Triggering Cell Stress en Dood met behulp van conventionele uv laser confocale microscopie
February 3rd, 2017
Gegevensmanipulaties om gerichte stress of dood in individuele cellen te veroorzaken, zijn relatief moeilijk te bereiken. Hier wordt een ablatie-aanpak met een resolutie van één cel beschreven om selectief stress te veroorzaken en individuele cellen in celkweek en levende dieren te doden, gebaseerd op een standaard confocale UV-laser.
Het algemene doel van deze celablatie-aanpak is om selectief stress of individuele cellen in celkweek of in levende dieren te doden. Deze methode stelt onderzoekers in staat om het lot van een enkele stervende cel en de reactie van cellen, zoals microglia en astrocyten op de omringende ablatieplaats te bestuderen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het nauwkeurige targeten van individuele cellen, en dat dit kan worden bereikt met een reguliere confocale microscoop die is uitgerust met een 405 nanometer laser.
We gebruiken zebravis als modelsysteem om neurodegeneratieve ziekten zoals Motoneuron Ziekte of Frontotemporale Dementie te bestuderen. Het visualiseren van de dood van een motoneuron en de daaropvolgende gevolgen biedt een uitstekende gelegenheid om de dynamische processen die bij de ziekte betrokken zijn, beter te begrijpen. Onze aanpak om cellulaire stress op dosisafhankelijke wijze toe te brengen, maakt een gedetailleerde karakterisering van cellulaire interacties mogelijk.
Bijvoorbeeld, microglia klaring na neuronale dood. Hoewel deze methode inzicht biedt in de ziektemechanismen van een levend organisme, kan deze ook op vergelijkbare wijze worden toegepast op geïsoleerde cellen in cultuur. Na het opzetten van mannelijke en vrouwelijke transgene lijnen voor paring volgens het tekstprotocol, gebruik een plastic theezeef om embryo's te verzamelen na succesvolle paai door het tankwater te zeuven.
Gebruik vervolgens eierwater om de eieren te spoelen en breng ze over in eierwater in een petrischaal. Onderzoek de embryo's onder een lichtmicroscoop om de bevruchting te bepalen. Bewaar vervolgens bevruchte eieren bij 28 graden Celsius.
Wanneer de embryo's twee tot vijf dagen na bevruchting of DPF bereiken, plaats ze dan onder een fluorescentiecompoundmicroscoop en screen de embryo's op geschikte fluorofoorexpressie. Scheid vervolgens fel gelabelde vissen in een verse schaal met eierwater voor later inbedding. Om zebravissen in agarose in te bedden, bereid een anesthesieoplossing voor door vier gram per liter MS 222 druppelsgewijs toe te voegen aan een petrischaal met eierwater.
Bereid een voorraad laag smeltende agarose en eierwater voor en verdeel deze in 1,5 milliliter microcentrifugebuizen. Plaats een aliquot in een warmteblok op 38 tot 40 graden Celsius en laat het gelijkmatig verdelen. Voor beeldvormingstijden van langer dan vier uur, pipet ongeveer 300 microliter agarose langs de binnenkant van een glasbodemschaal om een donutvormige cirkel met een kleine opening in het midden voor te bereiden.
Om de zebravis in agarose voor microscopie te monteren, gebruikt u na het anesthetiseren van de vis volgens het tekstprotocol een verstelbare pipet om een larve op te trekken en deze naar de bodem van de punt te laten zinken. Laat de larve in een minimale hoeveelheid vloeistof ingeprente agarose vallen. Trek vervolgens de vis met agarose op en giet deze snel in een eerder voorbereide, glazen bodem 35 millimeter schaal.
Gebruik onder een dissectiemicroscoop een standaard kwastje om het dier of meerdere dieren binnen de agarose op hun zij te plaatsen zodat het lichaam en de staart plat liggen. Laat de ingebedde vissen 10 tot 15 minuten zitten totdat de agarose stevig is. Gebruik vervolgens ongeveer twee milliliter eierwater met tricaine om de 35 millimeter petrischaal voorzichtig op te vullen.
