Levensvatbaarheid van Bioprinted Cellular constructen met behulp van een drie Dispenser cartesiaanse Printer
September 22nd, 2015
Een Cartesische bioprinter werd ontworpen en gemaakt om multi-materiaal depositie in nauwkeurige, reproduceerbare geometrieën mogelijk te maken, terwijl ook controle van omgevingsfactoren wordt toegestaan. Met behulp van de driedimensionale bioprinter kunnen complexe en levensvatbare constructies worden afgedrukt en gemakkelijk worden gereproduceerd.
Het algemene doel van deze procedure is om levensvatbare celbeladen constructen met een complexe geometrie te genereren met behulp van een 3D Bioprint. Dit wordt bereikt door eerst humane adiposse-weefselstromacellen uit de cultuur te isoleren. Vervolgens worden de cellen gemengd met vers bereide geoxideerde RGD-geconjugeerde alginaat bio-inkt.
In de laatste stap wordt de cel LA in biomateriaal geëxtrudeerd via bioprinting. Uiteindelijk wordt confocale microscopie gebruikt om de levensvatbaarheid, proliferatie en migratie van de bioprinted cellen te analyseren. Het belangrijkste voordeel van deze procedure ten opzichte van bestaande procedures, zoals scaffold-vorming en celzaaien, is dat met onze procedure de cellen en celaggregaten direct kunnen worden geplaatst waar ze moeten zijn om het weefsel te vormen.
De procedure wordt vandaag gedemonstreerd door Sarah Grace Dennis, een afgestudeerde student uit mijn laboratorium. Begin met het zaaien van 350.000 humane adiposse-weefselstromacellen op een behandelde T 75 flacon in 15 milliliter lage glucose TMEM voor expansie in een cellencultuurincubator. Wanneer de cultuur 80% confluency bereikt, verwijder het medium en spoel de cellen af in vijf milliliter DPBS zonder calcium en magnesium.
Bekijk vervolgens de cellen in vijf milliliter trypsine en DPBS gedurende twee minuten bij 37 graden Celsius wanneer de cellen zijn losgekomen, stop de enzymatische reactie met drie milliliter celcultuurmedium en breng de cellen over in een 50 milliliter conische buis. Centrifugeer vervolgens de cellen en suspendeer het pellet in twee milliliter celcultuurmedium. Tel vervolgens de cellen, breng een 1,3 keer 10 van de zes cellen-aliquot over in een 15 milliliter conische buis en centrifugeer de cellen opnieuw.
Suspen deer het pellet in een milliliter vers bereide bio-inkt, zorg ervoor dat de cellen homogeen worden verdeeld in de waterige alginate-oplossing. Laad vervolgens de cellen in een steriele printercompatibele drie milliliter spuit en schroef een steriele 22 gauge kunststof tip erop. Schakel nu de bioprint in, elk van de dispensercomputers en het recirculerende waterbad in.
Stel handmatig de badtemperatuur in op vier graden Celsius voor de atie-mechanisme en de afdrukparameters voor elke dispenser op de bijbehorende dispensercomputer. Stel het doseervolume in op 230 nanoliters, het aantal terugslagen op nul en de doseersnelheid op 10 microliter per seconde. Open vervolgens de ontwerpsoftware en het programma voor het bekijken van de USB-cameraweergave op de computer.
Voer vervolgens handmatig de coördinaten in voor een vijf bij vijf stipjesarray met 2,4 millimeter ruimte tussen de druppels. Sla het programma op en stuur het programma naar de robot. Plaats vervolgens een gelatine-titandioxide bevattende petrischaal op de printerfase van vier graden Celsius en sluit en vergrendel de kamerdeur.
Gebruik de programmeerbare logicacontroller om de ultraviolette lichtbronnen te initialiseren om de kamer te steriliseren. Open na 90 seconden de kamer en laad de spuit met de humane adiposse-weefselstromacellensuspensie in pistool één, sluit en vergrendel de kamerdeur en gebruik de programmeerbare logicacontroller om het ventilatorsysteem in te schakelen. Wacht 30 seconden tot de interne druk is geëgaliseerd en voer vervolgens het programma met de geometrische baan en afdrukparameters tijdens het afdrukproces uit.
Bekijk de USB-cameraweergave op de computer om een nauwkeurige en uniforme afdruk te bevestigen. Om de levensvatbaarheid van de bioprinted constructen te kwantificeren, dompelt u ze onder in vers bereide kleuroplossing. Plaats vervolgens de constructen gedurende 15 minuten in de koelkast in het donker om de kleur te laten inslaan.
Gebruik vervolgens een confocale microscoop om de gekleurde constructen te bekijken, als de cellen geel of groen lijken, classificeer ze als levend, als rood, zijn de cellen dood. Zoals deze resultaten aantonen, vergemakkelijkt bioprinting de afzetting van celhulp en hydrogels op specifieke driedimensionale locaties nauwkeurig en consistent met behulp van computergestuurde software. De computersoftware bepaalt de plaatsing van elke druppel en regelt veel van de parameters voor het doseren.
Een van de vereisten voor een succesvolle bioprintingtechniek is dat de cellen hier levensvatbaar blijven. Cellen afgedrukt in alginic bio-inkt zoals zojuist is gedemonstreerd, werden een uur en acht dagen na het afdrukken geanalyseerd met 98% van de cellen die groen en levensvatbaar waren op dag nul en tot 95% op dag acht. Zoals de rode kleuring aangeeft, werden op beide tijdstippen weinig dode cellen waargenomen, wat de geschiktheid van de alternatieve inkt voor bioprinting bevestigt.
