingen werden toegepast, met inbegrip van fluorescentie beeldvorming met peptiden, antilichamen, en nanodeeltjes evenals nucleaire beeldvorming . met zowel radiohalogens en radiometals 16-26 De ligatie is een hoge opbrengst, schoon, snel (k 1&gt; 30.000 M -1 sec -1), selectief, en - kritisch -. bioorthogonal 27 En terwijl een aantal soorten van click chemie - waaronder Cu gekatalyseerde azide-alkyn cycloaddities, stam bevorderde azide-alkyn cycloaddities en Staudinger ligaties -. zijn bioorthogonal als goed, het is de unieke combinatie van snelle reactie kinetiek en bioorthogonality dat maakt IEDDA chemie zo goed geschikt voor pretargeting toepassingen in hele organismen 28,29 Langs deze lijnen, is het belangrijk op te merken dat het recente rapport van onze laboratoria was niet de eerste die IEDDA chemie toepassing op pretargeting: het eerste verslag van pretargeted beeldvorming met IEDDA is ontstaan ​​uit het werk van Rossin, et al en werd gekenmerkt door een SPECT methode gebruik van een 111-gelabeld tetrazine 30.. Zoals hierboven besproken, de pretargeting methode vier relatief eenvoudige stappen (figuur 2). In het protocol bij de hand, een pretargeted strategie voor PET beeldvorming van colorectale kanker die een 64 Cu-NOTA gelabelde tetrazine radioligand en een TCO-gemodificeerde conjugaat van antilichaam huA33 werken worden beschreven. Echter, uiteindelijk de modulariteit van deze methode is een van de grdaarvan eet activa, trans -cyclooctene groep kan worden toegevoegd aan een niet-internaliserende antilichamen en de tetrazine kan worden aan diverse radioactieve reporters.

<table><tbody><tr><td>Tetrazine NHS Ester</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>764701</td><td>Bewaar bij -80 &deg;C</td></tr><tr><td>Trans-cyclooctene NHS Ester</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>764523</td><td>Bewaar bij -80 &deg;C</td></tr><tr><td>p-NH2-Bn-NOTA</td><td>Macrocyclics</td><td>B-601</td><td>Bewaar bij -80 &deg;C</td></tr></tbody></table>

het benutten van de bioorthogonal inverse electron demand diels-alder cycloadditiereacties voor pretargeted pet imaging

Harnessing the Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition for Pretargeted PET Imaging

Vanwege hun exquise affiniteit en specificiteit zijn antilichamen uiterst veelbelovende vectoren geworden voor de toediening van radio-isotopen aan kankercellen voor PET-beeldvorming. De noodzaak om antilichamen te labelen met radionucliden met lange fysische halfwaardetijden leidt echter vaak tot hoge achtergrondstralingdosissen voor niet-doelweefsels. Om dit probleem te omzeilen, hebben we een pretargeted PET-beeldvormingsstrategie gebruikt die is gebaseerd op de inverse elektronenvraag Diels-Alder cycloadditiereactie. De methodologie koppelt het antilichaam los van de radioactiviteit en benut zo de positieve kenmerken van antilichamen, terwijl het de farmacokinetische nadelen vermijdt. Het systeem bestaat uit vier stappen: (1) de injectie van een mAb-trans-cycloocteenkoppelstof (TCO); (2) een lokalisatieperiode waarin het antilichaam zich accumuleert in de tumor en uit het bloed verdwijnt; (3) de injectie van het radioactief gelabelde tetrazine; en (4) de in vivo klikligatie van de componenten, gevolgd door de klaring van overtollig radioligand. In het voorbeeld dat in het werk wordt gepresenteerd, werd met succes een 64Cu-NOTA-gelabelde tetrazine radioligand en een trans-cycloocteengeconjugeerd gehumaniseerd antilichaam (huA33) gebruikt om SW1222 colorectale kankertumoren af te bakenen met een hoge tumor-tot-achtergrond contrast. Verder produceert de pretargeting-methodologie hoge kwaliteit beelden met slechts een fractie van de stralingsdosis voor niet-doelweefsel die wordt gecreëerd door radio-immunoconjugaten die direct zijn gelabeld met 64Cu of 89Zr. Uiteindelijk is de modulariteit van dit protocol een van zijn grootste troeven, aangezien de trans-cycloocteengroepering kan worden toegevoegd aan elk niet-internaliserend antilichaam, en het tetrazine kan worden gekoppeld aan een breed scala van radio-isotopen.

