Levensvatbaarheid van Bioprinted Cellular constructen met behulp van een drie Dispenser cartesiaanse Printer
22 september 2015
Een Cartesische bioprinter werd ontworpen en gemaakt om multi-materiaal depositie in nauwkeurige, reproduceerbare geometrieën mogelijk te maken, terwijl ook controle van omgevingsfactoren wordt toegestaan. Met behulp van de driedimensionale bioprinter kunnen complexe en levensvatbare constructies worden afgedrukt en gemakkelijk worden gereproduceerd.
Het algemene doel van deze procedure is om levensvatbare celbeladen constructen met een complexe geometrie te genereren met behulp van een 3D Bioprint. Dit wordt bereikt door eerst humane adiposse-weefselstromacellen uit de cultuur te isoleren. Vervolgens worden de cellen gemengd met vers bereide geoxideerde RGD-geconjugeerde alginaat bio-inkt.
In de laatste stap wordt de cel LA in biomateriaal geëxtrudeerd via bioprinting. Uiteindelijk wordt confocale microscopie gebruikt om de levensvatbaarheid, proliferatie en migratie van de bioprinted cellen te analyseren. Het belangrijkste voordeel van deze procedure ten opzichte van bestaande procedures, zoals scaffold-vorming en celzaaien, is dat met onze procedure de cellen en celaggregaten direct kunnen worden geplaatst waar ze moeten zijn om het weefsel te vormen.
De procedure wordt vandaag gedemonstreerd door Sarah Grace Dennis, een afgestudeerde student uit mijn laboratorium. Begin met het zaaien van 350.000 humane adiposse-weefselstromacellen op een behandelde T 75 flacon in 15 milliliter lage glucose TMEM voor expansie in een cellencultuurincubator. Wanneer de cultuur 80% confluency bereikt, verwijder het medium en spoel de cellen af in vijf milliliter DPBS zonder calcium en magnesium.
Bekijk vervolgens de cellen in vijf milliliter trypsine en DPBS gedurende twee minuten bij 37 graden Celsius wanneer de cellen zijn losgekomen, stop de enzymatische reactie met drie milliliter celcultuurmedium en breng de cellen over in een 50 milliliter conische buis. Centrifugeer vervolgens de cellen en suspendeer het pellet in twee milliliter celcultuurmedium. Tel vervolgens de cellen, breng een 1,3 keer 10 van de zes cellen-aliquot over in een 15 milliliter conische buis en centrifugeer de cellen opnieuw.
Suspen deer het pellet in een milliliter vers bereide bio-inkt, zorg ervoor dat de cellen homogeen worden verdeeld in de waterige alginate-oplossing. Laad vervolgens de cellen in een steriele printercompatibele drie milliliter spuit en schroef een steriele 22 gauge kunststof tip erop. Schakel nu de bioprint in, elk van de dispensercomputers en het recirculerende waterbad in.
Stel handmatig de badtemperatuur in op vier graden Celsius voor de atie-mechanisme en de afdrukparameters voor elke dispenser op de bijbehorende dispensercomputer. Stel het doseervolume in op 230 nanoliters, het aantal terugslagen op nul en de doseersnelheid op 10 microliter per seconde. Open vervolgens de ontwerpsoftware en het programma voor het bekijken van de USB-cameraweergave op de computer.
Voer vervolgens handmatig de coördinaten in voor een vijf bij vijf stipjesarray met 2,4 millimeter ruimte tussen de druppels. Sla het programma op en stuur het programma naar de robot. Plaats vervolgens een gelatine-titandioxide bevattende petrischaal op de printerfase van vier graden Celsius en sluit en vergrendel de kamerdeur.
Gebruik de programmeerbare logicacontroller om de ultraviolette lichtbronnen te initialiseren om de kamer te steriliseren. Open na 90 seconden de kamer en laad de spuit met de humane adiposse-weefselstromacellensuspensie in pistool één, sluit en vergrendel de kamerdeur en gebruik de programmeerbare logicacontroller om het ventilatorsysteem in te schakelen. Wacht 30 seconden tot de interne druk is geëgaliseerd en voer vervolgens het programma met de geometrische baan en afdrukparameters tijdens het afdrukproces uit.
