Verkalking van vasculaire gladde spiercellen en Imaging van Aorta verkalking en Ontsteking

Het algemene doel van deze procedure is om aortale vasculaire calcificatie ex vivo te visualiseren en om in vivo vasculaire calcificatie te modelleren met behulp van gekweekte primaire muizen-aortale gladde spiercellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de biologie van vaatziekten door een in vitro model te bieden om de moleculaire mechanismen van vasculaire calcificatie te bestuderen en door de beoordeling van vasculaire calcificatie en macrofaaginflammatie in vivo mogelijk te maken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de gevoelige kwantificering en co-lokalisatie van macrofaagactiviteit met calciumafzettingen in atherosclerotische laesies mogelijk maakt, zelfs in vroege stadia van de ziekte.

Robert Tainsh, een technicus in ons laboratorium, zal deze procedure samen met Caitlin en mij demonstreren. Om te beginnen met deze procedure, desinfecteert u de staart met een alcoholswab en lokaliseert u de staartvenen lateraal. Oefen vervolgens een lichte druk voorwaarts uit op de spuit terwijl een naald van 30 gauge zonder weerstand in de staart wordt ingebracht.

Inject vervolgens 100 µL calcium NIR en/of 100 µL cathepsine NIR met een constant tempo. Trek de naald na vijf seconden terug en oogst de aorta's drie tot 24 uur na injectie. Verwijder onder een dissectiemicroscoop het peritoneum om de abdominale organen bloot te leggen.

Verwijder vervolgens de gastro-intestinale organen, waarbij u er goed op let de aorta niet door te snijden. Maak daarna een laterale incisie in het anterieure diafragma en zet de incisie door over de buikholte. Bevrijd de ribbenkast met een dissectieschaar door door de zijkanten van de ribben te snijden en het zachte weefsel te verwijderen dat aan het superieure gedeelte van het sternum kleeft.

Verwijder vervolgens de borstkas om de longen bloot te leggen. Verwijder de longen voorzichtig. Verwijder daarna met zorg de trachea en de slokdarm, waarbij u ervoor zorgt dat de aorta intact blijft.

Verwijder vervolgens het zachte weefsel rondom de aorta van de iliacabifurcatie tot aan de aortaboog. Wees voorzichtig bij het verwijderen van het peri-aortale vet. Verwijder daarna het resterende vet en zachte weefsel rondom de thoracische aorta en de grote aftakkingen van de aortaboog.

Verwijder vervolgens de thymus. Verwijder nu het hart uit de borstholte door het voorzichtig los te maken van de proximale aorta. Transecteer daarna de distale aorta bij de iliacaalvertakking.

Inject met een insuliennaald normale zoutoplossing in de aorta, vanaf de aortaboog, om de resterende bloedcellen uit te spoelen. Scheid de aorta samen met de vaten van de aortaboog los en verwijder deze volledig uit het lichaam. Plaats de aorta in een normale zoutoplossing op ijs tot het moment van beeldvorming.

Plaats in deze stap de aorta's in koud HBSS tot de dissecties zijn voltooid. Draag de aorta's in een steriele weefselkweekkap over naar de aortaverteringsoplossing in de 35 X 10 millimeter weefselkweekschalen. Incubeer ze vervolgens 30 minuten bij 37 graden Celsius met voorzichtig periodiek schudden.

Na de digestie zouden de aorta's een uitgerekt of gerafeld uiterlijk moeten vertonen. Verwijder onder een dissectiemicroscoop de buitenste adventitiale laag van een aorta, terwijl de mediale laag intact blijft. Pel hiervoor de buitenste laag van de aorta aan één uiteinde af en verwijder deze van de onderliggende mediale laag, vergelijkbaar met het uittrekken van een sok.