Bovendien verbetert RGD-geconjugeerd algin-inkt de hechting van de cellen aan de afgedrukte constructen, wat leidt tot een verbeterde celspreiding en proliferatie, zoals gekwantificeerd in drie afzonderlijke gebieden van de hydrogel op nul en acht. Hier werd een vergelijking van de kwaliteit van de RGD-peptideconjugatie op ginnet bio-inkt vergeleken met het gebruik van Ginnet bio-inkt alleen op dag acht. De celspreiding die werd waargenomen in het RGD-geconjugeerde ginnet gekleurde monster, wees op de succesvolle incorporatie van het peptide op de ginnet, een fenomeen dat duidelijk afwezig was in de niet-geconjugeerde bioprintmonsters na de ontwikkeling.
Deze techniek heeft het pad gebaand voor onderzoekers op het gebied van weefsel engineering om additieve fabricage te verkennen als een middel voor het assembleren van levende geëngend constructen.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie presenteert een procedure voor het genereren van levensvatbare, celbevattende constructies met complexe geometrieën met behulp van een 3D-bioprinter. De methode omvat het isoleren van humane adipoge weefselstromacellen en het mengen met een bio inkt voordat het door de bioprinter wordt geëxtrudeerd.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Bioprinting
- Celbiologie
- Weefsel engineering
Achtergrond
- 3D-bioprinting maakt nauwkeurige plaatsing van cellen mogelijk.
- Traditionele methoden omvatten scaffold vorming en celzaaien.
- Directe plaatsing van cellen kan weefselvorming verbeteren.
- Confocale microscopie wordt gebruikt voor analyse van cellevensvatbaarheid.
Doel van het onderzoek
- Complexe, levensvatbare constructies creëren met behulp van een 3D-bioprinter.
- De nauwkeurigheid van celplaatsing in weefsel engineering verbeteren.
- Het gedrag van biogedrukte cellen na het printen analyseren.
Gebruikte methoden
- Isoleren van humane adipoge weefselstromacellen.
- Bereiding van geoxideerde RGD-geconjugeerde alginaat bio inkt.
- Extrusie van celbevattend biomateriaal via bioprinting.
- Analyse van cellevensvatbaarheid, proliferatie en migratie met behulp van confocale microscopie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle generatie van levensvatbare, celbevattende constructies.
- Verbeterde controle over celplaatsing vergeleken met traditionele methoden.
- Aangetoond levensvatbaarheid en proliferatie van biogedrukte cellen.
- Confocale microscopie bevestigde celmigratiepatronen.
Conclusies
- De 3D-bioprinter maakt nauwkeurige en reproduceerbare celplaatsing mogelijk.
- Deze methode kan mogelijk weefsel engineering toepassingen bevorderen.
- Toekomstige studies kunnen verdere toepassingen van deze bioprintingtechniek onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This bioprinting method enables precise spatial organization of cells within complex 3D geometries, addressing a key challenge in tissue engineering for regenerative medicine and disease modeling. By maintaining high cell viability and supporting proliferation, the approach provides a reproducible platform for evaluating therapeutic candidates in physiologically relevant constructs. This capability supports early-stage target validation and mechanistic de-risking by allowing direct placement of bioactive agents in defined microenvironments.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through spatially controlled cell deposition in biomimetic architectures.
- Operational Value: Supports functional target validation by maintaining cell viability (>95% at day eight) and proliferation in printed constructs.
- Predictive Value: Enhances confidence in target engagement by replicating native tissue-like organization for compound screening.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, viable cell-laden constructs with quantifiable outputs via confocal microscopy for viability, proliferation, and migration.
- Operational Value: Enables assay reproducibility through controllable printing parameters and computer-aided design manufacturing.
- Scalability: Facilitates platform reuse for downstream compound evaluation via precise droplet placement and environmental control.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports progression from discovery to preclinical validation by maintaining cell function in RGD-conjugated alginate bio ink.
- Mechanistic De-risking: Improves predictive confidence through enhanced cell adhesion and spreading due to RGD peptide conjugation.
- Disease-Relevant System: Generates biomimetic tissue constructs that closely mimic native extracellular matrix organization.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification by providing reproducible, quantifiable biological readouts in engineered tissues.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via precise placement of cells and hydrogels in defined 3D locations.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized construct production and quantitative confocal imaging of cell behavior.
- Analytics: Enables comparative analysis of conditions using viability, proliferation, and migration metrics from stained constructs.
- Translational Research: Connects to preclinical work by maintaining cell function in bio ink over eight days post-printing.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for generating complex geometries across multiple projects via programmable dispensing and software control.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduced mechanistic ambiguity in cell-environment interactions.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via controlled dispensing parameters and sterile chamber environment.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by enabling early assessment of cellular responses in tissue-like contexts.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization through quantitative viability and proliferation data supporting advancement criteria.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell isolation, bio ink preparation, and confocal microscopy for viability assessment.
- Dependent on bioprinter hardware, sterile syringe systems, and temperature-controlled printing stages.
- Necessitates cross-team standardization of CAD designs, dispensing rates, and environmental controls.
- Adaptation considerations include bio ink composition and cell type compatibility with alginate-based matrices.
- Practical limitations include nozzle clogging risks and the need for post-print staining protocols to quantify viability.