De eerste drie stappen van het experiment - de synthese van Tz-Bn-NOTA, de conjugatie van TCO huA33 en de radiolabeling van het Tz-Bn-NOTA construct (figuren 3 en 4) - zeer betrouwbaar. Bij de bovenstaande procedure werd Tz-Bn-NOTA construct gesynthetiseerd in hoge opbrengst en zuiverheid. De huA33 antilichaam werd gemodificeerd met 4,2 ± 0,6 TCO / mAb en Tz-Bn-NOTA werd radioactief gemerkt met 64 Cu tot het gezuiverde radioligand op in&gt; 99% radiochemische zuiverheid&gt; 8...

De bioorthogonale inverse elektrone-vraag Diels-Alder cycloadditie is gebruikt om een effectieve en modulaire pretargeted PET-beeldvormingsstrategie voor kanker te creëren. In dit protocol worden de stappen van deze methodologie beschreven in de context van een modelsysteem dat gebruikmaakt van het op colorectale kanker gerichte antilichaam huA33 en een 64Cu-gelabelde radioligand.

Het benutten van de Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloadditiereacties voor Pretargeted PET Imaging

Due to their exquisite affinity and specificity, antibodies have become extremely promising vectors for the delivery of radioisotopes to cancer cells for ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om kankerweefsel vooraf te targeten met behulp van een bio-orthogonale reactie tussen TetINE en trans-cyclooctine voor PET-beeldvorming. Dit wordt bereikt door een tumor-dragende muis te injecteren met een trans-cycloctine-gelabeld antilichaam, gevolgd door een intervalperiode waarin het antilichaam langzaam accumuleert bij de tumor en uit het bloed wordt geklaard. Vervolgens wordt een tetrazine-radioligand in hetzelfde dier geïnjecteerd.Het radioligand koppelt via een click-reactie met een TCO-gelabeld antilichaam bij de tumor, en omdat het een klein molecuul is, wordt het snel uit het bloed geklaard. De resulterende PET-beeldvorming bij kleine dieren laat een duidelijke afbakening van de tumor zien met een hoog contrast en hoge tumor-achtergrondactiviteitsratio's. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals PET-beeldvorming met direct gelabelde antilichamen, is dat het contrastrijke beelden oplevert met slechts een fractie van de stralingsdosis voor de patiënt.De implicaties van deze techniek reiken tot in de therapie, aangezien pre-targetingtechnieken zeer hoge hoeveelheden straling naar tumoren kunnen sturen, terwijl de doses die aan gezonde organen en gezond weefsel worden toegediend zeer laag zullen zijn. Ik zal deze techniek demonstreren samen met Catherine Kaza, een technicus in ons laboratorium. De synthesereactie begint met het oplossen van zeven milligram NH₂-BN Notta in 600 µL 0,1 M natriumbicarbonaat bij pH 8,1.Controleer de pH en gebruik indien nodig kleine aliquots van 0,1 molair natriumcarbonaat om de pH bij te stellen naar 8,1. Voeg deze oplossing vervolgens toe aan 0,5 milligram TZ NHS in een microcentrifugebuisje. Laat deze reactie een half uur incuberen bij kamertemperatuur onder zachte agitatie.De TZ NHS-voorraad kan na een half uur worden opgelost in DMF of DMSO. Zuiver het product via reverse-phase C 18 HPLC omHet niet-reactieve NH₂ BN Notta te verwijderen, dat detecteerbaar is bij 254 nanometer. De TZ NHS en TZ BN Notta kunnen het beste worden gemonitord bij 525 nanometer.De retentietijd van het monster zal variëren afhankelijk van de apparatuur, maar bij gebruik van een gradiënt van acetonnitril naar water van 0 naar 100 naar 100 naar 0 over 25 minuten, en een analytische C 18-kolom van 4,6 bij 250 millimeter, zullen de retentietijden respectievelijk 16,5, 15 en 10 minuten zijn voor de drie verbindingen. Vries de verzamelde HPLC-elutie in vloeibare stikstof en wikkel de buis vervolgens in ondoorzichtige folie. Plaats de bevroren buis nu in een lyofilisatievat en zet dit gedurende de nacht in een lyofilisator.Om de HPLC-mobiele fase te verwijderen ter verificatie van de zuiverheid van de voltooide TZ bn no top precursor, dient u protonen-NMR, analytische HPLC en/of ESI-massaspectrometrie te gebruiken. Begin deze reactie door in een microcentrifugebuis een 2,7 millimolaire oplossing van T-C-O-N-H-S in DMF te bereiden in een tweede microcentrifugebuis. Bereid een oplossing van HUA 33 met een concentratie van twee milligram per milliliter in één milliliter PBS pH 7,4.Stel vervolgens de pH van de oplossing in op een waarde tussen 8,8 en 9,0, maar niet hoger, door kleine hoeveelheden 0,1 molair natriumcarbonaat toe te voegen. Voeg daarna een volume T-C-O-N-H-S toe dat overeenkomt met acht molaire equivalenten van de geactiveerde ester. Meng de oplossing voorzichtig door een paar keer te keren en wikkel deze in aluminiumfolie.Zet de buis vervolgens ongeveer een