Name: Bioprinting Cellularized Construeert met een tissue-specifieke Hydrogel Bioink (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Leer een veelzijdige methode voor het ontwerpen van hydrogel bioinks voor bioprinting. Deze techniek maakt 3D-weefselconstructies met modulaire componenten voor onderzoek naar geneesmiddelen en ziektes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs dankbaar financiering door de Defense Threat Reduction Agency (DTRA) onder Space and Naval Warfare Systems Center Pacific (SSC PACIFIC) Contract No. N6601-13-C-2027 te erkennen. De publicatie van dit materiaal niet de goedkeuring door de regering van de bevindingen of conclusies hierin vormen.

1. Hydrogel Bioink formuleringen en Voorbereiding <ol><li> Om weefselspecifieke biochemische bieden bereiden weefselspecifieke ECM verteren oplossingen zoals eerder beschreven voor de lever. 20 Opmerking: In het algemeen zal deze ECM digest 40% van het uiteindelijke hydrogel bioink volume dat wordt gebruikt omvatten. Honderden ml ECM digest oplossing kan worden bereid, in porties verdeeld en ingevroren bij -80 ° C voor toekomstig gebruik. </li><li> Vóór formulering hydrogel lossen een foto-initiator, 2-hydroxy-4 &#39;- (2-hydroxyethoxy) -2-methylpropiofenon, in water van 0,1% w / v. Opmerking: De volumes in de 50-100 ml bereik kan van tevoren worden voorbereid en opgeslagen afgeschermd van licht bij 4 ° C gedurende enkele maanden. </li><li> Om hydrogel bioinks te vormen, eerst op te lossen het basismateriaal componenten uit de hyaluronzuur (HA) hydrogel kits in het water-foto-initiator-oplossing. <ol><li> Los de gethioleerde HA en gethioleerde gelatine afzonderlijk in water-photoinitiator oplossing (stap 1,2) tot 2% te w / v oplossing. </li><li> Ontbinden polyethyleenglycoldiacrylaat (PEGDA), de crosslinker in de hydrogel kits, in water-fotoinitiator oplossing (stap 1,2) een 8% w / v oplossing. </li><li> Ontbinden polyethyleenglycol (PEG) 8-Arm alkyn (10 kDa) in water-fotoinitiator oplossing (stap 1,2) een 8% w / v oplossing. </li></ol></li><li> In het algemeen vormen hydrogels met behulp van het volgende schema, hoewel er meer maatwerk mogelijk is. <ol><li> Combineer 4 delen 2% gethioleerde HA, 4 delen 2% gethioleerde gelatine, 1 deel crosslinker 1, 1 deel crosslinker 2 met 8 delen weefsel ECM-oplossing en 2 delen hepatocyt cultuur media (HCM) (of 10 delen water als een generieke non-weefsel -specifieke hydrogel). Let op: Extra ongewijzigde HA of gelatine kan worden toegevoegd aan de bioink extruderen soepeler te maken. Dit wordt hieronder beschreven. </li></ol></li><li> Vortex het verkregen mengsel op hoge (snelheid 10 van 10) gedurende 10 seconden te mengen voor gebruik. &lt;/ Li&gt; <li> Gebruik van hydrogel bioink <ol><li> Voor extrusie of bioprinting testen, breng het mengsel in een spuit of printer cartridge en laat deze spontaan verknopen gedurende 30 minuten (stap 1 verknoping) bij 37 ° C. </li><li> Voor reologische metingen, breng het mengsel in een 35 mm petrischaal en laat het verknopen gedurende 30 min. Opmerking: Het mengsel begint onmiddellijk verknopen door de vorming thiol-acrylaat binding en zal beginnen te stijgen viscositeit. Het mengsel dient binnen 10 minuten overgebracht naar een injectiespuit, inktpatroon of doellocatie verstopping van een pipet of spuitje tijdens de overdracht te voorkomen. </li><li> Als secundaire crosslinking (fase 2) is gewenst, bestralen het stadium 1-verknoopte gels met ultraviolet licht (365 nm, 18 W / cm 2) een thiol-alkyn polymerisatiereactie te initiëren. Opmerking: duur van de bestraling is afhankelijk van het oppervlak van het materiaal. In het algemeen een vierkante centimeter materiaal vereist slechts 1-2 sec UV blootstelling bij deze UV ​​energie. </li></ol></li></ol> 2. Printer Compatibility Testing <ol><li> Voorafgaand aan integratie testen met bioprinting apparaten, test-extrusie-eigenschappen op het laboratorium bank met eenvoudige extrusie testen met behulp van standaard spuiten en kleine naald tips (20-30 meter). <ol><li> Duw de bioink via een standaard injectiespuit soepel geëxtrudeerde filamenten van hydrogel met weinig of geen oneffenheden bereiken. Extruderen van lijnen of eenvoudige patronen is voldoende om succes te bepalen. </li></ol></li><li> Voor bioprinter integratie, laadt bioink voorbereidingen door pipetteren ze in printer cartridges en laat 30 min voor de bioink spontane fase 1 verknoping binnen de cartridge te ondergaan. Opmerking: volume van bioink afhankelijk van de specifieke toepassing en moet worden bepaald door de gebruiker. Printer cartridges kunnen lijken op of zijn injectiespuiten die compatibel zijn met de bioprinter apparaat. </li><li> Evalueer extrusie compatibiliteitvoor bioprinting door het afdrukken van een eenvoudig patroon met behulp van de bioink. Zo drukt u een 7 x 7 mm patroon bestaat uit parallelle lijnen. Toepassen druk (bijvoorbeeld 20 kPa pneumatische druk) terwijl de printkop beweegt in het XY-vlak met een snelheid van ongeveer 300 mm / min. Opmerking: Printkop nozzle diameters van verschillende afmetingen kan worden gebruikt, maar kegelvormige mondstukken met 400-500 pM diameter openingen zijn optimaal voor het afdrukken van sferoïden in het bereik 250-350 urn. <ol><li> Als de geëxtrudeerde materialen zijn klonterig of onregelmatig, zie stap 2.4, of het bedrag van PEGDA terug te brengen tot het stadium 1 verknoopte materiaal te verzachten. Goed voorbereid bioink formuleringen extruderen soepel, waardoor nauwkeurige afzetting in de gewenste patronen of architecturen. Opmerking: De bioprinting procedures beschreven een aangepaste 3-D bioprinting inrichting uitgevoerd huis speciaal voor weefselconstruct afdrukken 32 Als zodanig printvereisten parameters variëren sterk voor alle typen inrichtingen en vereisen testin.g Door de gebruiker. </li></ol></li><li> Ter verbetering extrusie-eigenschappen, vullen ongemodificeerde gelatine HA en de bioinks (1,5 mg / ml en 30 mg / ml). </li></ol> 3. Validatie van Bioprinting met primaire leverkanker constructen <ol><li> Bereid 3-D bolletjes primaire cel lever door opknoping druppel methoden zoals de mobiele component 33 Opmerking: Bioprinting kan worden uitgevoerd zonder sferoïden, maar met individuele cellen gesuspendeerd in de hydrogel bioinks ook. Sferoïden worden hier gebruikt om cel-cel interacties versnellen en construeren functionaliteit. Het aantal sferoïden of cellen gebruikt afhankelijk van de specifieke toepassing en moet worden bepaald door de gebruiker. Deze stappen worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden met steriele levering. <ol><li> HCM bereiden door de ontdooide inhoud van de HCM supplement