Zelf-assemblage van Complex Tweedimensionaal Vormen van enkelstrengs DNA Tiles

Het algemene doel van het volgende experiment is het vormen van complexe DNA-nanostructuren met enkelstrengse tegels. Dit wordt bereikt door zorgvuldig ontworpen synthetische DNA-strengen in de gewenste bufferoplossing te mengen om in een tweede stap de beoogde DNA-nanostructuur te vormen. Het monster wordt vervolgens verhit, waarna de zelfassemblage van de structuur plaatsvindt.

Vervolgens worden native agarose-gelelektroforese en beeldvorming met een atoomkrachtmicroscoop uitgevoerd om de succesvolle vorming van de nanostructuren te verifiëren. De resultaten tonen DNA-nanostructuren die zijn zelfgeassembleerd, gebaseerd op native agarose-gelelektroforese en beeldvorming met een atoomkrachtmicroscoop. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat de monstervoorbereiding van een dergelijke zelfassemblage ingewikkeld lijkt te zijn. Verkrijg vóór het starten van deze procedure DNA-componentstrengen van specifieke sequenties, opgelost in RNAse-vrij water van een oligonucleotidefabrikant in Vbo-platen met 96 wells; pipetteer 1 µL uit elk van de 362 wells voor de 24 helices bij 28 windingen.

Voeg 100 micromolar per streng toe aan een reageerbuis van twee milliliter. Voeg vervolgens 138 microliters gedestilleerd gedeïoniseerd water toe aan de reageerbuis om een voorraadoplossing te maken met een concentratie van 200 nanomolar per streng.

Voeg 50 µL van de 200 nM stockoplossing, 10 µL van 10 x annealingbuffer A en 40 µL gedestilleerd gedeïoniseerd water toe aan een 0,2 mL PCR-buis. Anneal het monster vervolgens gedurende 17 uur in een thermocycler, waarbij de temperatuur wordt afgekoeld van 90 naar 25 °C.

Nadat een native 2% agarosegel is voorbereid en vooraf is gekleurd met SYBR safe, wordt deze gedurende twee uur bij 100 volt gerund in een ijswaterbad. Maak na afloop een afbeelding van de gel met een gelscanner, gebruikmakend van een passend filter voor de SYBR safe-kleuring op een blauwe licht-transilluminator. Snijd de dominante band met een vergelijkbare mobiliteit als de band van 1.500 baseparen van de one Kilobase DNA-ladder uit met een scherp, schoon scheermesje. Plaats de gewenste gelstukjes in een spincolumn en verbrijzel de gel vervolgens tot fijne stukjes met een microtubepestel; centrifugeer daarna bij 438 G gedurende drie minuten bij vier graden Celsius.

Na centrifugatie wordt de DNA-concentratie gemeten met een ultraviolette spectrofotometer bij 260 nanometer. Pel op dit punt de MICA af van een metalen monsterdisc met behulp van plakband om een vlak oppervlak te verkrijgen en plaats de monsterdisc op de beeldtafel van de microscoop.

Voeg 40 µL van 1x knelling buffer A toe, gevolgd door 5 µL van het gezuiverde monster van de 24 HELOCs bij 28 turns rectangle, aan het vers gecleavde mica-oppervlak. Laat het mengsel ongeveer twee minuten bezinken. Plaats een AFM siliciumnitride cantilever-chip in een cantileverhouder en beeld het monster in de fluid tapping-modus af met een scanmaat van 2 µm en 1024 lijnen voor de resolutie.

En een scansnelheid van 0,5 tot 1 Hz voor interne labeling, bevestigd aan een 3'-segment van 17 nucleotiden aan acht interne tegels en zes begrenzingstegels van de rechthoek. Meng de 28 strengen met handles met de overige componentstrengen van de 24 HELOCs 28-turns rechthoek om een stockoplossing van 200 nM te maken voor begrenzingslabeling. Meng de 14 strengen met handles met de overige componentstrengen van de 24 HELOCs 28-turns rechthoek om een stockoplossing van 200 nM te verkrijgen voor interne labeling.

Voeg voor de markering van de begrenzing 50 µL van de 200 nM voorraadoplossing, 60 µL van de 100 µM biotine-gemodificeerde anti-handle-strengen, 10 µL van 10 x annealingsbuffer A en 34 µL gedestilleerd gedeïoniseerd water toe aan een PCR-reageerbuis.