Bekijk de USB-cameraweergave op de computer om een nauwkeurige en uniforme afdruk te bevestigen. Om de levensvatbaarheid van de bioprinted constructen te kwantificeren, dompelt u ze onder in vers bereide kleuroplossing. Plaats vervolgens de constructen gedurende 15 minuten in de koelkast in het donker om de kleur te laten inslaan.
Gebruik vervolgens een confocale microscoop om de gekleurde constructen te bekijken, als de cellen geel of groen lijken, classificeer ze als levend, als rood, zijn de cellen dood. Zoals deze resultaten aantonen, vergemakkelijkt bioprinting de afzetting van celhulp en hydrogels op specifieke driedimensionale locaties nauwkeurig en consistent met behulp van computergestuurde software. De computersoftware bepaalt de plaatsing van elke druppel en regelt veel van de parameters voor het doseren.
Een van de vereisten voor een succesvolle bioprintingtechniek is dat de cellen hier levensvatbaar blijven. Cellen afgedrukt in alginic bio-inkt zoals zojuist is gedemonstreerd, werden een uur en acht dagen na het afdrukken geanalyseerd met 98% van de cellen die groen en levensvatbaar waren op dag nul en tot 95% op dag acht. Zoals de rode kleuring aangeeft, werden op beide tijdstippen weinig dode cellen waargenomen, wat de geschiktheid van de alternatieve inkt voor bioprinting bevestigt.
Bovendien verbetert RGD-geconjugeerd algin-inkt de hechting van de cellen aan de afgedrukte constructen, wat leidt tot een verbeterde celspreiding en proliferatie, zoals gekwantificeerd in drie afzonderlijke gebieden van de hydrogel op nul en acht. Hier werd een vergelijking van de kwaliteit van de RGD-peptideconjugatie op ginnet bio-inkt vergeleken met het gebruik van Ginnet bio-inkt alleen op dag acht. De celspreiding die werd waargenomen in het RGD-geconjugeerde ginnet gekleurde monster, wees op de succesvolle incorporatie van het peptide op de ginnet, een fenomeen dat duidelijk afwezig was in de niet-geconjugeerde bioprintmonsters na de ontwikkeling.
Deze techniek heeft het pad gebaand voor onderzoekers op het gebied van weefsel engineering om additieve fabricage te verkennen als een middel voor het assembleren van levende geëngend constructen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een procedure voor het genereren van levensvatbare, met cellen geladen constructen met complexe geometrieën met behulp van een 3D-bioprinter. De methode omvat het isoleren van stromale cellen uit menselijk vetweefsel en het mengen daarvan met een bio-inkt vóór extrusie via de bioprinter.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Bioprinten
- Celbiologie
- Tissue engineering
Achtergrond
- 3D-bioprinten maakt een nauwkeurige plaatsing van cellen mogelijk.
- Traditionele methoden omvatten de vorming van een scaffold en het zaaien van cellen.
- Directe plaatsing van cellen kan de weefselvorming verbeteren.
- Confocale microscopie wordt gebruikt voor de analyse van de celviabiliteit.
Doel van de studie
- Het creëren van complexe, levensvatbare constructen met behulp van een 3D-bioprinter.
- Het verbeteren van de nauwkeurigheid van celplaatsing in tissue engineering.
- Het analyseren van het gedrag van gebioprinte cellen na het printen.
Gebruikte methoden
- Isolatie van stromale cellen uit menselijk vetweefsel.
- Bereiding van geoxideerde RGD-geconjugeerde alginaat bio-inkt.
- Extrusie van celhoudend biomateriaal via bioprinting.
- Analyse van celviabiliteit, proliferatie en migratie met behulp van confocale microscopie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle generatie van levensvatbare, celhoudende constructen.
- Verbeterde controle over de celplaatsing in vergelijking met traditionele methoden.
- Aangetoonde levensvatbaarheid en proliferatie van biogeprinte cellen.
- Confocale microscopie bevestigde de celmigratiepatronen.
Conclusies
- De 3D-bioprinter maakt een nauwkeurige en reproduceerbare plaatsing van cellen mogelijk.
- Deze methode kan potentieel bijdragen aan de vooruitgang van toepassingen in tissue engineering.