componentenkit toevoegen aan de hepatocyten basale media (HBM) en steriele filtering. <ol><li> Ontdooi het supplement componenten until vloeistof. </li><li> Voeg het supplement componenten (ascorbinezuur, 0,5 ml; runderserumalbumine [vetzuurvrij], 10 ml; gentamicinesulfaat / amfotericine B, 0,5 ml, hydrocortison 21-hemisuccinaat, 0,5 ml, insuline, 0,5 ml; humane recombinante epidermale groeifactor , 0,5 ml; doorvoeren, 0,5 ml) aan de 500 ml HBM. </li><li> Steriel filter door middel van een 0,45 pm of 0,22 pm filter met behulp van een fles-top filter eenheid of een spuit tip filter. </li></ol></li><li> Bepaal de celdichtheid van primaire humane hepatocyten, Kupffer cellen en stellaatcellen door telling op een hemocytometer na elk celtype werd ontdooid volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Combineer primaire humane hepatocyten, Kupffer cellen en stellaatcellen per 80:10:10 verhouding van het aantal cellen in HCM media die is verwarmd tot 37 ° C in een conische buis. Opmerking: De hoeveelheid te gebruiken media afhankelijk van het totale aantal cellen die specifiek zijn voor de toepassing en moet worden bepaald door The gebruiker. </li><li> Centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 minuten bij 520 x g bij 20 ° C. </li><li> Zuig het supernatant met achterlating de celpellet. </li><li> Resuspendeer de celpellet in HCM media een celsuspensie met 1000 cellen per 40 ul medium werd verkregen. Totale volume is afhankelijk van het aantal sferoïden geproduceerd. </li><li> Breng de celsuspensie 96 putjes hangende druppel platen. Voeg een totaal van ongeveer 1000 cellen per putje in HCM en handhaven op 37 ° C in 5% CO2 gedurende 3 dagen waarin multicellulaire sferoïden te vormen. </li><li> Verzamel lever sferoïden van de opknoping druppel plaat met behulp van een pipet. Transfer naar een steriele 15 ml conische buis. </li></ol></li><li> Bioprint lever sferoïden in de lever-specifieke hydrogel bioink <ol><li> Bereid een preparaat van lever-ECM bevattende hydrogel bioink zoals beschreven in stap 1, in dienst 8% PEGDA en 8% 8-arm PEG alkyn als verknopingsmiddelen. Gebruik deze combinatie voor zijn vermogen in resulting in een hydrogel dicht in shear elasticiteitsmodulus om native leverweefsel. </li><li> Laat de bolletjes naar de bodem van de conische buis waarin deze in stap 3.1.7 werd geplaatst. Dit is afhankelijk van bolvormige grootte en dichtheid, maar in het algemeen plaatsvindt binnen 1-2 min. Verwijder alle media door voorzichtig opzuigen of met een pipet. </li><li> Breng de gewenste hoeveelheid vers bereide hydrogel bioink oplossing van het conische buis met de sferoïden. In het algemeen, een geschikt volume 10% -25% groter dan het volume van de 3-D construct te drukken. pipet voorzichtig op en neer om de bolletjes opnieuw in suspensie in de hydrogel bioink oplossing. Overdragen aan een bioprinter cartridge met behulp van een pipet of serologische pipet. </li><li> In de bioprinter cartridge, laat de oplossing de eerste trap verknoping (thiol-acrylaat reactie) ondergaan 30 min. Opmerking: Afhankelijk van sferoïde grootte kan de patroon moet langzaam worden geroteerd of de inhoud moet worden gemengd meteen steriele spatel om de sferoïden verspreid over het bioink tijdens de fase 1 verknoping houden. Dit is minder noodzaak bioinks bereid met gesuspendeerde cellen in plaats van sferoïden. Opmerking: Na stadium 1 verknoping, gebruikers een werkvenster van enkele uren. Echter, is het raadzaam om de bioprinting proces snel uit te voeren om levensvatbaarheid van de cellen te verbeteren. </li><li> Na stadium 1 verknoping, gebruikt een inrichting bioprinting gewenste hydrogel structuren die de primaire lever sferoïden (of andere cellen) te creëren. Opmerking: Deze technologie verschaft een systeem voor biofabricating uiteenlopende structuren. Parameters zoals het totale volume, aantal cellen of sferoïden, de gedrukte structuur geometrie en substraat waarop constructen zijn gedrukt zijn sterk afhankelijk van de doelen van de gebruiker. </li><li> Na afzetting in de gewenste configuratie toedienen UV licht gedurende 2-4 seconden om de secundaire crosslinking mechanisme initiëren, stabiliserende constructs en verhogen de stijfheid op het gewenste niveau. Opmerking: De concentratie van PEG-alkyn, en dus tot de totale verknopingsdichtheid, regelt voornamelijk de eindconstructie stijfheid. </li><li> Herhaal de stappen 3.2.4 en 3.2.5 om meerlaagse constructies maken. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Visconti, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+organ+printing%3A+engineering+an+intra-organ+branched+vascular+tree%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Towards organ printing: engineering an intra-organ branched vascular tree.</a> Expert Opin Biol Ther. 10, 409-420 (2010).</li>
<li>Derby, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printing+and+prototyping+of+tissues+and+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Printing and prototyping of tissues and scaffolds.</a> Science. 338, 921-926 (2012).</li>
<li>Fedorovich, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+as+extracellular+matrices+for+skeletal+tissue+engineering%3A+state-of-the-art+and+novel+application+in+organ+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Hydrogels as extracellular matrices for skeletal tissue engineering: state-of-the-art and novel application in organ printing.</a> Tissue Eng. 13, 1905-1925 (2007).</li>
<li>Mironov, V., Boland, T., Trusk, T., Forgacs, G., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+printing%3A+computer-aided+jet-based+3D+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Organ printing: computer-aided jet-based 3D tissue engineering.</a> Trends Biotechnol. 21, 157-161 (2003).</li>
<li>Boland, T., Mironov, V., Gutowska, A., Roth, E. A., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+organ+printing+2%3A+fusion+of+cell+aggregates+in+three-dimensional+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec+A+Discov+Mol+Cell+Evol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell and organ printing 2: fusion of cell aggregates in three-dimensional gels.</a> Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol. 272, 497-502 (2003).</li>
<li>Mironov, V., Kasyanov, V., Drake, C., Markwald, R. R. Organ printing: promises and challenges. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMironov%2C+V+%22Regen+Med%22">Regen Med</a>. 3, 93-103 (2008).</li>
<li>Skardal, A., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials+for+integration+with+3-d+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Biomaterials for integration with 3-d bioprinting.</a> Ann Biomed Eng. 43, 730-746 (2015).</li>