Voeg voor interne labeling 50 µL van de 200 nM stockoplossing, 3 µL van de intern anti-handle biotine-gemodificeerde streng in een concentratie van 100 µM, 10 µL van 10 x annealingbuffer A en 37 µL gedestilleerd gedeïoniseerd water toe aan een PCR-reageerbuis.

Weeg vervolgens 0,06 gram urineformiaat af in drie milliliter gedestilleerd water. Om een 2% waterige urineformiaat-kleuringsoplossing te bereiden, wordt de kleuringsoplossing gefilterd met een 0,2 microliter filter dat aan de spuit is bevestigd. Voeg vijf microliter 5 N natriumhydroxide toe aan één milliliter van de gefilterde kleuringsoplossing.

Centrifugeer de oplossing na kort vortexen bij 20 000 G. Ontlaad de met koolstof gecoate grids met de gecoate zijde naar boven met behulp van de volgende instellingen. Pipetteer, zodra dit is voltooid, 3,5 µl monster op het met glow discharge behandelde grid. Gebruik na vier minuten een stukje filterpapier om het monster weg te zuigen door het filterpapier zijdelings in contact te brengen met het grid.

Voeg direct daarna 3,5 µL van de kleuringsoplossing toe aan het raster. Trek de kleuring na één minuut weg en houd het filterpapier één tot twee minuten tegen het raster aan. Plaats het raster in een TEM-objecthouder.

Een afbeelding gemaakt met een A-J-E-O-L GM 1400, bedreven bij 80 kilovolt met een vergroting variërend van 10 K tot 80 K. Zodra de vorm is geïdentificeerd, selecteert u de strengen op het moleculaire canvas die overeenkomen met de vorm. Vervang het blootgestelde domein door een poly T-segment van 10 tot 11 nucleotiden lang, of voeg een randbeschermer toe die complementair is aan het blootgestelde domein en beëindig deze met een poly T-segment van 10 tot 11 nucleotiden lang. Om aggregatie te voorkomen, maakt u een strengenbibliotheek voor het moleculaire canvas van 310 pixels, inclusief het korset.

Stel set één ster, set twee ster, set drie ster en set vier ster samen om een totaal van 1.344 randbeschermers te verkrijgen. Na het centrifugeren van de 96-wellplaten voor de verschillende sets, pipetteer één µL van 206 strengen uit de kernset, nul uit set één ster, nul uit set twee ster, nul uit set drie ster en 24 strengen uit set vier ster in een centrifugebuis van 2 mL. Voeg 20 µL gedestilleerd gedeïoniseerd water toe aan de buis om een voorraadoplossing van 400 nM van de DNA-strengen te maken.

Voeg vervolgens 50 µL van de 400 nM voorraadoplossing, 10 µL van 10 x annealing buffer B en 40 µL gedestilleerd gedeïoniseerd water toe aan een 0,2 mL PCR-buis en laat het mengsel 17 uur in de thermocycler reageren zoals eerder beschreven. Na het zuiveren van het monster en het meten van de DNA-concentratie, wordt het monster op dezelfde wijze als voorheen afgebeeld met een FM om ten slotte rechthoeken van verschillende grootte te construeren door simpelweg het aantal parallelle helices en het aantal helixwindingen te variëren.

De zelfassemblage van enkelstrengs tegels resulteert in een rechthoek van 24 HELOCs bij 28 windingen; de DNA-sequenties voor de verschillende enkelstrengs tegels kunnen worden aangepast en geoptimaliseerd om strep-divisie en labeling mogelijk te maken, waardoor een rechthoek kan worden getransformeerd in een buis. De programmeerbare zelfassemblage van enkelstrengs tegels om buizen en rechthoeken van variërende afmetingen te vormen, en de constructie van willekeurige tweedimensionale vormen met behulp van het molecular canvas-domeinsubstitutieontwerp en het edge-protector-ontwerp, werden getest als oplossingen voor aggregatie langs blootgestelde domeinen van willekeurige vormen. Beide ontwerpen vertonen een vergelijkbare gelopbrengst en structurele integriteit, maar het edge-protector-ontwerp is kosteneffectiever omdat er minder hulpstoffen nodig zijn.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe complexe DNA-nanostructuren kunnen worden gemaakt op basis van enkelstrengs tiles.