Plaats de petrischaal met een ingebedde larve op de confocale microscoopstandaard en focus, met behulp van helder veldverlichting en 40x vergroting, op de dorsale zijde van het ruggenmerg van het dier. Schakel over naar een geschikte fluorescentie-instelling en visualiseer de structuur van belang om te bevestigen dat alle beeldvormingsparameters zoals nodig zijn voor de volgende ablatie zijn ingesteld. Om de dikte van de structuur voor UV laser ablatie te bepalen, gebruik de Z-aandrijving om de boven- en onderkant van de structuur van belang te verifiëren door handmatig omhoog en omlaag te focussen.
Noteer handmatig het Z-vlak dat zal worden afgebroken. Bijvoorbeeld, het centrum van de cel. Om laser ablatie uit te voeren, start de FRAP Wizard door op het vervolgkeuzemenu bovenaan het softwaremenu te klikken.
Bepaal in het nieuwe venster de beeldparameters voor de ablatieaanpak door het formaat, de scansnelheid en de gemiddelde waarde te selecteren. Als het Z-vlak voor ablatie nog niet is geselecteerd, druk op de Live knop en focus door het monster totdat de fluorescente structuur of het gewenste Z-vlak dat zal worden afgebroken scherp staat. Zodra de algemene beeldparameters zijn ingesteld, gaat u naar de Bleach stap om de specifieke ablatiecomponenten te bepalen.
Activeer vervolgens de 405 nanometer laser door deze te activeren voor de blekingsprocedure. Gebruik vervolgens de Optie Inzoomen om de blekingsintensiteit bij het geselecteerde ROI te maximaliseren door het scanveld te verkleinen, waardoor de verblijftijd maximaal is. Selecteer een of meerdere ROI's voor de ablatie door een van de tekenhulpmiddelen in het Image Acquisition venster te gebruiken.
Richt het axon heuveltje, bijvoorbeeld, met het cirkelvormige tekenhulpmiddel van ongeveer vier tot acht micrometer. Nadat de ROI is vastgesteld, selecteert u de Time Course knop en bevestigt u het aantal cycli dat de ROI's zullen worden gescand en afgebroken. Kies de Pre-Bleach en Post-Bleach frames naar wens om een overzicht van het hele beeld te geven net voor en direct na het blekingsproces.
Deze instellingen bieden onderzoekers meerdere lagen verfijning. Door het aanpassen van de laservermogen, scansnelheid, lijngemiddelde, grootte van het gebied van belang en herhalingen, biedt deze techniek een hoge mate van vrijheid om stress of dood in individuele cellen te veroorzaken. Nadat alle noodzakelijke ablatieparameters zijn vastgesteld, drukt u op Run Experiment en bewaakt u de efficiëntie van de ablatie.
Verwijs naar het tekstprotocol voor aanvullende details. In dit experiment werd UV laser ablatie uitgevoerd op GFP-expresserende motoneuronen in het ruggenmerg van transgene zebravissen. GFP-expressie aangedreven door motoneuron promotors zoals 3 MINX een, IO een of MET, maakt hoge resolutie visualisatie van de cel
Overzicht
Dit artikel beschrijft een nieuwe ablatietechniek met single-cell resolutie die onderzoekers in staat stelt om selectief stress of dood van individuele cellen in celcultuur en levende dieren te induceren. Met behulp van een standaard confocale UV-laser, biedt deze methode inzichten in cellulaire reacties en interacties na gerichte celdood.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Neurodegeneratieve Ziekte Onderzoek
Achtergrond
- Gerichte manipulatie van individuele cellen is een uitdaging geweest.
- Het begrijpen van cellulaire reacties op stress is cruciaal bij neurodegeneratieve ziekten.
- Microglia en astrocyten spelen een belangrijke rol in de reactie op neuronale dood.
- Zebravissen dienen als een effectief model voor het bestuderen van deze processen.
Doel van Studie
- Om een nauwkeurige methode te ontwikkelen voor het induceren van stress of dood in individuele cellen.
- Om het lot van stervende cellen en de omliggende cellulaire reacties te bestuderen.