<li>Mironov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+printing%3A+tissue+spheroids+as+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Organ printing: tissue spheroids as building blocks.</a> Biomaterials. 30, 2164-2174 (2009).</li>
<li>Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E., Forgacs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold-free+vascular+tissue+engineering+using+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Scaffold-free vascular tissue engineering using bioprinting.</a> Biomaterials. 30, 5910-5917 (2009).</li>
<li>Skardal, A., Zhang, J., Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprinting+vessel-like+constructs+using+hyaluronan+hydrogels+crosslinked+with+tetrahedral+polyethylene+glycol+tetracrylates%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Bioprinting vessel-like constructs using hyaluronan hydrogels crosslinked with tetrahedral polyethylene glycol tetracrylates.</a> Biomaterials. 31, 6173-6181 (2010).</li>
<li>Bertassoni, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct-write+bioprinting+of+cell-laden+methacrylated+gelatin+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Direct-write bioprinting of cell-laden methacrylated gelatin hydrogels.</a> Biofabrication. 6, 024105(2014).</li>
<li>Skardal, A., Zhang, J., McCoard, L., Oottamasathien, S., Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamically+crosslinked+gold+nanoparticle+-+hyaluronan+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">Dynamically crosslinked gold nanoparticle - hyaluronan hydrogels.</a> Adv Mater. 22, 4736-4740 (2010).</li>
<li>Skardal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photocrosslinkable+hyaluronan-gelatin+hydrogels+for+two-step+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Photocrosslinkable hyaluronan-gelatin hydrogels for two-step bioprinting.</a> Tissue Eng Part A. 16, 2675-2685 (2010).</li>
<li>Skardal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprinted+amniotic+fluid-derived+stem+cells+accelerate+healing+of+large+skin+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Bioprinted amniotic fluid-derived stem cells accelerate healing of large skin wounds.</a> Stem Cells Transl Med. 1, 792-802 (2012).</li>
<li>Xu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+printing+of+mechanically+and+biologically+improved+constructs+for+cartilage+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Hybrid printing of mechanically and biologically improved constructs for cartilage tissue engineering applications.</a> Biofabrication. 5, 015001(2013).</li>
<li>Xu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+heterogeneous+tissue+constructs+containing+multiple+cell+types+prepared+by+inkjet+printing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Complex heterogeneous tissue constructs containing multiple cell types prepared by inkjet printing technology.</a> Biomaterials. 34, 130-139 (2013).</li>
<li>Murphy, S. V., Skardal, A., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+hydrogels+for+bio-printing+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Evaluation of hydrogels for bio-printing applications.</a> J Biomed Mater Res A. 101, 272-284 (2013).</li>
<li>Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+as+a+biologic+scaffold+material%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix as a biologic scaffold material.</a> Biomaterials. 28, 3587-3593 (2007).</li>
<li>Freytes, D. O., Tullius, R. S., Valentin, J. E., Stewart-Akers, A. M., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrated+versus+lyophilized+forms+of+porcine+extracellular+matrix+derived+from+the+urinary+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Hydrated versus lyophilized forms of porcine extracellular matrix derived from the urinary bladder.</a> J Biomed Mater Res A. 87, 862-872 (2008).</li>
<li>Skardal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+specific+synthetic+ECM+hydrogels+for+3-D+in+vitro+maintenance+of+hepatocyte+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Tissue specific synthetic ECM hydrogels for 3-D in vitro maintenance of hepatocyte function.</a> Biomaterials. 33, 4565-4575 (2012).</li>
<li>Johnson, T. D., Braden, R. L., Christman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+ECM+scaffolds+for+cardiac+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Injectable ECM scaffolds for cardiac repair.</a> Methods Mol Biol. 1181, 109-120 (2014).</li>
<li>Pati, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printing+three-dimensional+tissue+analogues+with+decellularized+extracellular+matrix+bioink%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+comm%22%5BJournal%5D)">Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink.</a> Nat comm. 5, 3935(2014).</li>
<li>Vanderhooft, J. L., Alcoutlabi, M., Magda, J. J., Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheological+properties+of+cross-linked+hyaluronan-gelatin+hydrogels+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Rheological properties of cross-linked hyaluronan-gelatin hydrogels for tissue engineering.</a> Macromol Biosci. 9, 20-28 (2009).</li>
<li>Engler, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+cardiomyocytes+beat+best+on+a+matrix+with+heart-like+elasticity%3A+scar-like+rigidity+inhibits+beating%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Embryonic cardiomyocytes beat best on a matrix with heart-like elasticity: scar-like rigidity inhibits beating.</a> J Cell Sci. 121, 3794-3802 (2008).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126, 677-689 (2006).</li>
<li>Chaudhuri, T., Rehfeldt, F., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+collagen-coated+gels+that+maximize+in+vitro+myogenesis+of+stem+cells+by+matching+the+lateral+elasticity+of+in+vivo+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of collagen-coated gels that maximize in vitro myogenesis of stem cells by matching the lateral elasticity of in vivo muscle.</a> Methods Mol Biol. 621, 185-202 (2010).</li>
<li>Lozoya, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+hepatic+stem%2Fprogenitor+phenotype+by+microenvironment+stiffness+in+hydrogel+models+of+the+human+liver+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Regulation of hepatic stem/progenitor phenotype by microenvironment stiffness in hydrogel models of the human liver stem cell niche.</a> Biomaterials. 32, 7389-7402 (2011).</li>
<li>Holst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+elasticity+provides+mechanical+signals+for+the+expansion+of+hemopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Substrate elasticity provides mechanical signals for the expansion of hemopoietic stem and progenitor cells.</a> Nat Biotechnol. 28, 1123-1128 (2010).</li>