- Toekomstige studies kunnen verdere toepassingen van deze bioprinttechniek onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Deze bioprintmethode maakt een precieze ruimtelijke organisatie van cellen binnen complexe 3D-geometrieën mogelijk, waarmee een cruciale uitdaging in tissue engineering voor regeneratieve geneeskunde en ziektemodellering wordt aangepakt. Door een hoge celviabiliteit te behouden en proliferatie te ondersteunen, biedt deze benadering een reproduceerbaar platform voor het evalueren van therapeutische kandidaten in fysiologisch relevante constructen. Deze mogelijkheid ondersteunt targetvalidatie in een vroeg stadium en mechanistische risicoreductie door het direct plaatsen van bioactieve agentia in gedefinieerde micro-omgevingen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & doelwitvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door middel van ruimtelijk gecontroleerde celdepositie in biomimetische architecturen.
- Operationele waarde: Ondersteunt functionele target-validatie door het behouden van celviabiliteit (>95% op dag acht) en proliferatie in geprinte constructen.
- Voorspellende waarde: Verhoogt het vertrouwen in target-engagement door het repliceren van een organisatie die lijkt op natuurlijk weefsel voor compound-screening.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Produceert gestandaardiseerde, levensvatbare celhoudende constructen met kwantificeerbare resultaten via confocale microscopie voor levensvatbaarheid, proliferatie en migratie.
- Operationele waarde: Maakt reproduceerbaarheid van assays mogelijk door controleerbare printparameters en computerondersteunde ontwerpfabricage.
- Schaalbaarheid: Faciliteert hergebruik van het platform voor downstream evaluatie van verbindingen via precieze druppelplaatsing en omgevingscontrole.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Ondersteunt de overgang van ontdekking naar preklinische validatie door het behoud van de celfunctie in RGD-geconjugeerde alginaat bio-inkt.
- Mechanische risicoreductie: Verbetert de voorspellende betrouwbaarheid door verbeterde celadhesie en -spreiding dankzij de conjugatie van het RGD-peptide.
- Ziekterelevant systeem: Genereert biomimetische weefselconstructen die de organisatie van de natuurlijke extracellulaire matrix nauwkeurig nabootsen.
Pipeline- & workflowintegratie
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm, van vroege targetvalidatie tot leadidentificatie, door reproduceerbare, kwantificeerbare biologische read-outs in gemanipuleerde weefsels te leveren.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing en de verduidelijking van signaalpaden via de nauwkeurige plaatsing van cellen en hydrogels in gedefinieerde 3D-locaties.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid door gestandaardiseerde productie van constructen en kwantitatieve confocale beeldvorming van het celgedrag.
- Analytiek: Maakt vergelijkende analyse van condities mogelijk met behulp van metrieken voor viabiliteit, proliferatie en migratie uit gekleurde constructen.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan bij preklinisch werk door de celfunctie in bio-inkt gedurende acht dagen na het printen te behouden.
- Herbruikbaarheid binnen de organisatie: Creëert een herbruikbare capaciteit voor het genereren van complexe geometrieën over meerdere projecten via programmeerbare dispensering en softwarematige aansturing.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen in targetvalidatie door verminderde mechanistische ambiguïteit in cel-omgevingsinteracties.
- Operationele waarde: Standaardisatie en reproduceerbaarheid via gecontroleerde doseerparameters en een steriele kameromgeving.
- Strategische waarde: Verbeterde go/no-go-beslissingen door het mogelijk maken van vroege beoordeling van cellulaire reacties in weefselachtige contexten.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering door kwantitatieve levensvatbaarheids- en proliferatiegegevens die de voortgangscriteria ondersteunen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in celisolatie, de bereiding van bio-inkt en confocale microscopie voor de beoordeling van de levensvatbaarheid.
- Afhankelijk van bioprinter-hardware, steriele spuitensystemen en temperatuurgecontroleerde printplatformen.
- Vereist standaardisatie tussen teams van CAD-ontwerpen, doseersnelheden en omgevingscontroles.
- Overwegingen voor adaptatie omvatten de samenstelling van de bio-inkt en de compatibiliteit van het celtype met alginaatgebaseerde matrices.
- Praktische beperkingen omvatten risico's op verstopping van de nozzle en de noodzaak van kleuringsprotocollen na het printen om de levensvatbaarheid te kwantificeren.