Zodra de adventitiellaag is verwijderd, wordt de resterende aorta twee tot vier uur geïncubeerd in een nieuwe kweekschaal met celkweekmedium bij 37 °C. Snijd de aorta vervolgens in ringen van één tot twee millimeter breed. Breng de ringen over naar een nieuwe weefselkweekschaal met aortaverteringsoplossing en incubeer deze 120 minuten bij 37 °C met voorzichtig periodiek schudden.

Pipette tijdens de incubatie de oplossing meerdere keren op en neer om de cellen opnieuw te suspenderen. Voeg vervolgens vijf milliliter warme celkweekmedium toe aan de digestiesolutie en breng deze over naar een conische buis van 15 milliliter. Centrifugeer de buis gedurende vijf minuten bij 200 G. Aspireer daarna het medium en suspendeer de cellen opnieuw in het gewenste volume celkweekmedium.

Om calcificatie in vasculaire gladde spiercellen te induceren, worden de cellen overgebracht naar de zes-wells cultuurplaat en krijgen ze de tijd om te hechten. Voed de cellen vervolgens opnieuw met calcificatiemedium. Incubeer de cellen gedurende ten minste zeven dagen bij 37 °C.

Zuig daarna het medium uit de kweekplaat. Was de cellen één keer met geïoniseerd water. Fixeer de cellen door ze gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in één milliliter 10% formaline te plaatsen.

Verwijder vervolgens het formaline en was de gefixeerde cellen gedurende vijf minuten met gedestilleerd water. Incubeer de cellen daarna in één milliliter van een 5% zilvernitraatoplossing onder een lamp van 60 tot 100 watt gedurende één tot twee uur. Aspireer vervolgens de zilvernitraatoplossing en was gedurende vijf minuten met gedestilleerd water.

Verwijder na vijf minuten het ongereageerde zilver door de cellen vijf minuten lang in één milliliter 5% natriumthiosulfaatoplossing in gedestilleerd water te plaatsen. Spoel de cellen vervolgens vijf minuten lang met gedestilleerd water. De met von Kossa gekleurde cellen zijn nu klaar voor beeldvorming met standaard omgekeerde lichtmicroscopie.

In deze figuur werden wildtype MGP-knockoutmuizen en LDLR-knockoutmuizen via een staartvene-injectie geïnjecteerd met calcium-NIR en Cathepsine-NIR; de aorta's werden 24 uur later geoogst en beoordeeld met NIR-fluorescentie-imaging. Wildtype muizen vertonen vrijwel geen aortacalcinatie of aanwezigheid van macrofagen. De aorta's van LDLR-knockoutmuizen vertonen uitgebreide calcinatie die colocaliseert met de accumulatie van macrofagen.

In tegenstelling hiermee vertonen MGP-knockoutmuizen aortacalcinatie die optreedt in afwezigheid van macrofaaginfiltratie. In dit experiment werden gekweekte aortale VSMC's geïsoleerd van MGP-knockoutmuizen en geïnfecteerd met een adenovirus dat GFP of MGP tot expressie brengt. Aortale VSMC's geïsoleerd van wild-type muizen werden getransfecteerd met ofwel controle-scrambled siRNA of siRNA gericht tegen MGP.

Cellen werden gedurende zeven dagen gekweekt in calcificatiemedium A en vervolgens gefixeerd en gekleurd met von Kossa. De calciumkleuring werd gekwantificeerd met ImageJ-software na aftrek van de achtergrond. Na de ontwikkeling hebben deze technieken wetenschappers in staat gesteld om atherosclerose en vasculaire calcificatie ex vivo te visualiseren.

En om vasculaire calcificatie in vitro te modelleren. Dit opent de mogelijkheid om de effecten van nieuwe geneesmiddelen bij de behandeling van vasculaire aandoeningen te testen. Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht in hoe u aorta's isoleert voor primaire murine aortale vasculaire gladde spiercellen, atherosclerotische plaques visualiseert met behulp van nabij-infrarood fluorescentie-beeldvormingssondes en gecalcificeerde vasculaire gladde spieren in vitro visualiseert.