<li>Skardal, A., Mack, D., Atala, A., Soker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+elasticity+controls+cell+proliferation%2C+surface+marker+expression+and+motile+phenotype+in+amniotic+fluid-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mech+Behav+Biomed+Mater%22%5BJournal%5D)">Substrate elasticity controls cell proliferation, surface marker expression and motile phenotype in amniotic fluid-derived stem cells.</a> J Mech Behav Biomed Mater. 17, 307-316 (2013).</li>
<li>Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multimaterial+bioink+method+for+3D+printing+tunable%2C+cell-compatible+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels.</a> Adv Mater. 27, 1607-1614 (2015).</li>
<li>Malda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((25th+anniversary+article%3A+Engineering+hydrogels+for+biofabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">25th anniversary article: Engineering hydrogels for biofabrication.</a> Adv Mater. 25, 5011-5028 (2013).</li>
<li>Integrated organ and tissue printing methods, system and apparatus. US Patent. , 2012/00889238 A1 (2011).</li>
<li>Drewitz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+automated+production+and+drug+sensitivity+testing+using+scaffold-free+spherical+tumor+microtissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Towards automated production and drug sensitivity testing using scaffold-free spherical tumor microtissues.</a> Biotechnol J. 6, 1488-1496 (2011).</li>
<li>Skardal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hydrogel+bioink+toolkit+for+mimicking+native+tissue+biochemical+and+mechanical+properties+in+bioprinted+tissue+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">A hydrogel bioink toolkit for mimicking native tissue biochemical and mechanical properties in bioprinted tissue constructs.</a> Acta Biomater. 25, 24-34 (2015).</li>
<li>Peattie, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+in+vivo+angiogenesis+by+cytokine-loaded+hyaluronic+acid+hydrogel+implants%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Stimulation of in vivo angiogenesis by cytokine-loaded hyaluronic acid hydrogel implants.</a> Biomaterials. 25, 2789-2798 (2004).</li>
<li>Flynn, L., Prestwich, G. D., Semple, J. L., Woodhouse, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+engineering+with+naturally+derived+scaffolds+and+adipose-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue engineering with naturally derived scaffolds and adipose-derived stem cells.</a> Biomaterials. 28, 3834-3842 (2007).</li>
<li>Flynn, L., Prestwich, G. D., Semple, J. L., Woodhouse, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+engineering+in+vivo+with+adipose-derived+stem+cells+on+naturally+derived+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue engineering in vivo with adipose-derived stem cells on naturally derived scaffolds.</a> J Biomed Mater Res A. 89, 929-941 (2009).</li>
<li>Duflo, S., Thibeault, S. L., Li, W., Shu, X. Z., Prestwich, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+a+synthetic+extracellular+matrix+on+vocal+fold+lamina+propria+gene+expression+in+early+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Effect of a synthetic extracellular matrix on vocal fold lamina propria gene expression in early wound healing.</a> Tissue Eng. 12, 3201-3207 (2006).</li>
<li>Duflo, S., Thibeault, S. L., Li, W., Shu, X. Z., Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vocal+fold+tissue+repair+in+vivo+using+a+synthetic+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Vocal fold tissue repair in vivo using a synthetic extracellular matrix.</a> Tissue Eng. 12, 2171-2180 (2006).</li>
<li>Liu, Y., Shu, X. Z., Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteochondral+defect+repair+with+autologous+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+in+an+injectable%2C+in+situ%2C+cross-linked+synthetic+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Osteochondral defect repair with autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells in an injectable, in situ, cross-linked synthetic extracellular matrix.</a> Tissue Eng. 12, 3405-3416 (2006).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+repair+of+cortical+bone+defects+using+a+synthetic+extracellular+matrix+to+deliver+human+demineralized+bone+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Accelerated repair of cortical bone defects using a synthetic extracellular matrix to deliver human demineralized bone matrix.</a> J Orthop Res. 24, 1454-1462 (2006).</li>
<li>Zhang, J., Skardal, A., Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+extracellular+matrices+with+cleavable+crosslinkers+for+cell+expansion+and+easy+cell+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Engineered extracellular matrices with cleavable crosslinkers for cell expansion and easy cell recovery.</a> Biomaterials. 29, 4521-4531 (2008).</li>
<li>Serban, M. A., Scott, A., Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unit+10.14%2C+Use+of+hyaluronan-derived+hydrogels+for+three-dimensional+cell+culture+and+tumor+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Unit 10.14, Use of hyaluronan-derived hydrogels for three-dimensional cell culture and tumor xenografts.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 10, (2008).</li>
<li>Xu, X., Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+tumor+growth+and+angiogenesis+by+a+lysophosphatidic+acid+antagonist+in+an+engineered+three-dimensional+lung+cancer+xenograft+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Inhibition of tumor growth and angiogenesis by a lysophosphatidic acid antagonist in an engineered three-dimensional lung cancer xenograft model.</a> Cancer. 116, 1739-1750 (2010).</li>
<li>Liu, Y., Shu, X. Z., Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+engineering%3A+orthotopic+cancer+models+in+mice+using+cell-loaded%2C+injectable%2C+cross-linked+hyaluronan-derived+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Tumor engineering: orthotopic cancer models in mice using cell-loaded, injectable, cross-linked hyaluronan-derived hydrogels.</a> Tissue Eng. 13, 1091-1101 (2007).</li>
<li>Skardal, A., Devarasetty, M., Rodman, C., Atala, A., Soker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver-Tumor+Hybrid+Organoids+for+Modeling+Tumor+Growth+and+Drug+Response+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Liver-Tumor Hybrid Organoids for Modeling Tumor Growth and Drug Response In Vitro.</a> Ann Biomed Eng. , (2015).</li>
</ol>