uur bij kamertemperatuur te incuberen onder milde agitatie. Gebruik na een uur een kant-en-klare wegwerpfraktioneringskolom voor grootte-uitsluiting om het immunoconjugaat uit de reactie te zuiveren. Voeg één milliliter van het reactiemengsel toe aan de kolom en voeg vervolgens 1,5 milliliter 0,9% steriele zoutoplossing toe.Elueer vervolgens het gehumaniseerde HUA 33 TCO-product met twee milliliter 0,9% zoutoplossing. Meet de concentratie van het product met een UV-vis spectrometer. Indien de concentratie lager is dan gewenst, concentreer het product dan met een centrifugale filter met een molecuulgewichtafsnijding van 50.000.Begin met het bereiden van een oplossing van TZ BN notta met een concentratie van 0,5 mg/mL in een microcentrifugebuisje. Voeg in een tweede microcentrifugebuisje 10 µL van de bereide TZ BN Notta-oplossing toe aan 400 µL ammoniumacetaatbuffer 0,2 M bij pH 5,5. Zorg ervoor dat u de hoeveelheid radioactiviteit van uw monster meet en noteert vóór en na elke volgende stap.Dit is essentieel voor een nauwkeurige berekening van de radiochemische opbrengsten en voor de verslaglegging. Voeg nu 2000 micro curies koper 64 toe aan de TZ BN Notta-oplossing. Incubeer dit mengsel gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur onder lichte agitatie.Om het product te zuiveren, wordt reverse-phase C18 HPLC gebruikt; verdun de producten met een gradiënt van acetonitril naar water van 5 naar 95 en weer terug naar 5 over 15 minuten met 0,1% TFA. Het radiogestempelde tz, BN nota zal elueren bij 9,8 minuten, terwijl het vrije koper 64 zal elueren met het oplosmiddelfront na twee tot vier minuten. Gebruik een rotatieverdamper om het HPLC-eluaat te verwijderen, loss het radiogestempelde product op in 0,9% steriele zoutoplossing en gebruik het product vervolgens zo snel mogelijk. Deze procedure begint met het verdunnen van een aliquot van de bereide HEA 33 TCO-oplossing tot een concentratie van 0,5 mg/mL in 0,9% steriele zoutoplossing.Injecteer vervolgens 200 µL van de oplossing in de staartvene van de muis met het xenograft. Laat het gehumaniseerde a 33 TCO 24 uur lang circuleren en zich ophopen in de tumor. Bereid na 24 uur de met koper 64 gelabelde TZ BN Notta voor in een concentratie van 1,5 mCi per milliliter in 0,9% steriele zoutoplossing.Dien vervolgens 200 µL van de bereide radioligandoplossing toe aan de muis via een staartvene-injectie op het gewenste tijdstip. Anestheseer de muis en plaats deze op het bed van een kleine-dieren-PET-scanner. De anesthesie dient te worden gehandhaafd via toediening met een neusconus, en de staat van anesthesie dient te worden bevestigd met een knijptest in de teen.Breng daarnaast een dunne laag oogzalf aan om uitdroging te voorkomen. Verzamel nu de PET-gegevens met een statische scan van 60 miljoen coincidence events bij 350 tot 700 kilo elektronvolt, met een coincidence-timing van zes nanoseconden; wacht na de beeldvorming tot de muis weer bij bewustzijn is voordat deze wordt teruggeplaatst in de kooi, eventueel samen met andere muizen. Een thymushuidloze muis met een 33-antigeen-exprimerende SW 1222 colorectale kanker.Xenografts werden onderzocht met behulp van het beschreven protocol. Zowel de acute biodistributie- als de PET-beeldexperimenten tonen aan dat de pre-targetingstrategie in staat is om de colorectale kankerxenograft af te grenzen met een uitstekend beeldcontrast en hoge tumor-achtergrondactiviteitsverhoudingen. Gedurende enkele uren wordt het radioligand via de feces geklaard en worden de tumor-achtergrondactiviteitsverhoudingen zeer hoog.Sommige variabelen in deze pre-targetingaanpak vereisten optimalisatie, zoals gebruikelijk is bij elke imagingstrategie. De toediening van 300 microgram antilichaam-TCO-conjugaat in plaats van 100 microgram leidde tot een toename van de zichtbare radioactiviteit in het hart van de muis, evenals het verkorten van het interval van 24 naar 12 uur. In beide gevallen vond de clickreactie nog steeds plaats bij de tumor, wat duidelijk wordt geïllustreerd door de tumorale opname op vroege tijdstippen.De clickreactie vindt echter duidelijk ook in het bloed plaats, wat ongewenst is. Bij het uitvoeren van deze procedure moet een nauwkeurig evenwicht tussen alle pre-targetingvariabelen worden bereikt. Het is zeer belangrijk dat zowel de massa van het TCO-immunoconjugaat als het tijdsinterval tussen de injecties zijn geoptimaliseerd.Vergeet niet dat werken met radioactiviteit extreem gevaarlijk kan zijn en dat er tijdens het experiment voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het dragen van geschikte PBM en het waarborgen dat de straling te allen tijde is afgeschermd.

