Bioprinting Cellularized Construeert met een tissue-specifieke Hydrogel Bioink

Het algemene doel van dit protocol is om een veelzijdige benadering te demonstreren voor het ontwerpen van hydrogel bioinks die kunnen worden geëxtrudeerd door bioprinting apparaten. De bioinks kunnen vervolgens worden gebruikt om driedimensionale weefselconstructen te fabriceren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken in het bioprinting veld, zoals hoe de mechanische eigenschappen te beheersen die nodig zijn om een materiaal te kunnen extruderen met behulp van een bioprinter.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we commercieel verkrijgbare componenten combineren op een modulaire manier om een eenvoudige en effectieve bioprintable hydrogel bioink te creëren. De toepassingen van deze technologieën omvatten de creatie van 3D weefsel organoïden die kunnen worden gebruikt om de effecten van geneesmiddelen, toxines en ziekten nauwkeurig te modelleren. Hoewel deze methode een raamwerk kan bieden om 3D leverconstructen te bioprinten, kan deze ook worden toegepast op andere weefseltypen zoals spier, long en colon.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze methode worstelen omdat er een aantal verschillende reagentia worden gebruikt om de hydrogel bioink te maken, maar het is eigenlijk vrij eenvoudig. Het demonstreren van de procedure zal worden gedaan door Young-Joon Seol, een post-doc in ons team. Om te beginnen, bereid een weefselspecifiek extracellulair matrix digest voor om te worden gebruikt in de hydrogel formule zoals elders beschreven.

Los vervolgens een foto-initiator op in water met een gewicht per volume verhouding van 0,1%. Om de hydrogel bioinks te vormen, lost u eerst de basismaterialen uit de hyaluronzuur hydrogel kits op in individuele aliquoten van de water foto-initiator oplossing. Combineer vervolgens de ECM oplossing, de 2% thiolated hyaluronzuur, de 2% thiolated gelatine, de crosslinkers en hepatocyten kweekmedium in de hier getoonde verhoudingen. Om de extrusie-eigenschappen van de bioink te verbeteren, voegt u 1,5 milligram per milliliter ongemodificeerde hyaluronzuur en 30 milligram per milliliter gelatine toe aan het mengsel.

Vortex vervolgens het resulterende mengsel gedurende tien seconden op hoog niveau voor gebruik. Test eerst de extrusiekenmerken op de laboratoriumbank voordat u de bioink in een bioprinting apparaat test. Gebruik een standaard spuit, laat een monster van de bioink druppelen en bevestig vervolgens een naald met een diameter van 20 tot 30 gauge aan de spuit.

Laat de bioink crosslinken en duw vervolgens de bioink door de naald om glad geëxtrudeerd hydrogel filamenten te bereiken. Als de formulering in staat is om een filament met weinig of geen hobbels te maken, dan is het klaar voor bioprinting. Om de bioink voorbereidingen in een bioprinter te laden, pipet de bioinks in gesteriliseerde printer cartridges.

Laat ze 30 minuten staan voordat u extrudeert, omdat de bioink spontane fase een crosslinking zal ondergaan in de cartridge. Laad vervolgens de cartridge in de print setup en sluit een pneumatische drukbron aan op de cartridge. Bereid een eenvoudig patroon voor, zoals dit zeven bij zeven millimeter raster van evenwijdige lijnen, om te printen om de extrusiecompatibiliteit te evalueren.

Terwijl de printkop zich in het XY-vlak beweegt met een snelheid van ongeveer 300 millimeter per minuut, brengt u een druk van 20 kilopascals aan op de cartridge om de bioink te extruderen. Als de geëxtrudeerd materiaal klonterig of onregelmatig is, verminder dan de hoeveelheid van de crosslinker die is toegevoegd om het materiaal van fase één crosslinking te verzachten. Een goed voorbereide bioink formulering zou glad moeten extruderen, wat een nauwkeurige depositie en architectuur mogelijk maakt.

Bereid 3D primaire cel lever sferoïden voor in een 96 wel plate met behulp van de hanging drop methode zoals beschreven in de bijbehorende tekstprotocol. Na drie dagen in cultuur, verzamel de lever sferoïden van de hanging drop plate met behulp van een pipette en breng ze over in een steriele, 15 milliliter conische buis. Laat de sferoïden een tot twee minuten naar de bodem van de conische buis zakken.

Aspibeer vervolgens voorzichtig het medium met een pipette. Breng 110 tot 125 procent van het gewenste geprinte 3D construct volume van de vers bereide hydrogel bioink oplossing over naar de conische buis met de sferoïden. Pipet vervolgens de sferoïden voorzichtig omhoog en omlaag om ze opnieuw te suspenderen in de hydrogel bioink oplossing.

Eenmaal gelijkmatig gesuspendeerd, breng de sferoïdoplossing over naar een bioprinter cartridge met behulp van een pipette en laat de oplossing de eerste crosslinking fase gedurende 30 minuten ondergaan. Na fase één crosslinking, gebruik een bioprinting apparaat om de gewenste hydrogel structuren te creëren die de primaire lever sferoïden bevatten. Na elke laag depositie, stelt u de geprinte bioink bloot aan UV licht gedurende twee tot vier seconden om het secundaire crosslinking mechanisme te initiëren.

Dit zal de constructen stabiliseren en de stijfheid verhogen tot het gewenste niveau. De concentratie van PEG alkyn in de oplossing is wat de algehele crosslinking dichtheid regelt, en dus voornamelijk de stijfheid van de uiteindelijke construct regelt. Na bioprinting, werd hoge cellevensvatbaarheid in de lever constructen waargenomen met behulp van confocale microscopie.

Onder optimale omgevingsomstandigheden zou de levensvatbaarheid boven de 85% moeten zijn. Bovendien, toen de constructen werden gekleurd voor markers die indicatief zijn voor leverweefsel, werden positieve expressie van CYP3A4, een cytochroom P450 isovorm, intracellulair albumine, E-cadherine, een epitheelcel-cel adhesie eiwit, en DPP4, een eiwit dat hoog wordt uitgedrukt in de lever, allemaal waargenomen. Toen het kweekmedium werd getest op niveaus van ureum en albumine, werd gevonden dat de construct zowel ureum als albumine secreteerde op constante niveaus gedurende de 14 dagen tijdsverloop. Dit suggereert verder dat de weefselspecifieke hydrogel bioinks helpen bij het behouden van de functie van de levercellen.

Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in ongeveer twee uur van begin tot eind worden gedaan als het correct wordt uitgevoerd. Dit is echter vaak afhankelijk van het specifieke bioprinting apparaat dat wordt gebruikt. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de getoonde stappen vaak moeten worden a