Auteurs hebben niets te onthullen.

Er zijn verschillende componenten die essentieel zijn om te overwegen wanneer u probeert om biofabricate 3-D weefsel constructies, voor eventuele toepassing bij de mens of voor in vitro screening toepassingen. Onder toepassing van de geschikte cellulaire componenten bepaalt het einde mogelijke functionaliteit, terwijl de biofabrication apparaat zelf bepaalt de algemene methode voor het bereiken van het einde construct. De derde component, het biomateriaal, is net zo belangrijk, omdat het dient dubbele rol. Spec...

In de afgelopen jaren zijn verschillende technologieën beschikbaar komen die de behoefte aan alternatieve functionele organen en weefsels richt door te trachten vervaardigen of biofabricate, hen. Bioprinting heeft ontpopt als een van de meest veelbelovende van deze technologieën. Bioprinting kan worden gezien als een vorm van robotachtige additieve vervaardiging van biologische onderdelen, die kunnen worden gebruikt voor het in patroon levensvatbare orgelachtige of weefselachtige structuren op te bouwen of in 3 dimensies. 1 Meestal bioprinting gebruik van een 3-dimensionaal (3 D) drukinrichting die wordt bestuurd door een computer om cellen en biomaterialen in specifieke posities deponeren, waardoor recapituleren anatomisch lijkende fysiologische architecturen. 2 Deze inrichtingen druk een &quot;bioink&quot;, in de vorm van cel aggregaten nemen cellen ingekapseld in hydrogels of viskeuze vloeistoffen of cel geplaatste microdragers, en celvrije polymeren die mechanische structuur of handeling verschaffen celvrije placeholders. 3,4 Na de bioprinting proces kan de resulterende structuur worden gerijpt in functionele weefsel of orgaan structuren, en worden gebruikt voor het beoogde doel applicatie. 5,6 Tot op heden, een complete volledig functionele human-sized orgel niet is afgedrukt, maar blijft de belangrijkste doelstelling op lange termijn van bioprinting onderzoek en ontwikkeling. 2 echter kleinschalige &quot;organoïde&quot; weefselconstructen momenteel in een aantal toepassingen, waaronder pathologie modellering, geneesmiddelenontwikkeling en toxicologische screening uitgevoerd. Een van de belangrijkste obstakels dat onderzoekers hebben bij de toepassing bioprinting technologie is dat zeer weinig materialen zijn ontwikkeld voor de uitdrukkelijke bedoeling bioprinting. Om effectief te kunnen slagen in bioprinting, moet een biomateriaal voldoen 4 basisvereisten. Het biomateriaal moet 1) de passende mechanische eigenschappen afzetting mogelijk te maken (hetzij extrusie door een spuitmond van een gel of een inkjet als druppel), 2) het vermogen om zijn vorm als een component van een 3-D structuur na depositie houden, 3) de mogelijkheid voor handmatige instelling van de 2 voorgaande kenmerken, en 4) een cel vriendelijke en ondersteunende omgeving helemaal fasen van de bioprinting procedure. 7 Historisch gezien bioprinting werk is vaak geprobeerd om bestaande traditionele biomaterialen in bioprinting apparatuur worden zonder rekening te houden voor de verenigbaarheid ervan, in plaats van het ontwerpen van een biomateriaal om de eigenschappen die noodzakelijk zijn voor bioprinting en de daaropvolgende post-printing toepassingen. Verschillende bioinks zijn recentelijk ontwikkeld om betere interface met de afzetting en fabricage hardware. Standard hydrogel systemen vormen grote problemen, omdat zij over het algemeen bestaan ​​als hetzij voorloper vloeistof oplossingen met onvoldoende mechanische eigenschappen, of polymeriseren hydrogels die als ze worden geprint kunnen sproeiers verstopt raken of worden opengebroken op het extrusieproces. Ons team, evenals others, hebben verschillende hydrogel formuleringen om deze bioprinting problemen aan te pakken, zoals mobiele spheroïde afdrukken in hydrogel substraten, 5,8 cel en hydrogel filament extrusie uit microcapillaire buizen, 9-11 extrudeerbare hyaluronzuur (HA) -gold nanodeeltjes hydrogels met dynamische verknoping eigenschappen onderzocht , 12 temporele controle hydrogel stijfheid gebruik fotopolymeriseerbare gemethacryleerd HA en gelatine, 13 fibrinogeen trombine-gebaseerde verknoping, 14,15 ionenuitwisseling alginaat-collageen gels, 16 en recente snelle polymerisatie ultraviolet licht (UV) geïnitieerde verknoping, 17 Deze voorbeelden tonen de haalbaarheid van het genereren van materialen die effectief kan door bioprinted. Echter, naast integratie met hardware, succesvol genereren levensvatbare en functionele 3-D weefselconstructen moeten biomaterialen biochemische en mechanische signalen bevatten die helpen bij het handhaven cellulairelevensvatbaarheid en functie. Deze andere factoren, biochemische en mechanische profielen kunnen een significante invloed hebben op de succesvolle werking van bioprinted weefselconstructen hebben. Zowel de natieve cellen en extracellulaire matrix (ECM) verantwoordelijk voor het presenteren van een groot aantal signaalmoleculen, zoals groeifactoren en andere cytokines naar andere cellen. De combinatie van deze signalen varieert van weefsel tot weefsel, maar uiterst krachtig en invloedrijk bij het ​​reguleren cellen en weefsels gedrag. 18 Gebruikmakend weefselspecifiek ECM componenten van verschillende organen en uitvoeren als een hydrogel of als onderdeel van een hydrogel is verkend succes. 19-21 Deze benadering, die bestaat uit decellularizing een bepaald weefsel, verpulveren, en te lossen, kan worden gebruikt om weefsel-specifieke biochemische signalen produceren van elk weefsel en 3-D hydrogel constructen kunnen worden opgenomen. 22 DaarnaastHet is uitvoerig gedocumenteerd dat weefsels in het lichaam innemen uiteenlopende stijfheden. 23 Als zodanig is de mogelijkheid om af te stemmen de mechanische eigenschappen van biomaterialen, zoals elasticiteitsmodulus E &#39;of shear elasticiteitsmodulus G&#39;, is een nuttig hulpmiddel weefselmanipulatie . Zoals hierboven beschreven controle bioink mechanische eigenschappen maakt extruderen gebaseerde biofabrication met een zachte gel, die dan verder door secundaire crosslinking kan gemanipuleerd op een later tijdstip, waarop elasticiteitsmodulus niveaus kunnen worden bereikt die overeenkomen met dat van het doelorgaan. Bijvoorbeeld zou biomaterialen worden aangepast om een stijfheid van 5-10 kPa passen als een native lever 23 of pas een stijfheid van 10-15 kPa zoals natief hartweefsel, 24,25 theoretisch verhogen van het vermogen van deze organoids in functioneren op soortgelijke wijze als hun eigen weefsel tegenhangers. De invloed van de stijfheid van het milieu op cel fenotype heeft exp geweestlored afgelopen jaren, met name wat betreft stamcellen. Engler et al. Toonden aan dat substraat elasticiteit geholpen bij het ​​stimuleren mesenchymale stamcellen (MSC) naar lineages met weefsel elasticiteit als dat van het substraat. 25 Dit concept is verder onderzocht differentiatie in spieren, hartfunctie, lever fenotype, hematopoietische stamcel proliferatie en onderhoud van stamcellen therapeutisch potentieel. 24,26-29 Het kunnen afstemmen op een hydrogel verschillende elasticiteitsmoduli is een belangrijk kenmerk van een biomateriaal die wordt gebruikt om weefselconstructen biofabricate. 30 Hier beschrijven we een protocol dat een veelzijdige benadering in ons laboratorium een ​​hydrogel systeem extrusie kan worden bioprinted formuleren voorstelt, en 1 maat) bevatten biochemische profiel van een bepaald type weefsel en 2) bootsen de elastische modulus van deze weefseltype . Door het aanpakken van deze eisen, willen we provide een materiaal dat de fysiochemische en biologische eigenschappen van in vivo kan herhalen weefsel. 31 De modulaire hydrogel samengesteld dat hierin wordt beschreven maakt gebruik van een multi-verknopende benadering extrudeerbaar bioinks geven, en houdt een tweede verknoping te stabiliseren en verhoogt de stijfheid van de eindproducten verschillende weefseltypen passen. Biochemical maatwerk wordt voldaan door met behulp van weefsel-specifieke ECM componenten. Als een demonstratie, in dienst nemen we een lever-specifieke verscheidenheid van deze hydrogel systeem om functionele lever organoïde constructen Bioprint. De beschreven protocol maakt gebruik van een aangepaste 3-D bioprinting apparaat. In het algemeen kan dit protocol worden aangepast aan de meeste extrusie gebaseerde printers, printvereisten parameters variëren sterk voor alle typen inrichtingen en vereisen onderzoek door de gebruiker.