harnessing-bioorthogonal-inverse-electron-demand-diels-alder

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

This video describes the technique of pretargeted radioimmunotherapy or PRIT, in which immunoconjugates followed by radioligands are administered for treating tumors. This radioimmunotherapy reduces radiation doses to healthy tissues and utilizes radionuclides with very low half-lives incompatible with antibody-based vectors.

Pretargeted Radioimmunotherapy: A Method for Targeted Delivery of Therapeutic Radionuclides to Tumors

We presenteren een methode voor een snelle, omkeerbare immobilisatie van kleine moleculen en gefunctionaliseerde nanodeeltjes assemblages voor Surface Plasmon Resonance (SPR) studies, met behulp van sequentiële on-chip bioorthogonal cycloadditiereactie chemie en antilichaam-antigen capture.

Microfluïdische On-chip Capture-cycloadditiereactie omkeerbaar Immobiliseer Small Molecules of Multi-component Structuren voor biosensortoepassingen

Vanwege zijn meerdaagse radioactieve halfwaardetijd en gunstige vervaleigenschappen, is het positron-emitterende radiometaal 89Zr uitermate geschikt voor gebruik in antilichaamgebaseerde radiofarmaca voor PET-beeldvorming. In dit protocol worden de bioconjugatie, radiosynthese en preklinische toepassing van 89Zr-gelabelde antilichamen beschreven.

De bioconjugatie en radiosynthese van<sup&gt; 89</sup&gt; Zr-DFO-gemerkte antilichamen

Een gedetailleerde procedure voor de synthese van een 125 I-gemerkt azide en het radioactief merken van dibenzocyclooctyne (DBCO) -groep geconjugeerd, 13-nm-sized goud nanodeeltjes met behulp kopervrij click reactie wordt beschreven.