- Om de begrip van mechanismen van neurodegeneratieve ziekten te verbeteren.
Gebruikte Methoden
- Gebruik van een confocale microscoop uitgerust met een 405 nm laser voor ablatie.
- Toepassing van een dosisafhankelijke benadering om cellulaire stress te veroorzaken.
- Inbedding van zebravislarven in agarose voor beeldvorming en ablatie.
- Monitoring van cellulaire reacties na ablatie met behulp van fluorescentiemicroscopie.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle ablatie van motorneuronen in transgene zebravissen.
- Onmiddellijke fluorescentie-vervaging na ablatie duidt op effectieve targeting.
- Karakterisering van microgliaal opruiming na neuronale dood.
- Inzichten in dynamische processen betrokken bij neurodegeneratieve ziekten.
Conclusies
- De ontwikkelde techniek staat hoge precisie toe bij het bestuderen van individuele cellulaire reacties.
- Deze methode kan worden toegepast in zowel in vivo als in vitro omgevingen.
- Verder onderzoek kan deze benadering gebruiken om ziektemechanismen te onderzoeken.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
This method enables precise, dose-dependent single-cell ablation using standard confocal microscopy, offering a scalable approach to study cellular stress responses and intercellular signaling in neurodegenerative disease models. By allowing real-time visualization of microglial and astrocytic reactions to targeted neuronal injury, it supports mechanistic de-risking in early target validation and phenotypic screening workflows. The technique enhances predictive confidence in lead identification by providing quantitative, reproducible readouts of cell death kinetics and glial activation in physiologically relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through controlled induction of cellular stress in individual neurons within intact tissue.
- Operational Value: Provides a reproducible platform for functional target validation using dose- and time-dependent ablation parameters.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by linking single-cell death outcomes to downstream glial responses relevant to neuroinflammatory pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, fluorescence-based readouts of axonal degeneration and cellular fragmentation for assay standardization.
- Operational Value: Facilitates high-content screening readiness through adjustable laser parameters (power, scan speed, ROI size) for consistent stress induction.
- Scalability: Enables platform reuse across cell culture and in vivo zebrafish models without requiring specialized equipment beyond a 405-nm laser-equipped confocal system.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase single-cell ablation observations to preclinical validation of neurodegenerative mechanisms in zebrafish.
- Biomarker Alignment: Supports evaluation of microglial activation and axonal degeneration as translatable biomarkers of neuronal injury.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables mechanistic de-risking by characterizing dose-dependent cell death phenotypes and surrounding cellular responses prior to compound testing.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis-driven ablation studies that inform target confidence and pathway clarification before lead optimization.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking through precise, reproducible induction of cellular stress to clarify death pathways and glial activation dynamics.
- Screening: Delivers quantitative, time-resolved outputs (e.g., fluorescence loss, blebbing, axonal degeneration) suitable for automated image-based analysis in compound screening.
- Analytics: Provides dose-response and time-course data that allow statistical comparison of ablation conditions and cellular responses across experimental groups.
- Translational Research: Maintains continuity from single-cell injury in zebrafish to phenotypic models of neurodegenerative disease, supporting biomarker-aligned target validation.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability across neuroscience discovery teams, adaptable to various cell types and disease models using standard confocal infrastructure.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in cell-specific death mechanisms and glial responses.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through laser parameter control and compatibility with conventional confocal microscopes.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by enabling early assessment of target engagement via phenotypic readouts of neuronal death and neuroinflammation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by generating mechanistic data on dose-dependent cell death and downstream cellular interactions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy, zebrafish handling, and fluorescence-based ablation parameter optimization.
- Dependent on access to a confocal microscope equipped with a 405-nm laser and appropriate filter sets for UV excitation and emission detection.
- Necessitates standardization of laser power, scan speed, ROI size, and repetition counts across users and sessions for reproducible ablation outcomes.
- Requires adaptation of embedding and imaging protocols when applying the method to different model systems (e.g., cell culture vs. intact organisms).
- Practical limitations include potential phototoxicity beyond the targeted ROI and variability in laser output between confocal systems, necessitating per-instrument calibration.