<table><tbody><tr><td>Hyaluronzuur</td><td>Sigma</td><td>53747</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Sigma</td><td>G6144</td><td></td></tr><tr><td>2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiofenon</td><td>Sigma</td><td>410896</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronzuur en gelatine hydrogel kit (HyStem-HP)</td><td>ESI-BIO</td><td>GS315</td><td>Kit bevat de componenten Heprasil (gethioliseerd en heparine gebonden hyaluronzuur), Gelin-S (gethioliseerd gelatine), en Extralink (PEGDA)</td></tr><tr><td>PEG 8-Arm Alkyne, 10&nbsp;kDa</td><td>Creative PEGWorks</td><td>PSB-887</td><td></td></tr><tr><td>Primaire menselijke hepatocyten</td><td>Triangle Research Labs</td><td>HUCPM6</td><td></td></tr><tr><td>Primaire menselijke stellaatcellen</td><td>ScienCell</td><td>5300</td><td></td></tr><tr><td>Primaire menselijke Kupffer-cellen</td><td>Life Technologies</td><td>HUKCCS</td><td></td></tr><tr><td>Hepatocyten basaal medium (HBM)</td><td>Lonza</td><td>CC-3199</td><td></td></tr><tr><td>Hepatocyten media supplement kit</td><td>Lonza</td><td>CC-3198</td><td>HCM SingleQuot Kits (bevat ascorbinezuur, 0,5&nbsp;ml; bovien serum albumine [vetvrij], 10&nbsp;ml; gentamicine sulfaat/amfotericine B, 0,5&nbsp;ml; hydrocortison 21-hemisuccinaat, 0,5&nbsp;ml; insuline, 0,5&nbsp;ml; humaan recombinant epidermaal groeifactor, 0,5&nbsp;ml; transferrine, 0,5&nbsp;ml)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>Andere fabrikanten zijn ok.</td></tr><tr><td>Ammoniumhydroxide</td><td>Fischer Scientific</td><td>A669</td><td>Andere fabrikanten zijn ok.</td></tr><tr><td>Frisse varkenscadaver weefsel</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Lyofiliseerapparaat</td><td>ieder</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Diepvriesmolen</td><td>ieder</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Bioprinter</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>De hier beschreven bioprinter werd op maat gebouwd in eigen huis. Over het algemeen zijn andere apparaten voldoende, op voorwaarde dat ze computergestuurd extrusie-gebaseerd printen van hydrogelmaterialen ondersteunen.</td></tr><tr><td>Hangende druppel celcultuurplaat</td><td>InSphero</td><td>CS-06-001</td><td>InSphero GravityPlus 3D Cultuur Platform</td></tr></tbody></table>

bioprinting cellularized construeert met een tissue-specifieke hydrogel bioink

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting is opgekomen als een veelzijdige biofabricage-benadering voor het creëren van door weefseltechniek gemaakte orgaanconstructies. Deze constructies hebben een potentieel gebruik als orgaanvervangers voor implantatie bij patiënten en ook, wanneer ze op een kleinere schaal worden gecreëerd als model 'organoïden' die kunnen worden gebruikt in in vitro systemen voor het screenen van geneesmiddelen en toxicologie.
Ondanks de ontwikkeling van een breed scala aan bioprinting-apparaten, kan de toepassing van bioprinting-technologie worden beperkt door de beschikbaarheid van materialen die zowel bioprinting-procedures versnellen als cellevensvatbaarheid en -functie ondersteunen door weefselspecifieke signalen te bieden. Hier beschrijven we een veelzijdig hyaluronzuur (HA) en gelatine-gebaseerd hydrogelsysteem dat bestaat uit een multi-crosslinker, 2-stadig crosslinkingprotocol, dat weefselspecifieke biochemische signalen kan bieden en de mechanische eigenschappen van in vivo weefsels kan nabootsen.
Biochemische factoren worden geleverd door het opnemen van weefsel-afgeleide extracellulaire matrixmaterialen, die krachtige groeifactoren bevatten. De mechanische eigenschappen van het weefsel worden geregeld door combinaties van PEG-gebaseerde crosslinkers met variërende molecuulgewichten, geometrieën (lineair of meervoudig) en functionele groepen om extrudeerbare bio-inkten en uiteindelijke constructieschuurstijfheidswaarden over een breed bereik te verkrijgen (100 Pa tot 20 kPa). Met behulp van deze parameters werden hydrogelbio-inkten gebruikt om primaire leverbolletjes in een lever-specifiek bio-inkt te bioprinten om in vitro leverconstructies met hoge cellevensvatbaarheid en meetbare functionele albumine en ureumoutput te creëren. Deze methodologie biedt een algemeen raamwerk dat kan worden aangepast voor toekomstige aanpassing van hydrogels voor biofabricage van een breed scala aan weefselconstructietypen.