Een geoptimaliseerde protocol voor de efficiënte Radioactief merken van Gold Nanodeeltjes met behulp van een<sup&gt; 125</sup&gt;-Gemerkte azide prosthetische groep

Hier beschrijven we een protocol voor het radiolabelen en in vivo testen van tridentaat 99mTc(I) chelaat-tetrazine afgeleiden voor pre-targeting en bioorthogonale chemie.

Voorbereiding en evaluatie van<sup&gt; 99m</sup&gt; Tc-gelabelde tridentaat Chelates voor Pre-targeting Met behulp Bioorthogonal Chemistry

We demonstreren de semi-geautomatiseerde radiochemische synthese van [ 18 F] 3F4AP en kwaliteitscontroles.

Geautomatiseerde Radiochemische Synthese van [<sup&gt; 18</sup&gt; F] 3F4AP: Een nieuwe PET Tracer voor het imiteren van demyeliniserende ziekten

Een facile fluorescentie-bepaling is bedoeld om te evalueren van de doeltreffendheid van amino-acyl-tRNA-synthetase/tRNA paren integratie van niet-canonieke aminozuren (ncAAs) in eiwitten uitgedrukt in zoogdiercellen. De toepassing van ncAAs op het bestuderen van de G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCRs) wordt beschreven, met inbegrip van foto-crosslinking toewijzing van bindende sites en bioorthogonal GPCR etiketten op levende cellen.

Optimaliseren van de genetische opneming van chemische sondes in GPCRs voor foto-crosslinking kartering en Bioorthogonal scheikunde in levende cellen van zoogdieren

Positron-emissie tomografie (PET) imaging sites die bij meerdere vroege proeven van het klinisch onderzoek betrokken zijn moet robuust en veelzijdig radiotracer productie mogelijkheden. Met behulp van de radiotracer [18F] Clofarabine als voorbeeld illustreren we hoe te automatiseren de synthese van een radiotracer met behulp van een flexibele, cassette gebaseerde radiosynthesizer en valideren van de synthese voor klinisch gebruik.

Automatisering van een Positron-emissie tomografie (PET) Radiotracer synthese Protocol voor klinische productie

Dit protocol beschrijft de synthese en de karakterisering van een trans- Cycloocteen (TCO)-gemodificeerde antilichaam en een 177Lu-geëtiketteerden tetrazine (Tz) radioligand voor pretargeted radioimmunotherapy (PRIT). Daarnaast geeft het het gebruik van deze twee constructies voor in vivo ook en longitudinale therapie studies in een lymfkliertest model van colorectal kanker.

Pretargeted Radioimmunotherapy op basis van de Inverse Electron vraag Diels-Alder reactie

We presenteren een protocol om metabole activiteiten in cellen gereguleerd door aminozuren direct te visualiseren met behulp van deuteriumoxide (zwaar water D2O) gesondeerde gestimuleerde Raman-verstrooiing (DO-SRS) microscopie, die is geïntegreerd met twee-foton excitatie fluorescentiemicroscopie (2PEF).

Bioorthogonale chemische beeldvorming van celmetabolisme gereguleerd door aromatische aminozuren

Dit protocol bevat een gedetailleerde procedure voor de bereiding van vier koolstof-11 radiotracers door middel van de "lusmethode" [11C] methylering. We beschrijven de procedure om [11C]ER-176 te synthetiseren, met gegevens voor drie extra radiotracers: [11C]MRB, [11C]m HED en [11C]PiB. De lusmethode zorgt voor een efficiënte synthese met verhoogde radiochemische opbrengsten tegen traditionele methylering van reactievaten [11C].

Verbetering van de efficiëntie en radiolabelingopbrengsten van koolstof-11 radioliganden voor klinisch onderzoek met behulp van de lusmethode

Leer een bioorthogonale inverse-electron-demand Diels-Alder cycloadditiereactie voor pretargeted PET-beeldvorming bij colorectale kanker. Deze methode biedt hoge contrastbeelden met lagere stralingsdoses dan traditionele technieken.

Het benutten van de Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloadditiereacties voor Pretargeted PET Imaging

Meer video's verkennen