Wanneer de bovenbeschreven procedures correct worden gevolgd, hydrogels een biochemisch profiel specifiek het doelweefsel, behelzen, 20 zorgen voor een hoge mate van controle over bioprinting en laatste elasticiteitsmodulus, 34 en steunen functionele levensvatbare cellen in weefselconstructen. hydrogel Customization Om zo goed mogelijk na te bootsen natieve lever, werd de hydrogel ...

We beschrijven een reeks protocollen die samen een weefsel nabootsen hydrogel bioink waarmee functionele en levensvatbare 3-D weefsel constructen kunnen worden bioprinted voor gebruik in in vitro screening toepassingen.

Bioprinting Cellularized Construeert met een tissue-specifieke Hydrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Het algemene doel van dit protocol is om een veelzijdige aanpak te demonstreren voor het ontwerpen van hydrogel-bio-inkten die geëxtrudeerd kunnen worden via bioprintapparatuur. De bio-inkten kunnen vervolgens worden gebruikt om driedimensionale weefselconstructen te vervaardigen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van het bioprinten, zoals het beheersen van de mechanische eigenschappen die nodig zijn om een materiaal te leveren dat met een bioprinter geëxtrudeerd kan worden.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we commercieel beschikbare componenten op modulaire wijze combineren om een eenvoudige en effectieve bioprintbare hydrogel-bio-inkt te creëren. De toepassingen van deze technologieën omvatten de creatie van 3D-weefselorganoïden die kunnen worden gebruikt om de effecten van geneesmiddelen, toxines en ziekten nauwkeurig te modelleren. Hoewel deze methode een raamwerk kan bieden voor het bioprinten van 3D-leverconstructen, kan ze ook worden toegepast op andere weefseltypen, zoals spier-, long- en colonweefsel.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben omdat er een aantal verschillende reagentia worden gebruikt om de hydrogel-bio-inkt te maken, maar het is eigenlijk vrij eenvoudig. De procedure zal worden gedemonstreerd door Young-Joon Seol, een postdoc in ons team. Begin met het bereiden van een weefselspecifiek extracellulair matrix-digestaat om te gebruiken in de hydrogelformulering, zoals elders beschreven.Los vervolgens een foto-initiator op in water met een gewicht-volumeratio van 0,1%. Om de hydrogel-bio-inkten te vormen, lost u eerst de basiscomponenten van de hyaluronzuur-hydrogelkits op in afzonderlijke aliquots van de waterige foto-initiatoroplossing. Combineer daarna de ECM-oplossing, het 2% getholeerde hyaluronzuur, de 2% getholeerde gelatine, de crosslinkers en hepatocyten-kweekmedium in de hier getoonde ratio's. Om de extrusie-eigenschappen van de bio-inkt te verbeteren, voegt u 1,5 mg/mL ongemodificeerd hyaluronzuur en 30 mg/mL gelatine toe aan het mengsel.Vortex vervolgens het resulterende mengsel tien seconden lang op een hoge snelheid vóór gebruik. Voordat de bio-inkt in een bioprintapparaat wordt getest, moeten de extrusiekarakteristieken eerst op de laboratoriumbank worden getest. Druppel met een standaardspuit een monster van de bio-inkt en bevestig vervolgens een naald met maat 20 tot 30 aan de spuit.Laat de bio-ink crosslinken en druk de bio-ink vervolgens door de naald om gladde, geëxtrudeerde hydrogel-filamenten te verkrijgen. Als de formulering in staat is om een filament met weinig of geen bobbels te creëren, is deze klaar voor bioprinten. Om de bio-inkpreparaten in een bioprinter te laden, pipetteert u de bio-inks in gesteriliseerde printercartridges.Laat ze 30 minuten staan voor extrusie, aangezien de bio-inkt in de cartridge een spontane eerste fase van crosslinking zal ondergaan. Plaats vervolgens de cartridge in de printopstelling en sluit een pneumatische drukbron aan op de cartridge. Bereid een eenvoudig patroon voor, zoals dit raster van 7 bij 7 millimeter met parallelle lijnen, om te printen en zo de extrusiecompatibiliteit te evalueren.Terwijl de printkop zich in het XY-vlak verplaatst met een snelheid van ongeveer 300 millimeters per minuut, wordt er een druk van 20 kilopascals op de cartridge uitgeoefend om de bio-inkt te extruderen. Als de geëxtrudeerde materialen klonterig of onregelmatig zijn, dient de hoeveelheid toegevoegd crosslinker te worden verminderd om het materiaal uit de eerste fase van crosslinking te verzachten. Een correct bereide bio-inktformulering moet soepel extruderen, wat een nauwkeurige depositie en architectuur mogelijk maakt.Bereid 3D primaire levercelsferoïden voor in een 96-wells plaat met de hanging drop-methode, zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Verzamel na drie dagen kweek de leversferoïden uit de hanging drop-plaat met een pipet en breng deze over naar een steriele, conische buis van 15 milliliter. Laat de sferoïden één tot twee minuten bezinken naar de bodem van de conische buis.Aspire vervolgens voorzichtig het medium met een pipet. Breng 110 tot 125 procent van het gewenste geprinte volume van het 3D-construct van de vers bereide hydrogel bioink-oplossing over naar de conische buis met de sferoïden. Pipetteer daarna de sferoïden voorzichtig op en neer om ze opnieuw te suspenderen in de hydrogel bioink-oplossing.Zodra de suspensie homogeen is, wordt de sferoïdenoplossing met een pipet overgebracht naar een bioprintercartridge en krijgt de oplossing 30 minuten de tijd voor de eerste crosslinking-fase. Na deze crosslinking-fase wordt een bioprintapparaat gebruikt om de gewenste hydrogelstructuren te creëren waarin de primaire leversferoïden zijn ingebed. Na elke depositielaag wordt de geprinte bio-inkt gedurende twee tot vier seconden blootgesteld aan UV-licht om het secundaire crosslinking-mechanisme te initiëren.Dit zal de constructen stabiliseren en de stijfheid verhogen tot het gewenste niveau. De concentratie van PEG-alkyn in de oplossing bepaalt de totale crosslink-dichtheid en controleert daarmee primair de stijfheid van het uiteindelijke construct. Na het bioprinten werd met behulp van confocale microscopie een hoge celviabiliteit in de leverconstructen waargenomen.Onder optimale omgevingsomstandigheden moet de levensvatbaarheid boven de 85% liggen. Daarnaast werd, wanneer de constructen werden gekleurd voor markers die indicatief zijn voor leverweefsel, een positieve expressie waargenomen van CYP3A4, een cytochroom P450-isovorm, intracellulair albumine, E-cadherine, een epitheliaal cel-cel adhesie-eiwit, en DPP4, een eiwit dat sterk tot expressie komt in de lever. Wanneer het kweekmedium werd getest op de spiegels van ureum en albumine, bleek dat het construct zowel ureum als albumine secreteerde op constante niveaus gedurende de tijdlijn van 14 dagen. Dit suggereert verder dat de weefselspecifieke hydrogel-bio-inkten helpen bij het behouden van de functie van de levercellen.Zodra deze techniek beheerst is, kan deze, mits correct uitgevoerd, in ongeveer twee uur van begin tot eind worden voltooid. Dit is echter vaak afhankelijk van het specifieke bioprintapparaat dat wordt gebruikt. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de gedemonstreerde stappen vaak moeten worden aangepast om compatibel te zijn met andere weefseltypen of bioprintapparaten.Door deze procedure te volgen, kunnen andere hydrogel-bioinkformuleringen worden gemaakt om het bioprinten van andere weefseltypen te ondersteunen. De ontwikkeling van deze technologieën heeft geholpen bij het banen van de weg voor de creatie van multi-organoïde body-on-a-chip-platforms voor het screenen van geneesmiddelen en het modelleren van ziekten. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u kunt beginnen met het ontwerpen van materialen die kunnen worden gebruikt voor het bioprinten van 3D-weefselconstructen door middel van meerstaps-crosslinking.Vergeet niet dat werken met ultraviolet licht uiterst gevaarlijk kan zijn voor het gezichtsvermogen, en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het gebruik van een UV-beschermende bril, altijd moeten worden getroffen tijdens het uitvoeren van deze procedure.

bioprinting-cellularized-constructs-using-tissue-specific-hydrogel

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Een bioprinter werd gebruikt om gevormde hydrogelen gebaseerd op een offer mal maken. De poloxamer mal werd opgevuld met een tweede hydrogel en vervolgens geëlueerd, waardoor holtes die gevuld waren met een derde hydrogel. Deze methode maakt gebruik van snelle elutie en goede bedrukbaarheid van poloxameer om complexe architecturen uit biopolymeren genereren.

Afdrukken warmteresponsieve Reverse Mallen voor de schepping van Patterned Hydrogelen Twee-component voor 3D Cell Culture

Een Cartesische bioprinter werd ontworpen en gemaakt om multi-materiaal depositie in nauwkeurige, reproduceerbare geometrieën mogelijk te maken, terwijl ook controle van omgevingsfactoren wordt toegestaan. Met behulp van de driedimensionale bioprinter kunnen complexe en levensvatbare constructies worden afgedrukt en gemakkelijk worden gereproduceerd.

Levensvatbaarheid van Bioprinted Cellular constructen met behulp van een drie Dispenser cartesiaanse Printer

Dit protocol beschrijft een bioprinting-methodologie met behulp van een geautomatiseerd robotsysteem voor het afzetten dat geëtste topografische geleidingssignalen combineert met de nauwkeurige afzetting van een hydrogel bio-inkt dat cellen bevat. De gedrukte cellen worden direct afgeleverd bij de geëtste kenmerken en kunnen deze waarnemen en er zich op oriënteren.

Geautomatiseerde Robotic Dispensing Techniek voor Surface Oriëntatie- en Bioprinting van Cellen

Wij bieden een veralgemeende protocol gebaseerd op een strategie van de bioprinting microfluidic voor een vezelige vasculaire bed, waar een secundaire celtype verder zou kunnen worden uitgezaaid in de interstitiële ruimte van deze vezelige structuur voor het genereren van gevacuoliseerd weefsels en organoids engineering.

Microfluidic Bioprinting voor Engineering gevacuoliseerd weefsels en Organoids

Kraakbeen en huid-analogen waren bioprinted met behulp van een nanocellulose-alginaat gebaseerd bioink. De bioinks waren cellularized voorafgaand aan het afdrukken via een enkele stap passieve mengen eenheid. De constructies werden gedemonstreerd worden uniforme cellularized, hebben hoge levensvatbaarheid en gunstige markers van differentiatie vertonen.

Bioprinting van kraakbeen en huid weefsel analogen met behulp van een roman passief mengen eenheid techniek voor Bioink Precellularization

Wij ontwikkeld een heterogene borst kanker model bestaande uit vereeuwigd tumor en fibroblast cellen ingebed in een bioprintable alginaat/gelatine bioink. Het model recapituleert de tumor in vivo communicatie en vergemakkelijkt de vorming van meercellige tumor spheroïden, inzicht in de mechanismen van tumorvorming rijden oplevert.

Bioprintable alginaat/gelatine Hydrogel 3D In Vitro modelsystemen induceren sferoïde celvorming

Hier gepresenteerd is een methode voor de 3D bioprinten van gelatine methacryloyl.

Protocollen van 3D Bioprinting van gelatine Methacryloyl hydrogel gebaseerde Bioinks

Hier ontwikkelden we een nieuwe meerlaagse gemodificeerde strategie voor vloeibare bioinks (gelatine methacryloyl met lage viscositeit) om de sedimentatie van ingekapselde cellen te voorkomen.

Met behulp van meerlaagse Hydrogel Bioink in driedimensionale bioprinting voor homogene celdistributie

Dit protocol benadrukt een methode om snel de biocompatibiliteit van een kristallijne nanocellulose (CNC) / agarose composiet hydrogel biomateriaal inkt met muis beenmerg-afgeleide mestcellen te beoordelen in termen van cel levensvatbaarheid en fenotypische expressie van de celoppervlak receptoren, Kit (CD117) en hoge affiniteit IgE receptor (FcεRI).

Fabricage van een kristallijne nanocellulose ingebedde agarose biomateriaal inkt voor beenmerg-afgeleide mestcelkweek

Dit protocol beschrijft een 3D-printtechniek om botachtige structuren te fabriceren door een calciumfosfaatinkt af te zetten in een op gelatine gebaseerde korrelige ondersteuning. Geprinte botanalogen worden in vrije vorm afgezet, met flexibiliteit voor het direct oogsten van de afdruk of crosslinking binnen een levende celmatrix voor multifasische constructies.

Keramische omnidirectionele bioprinting in celbeladen suspensies voor het genereren van botanalogen

Leer een veelzijdige methode voor het ontwerpen van hydrogel bioinks voor bioprinting. Deze techniek maakt 3D-weefselconstructies met modulaire componenten voor onderzoek naar geneesmiddelen en ziektes.

Bioprinting Cellularized Construeert met een tissue-specifieke Hydrogel Bioink

Meer video's verkennen