Triggering Cell Stress en Dood met behulp van conventionele uv laser confocale microscopie
3 februari 2017
Gegevensmanipulaties om gerichte stress of dood in individuele cellen te veroorzaken, zijn relatief moeilijk te bereiken. Hier wordt een ablatie-aanpak met een resolutie van één cel beschreven om selectief stress te veroorzaken en individuele cellen in celkweek en levende dieren te doden, gebaseerd op een standaard confocale UV-laser.
Het algemene doel van deze celablatie-aanpak is om selectief stress of individuele cellen in celkweek of in levende dieren te doden. Deze methode stelt onderzoekers in staat om het lot van een enkele stervende cel en de reactie van cellen, zoals microglia en astrocyten op de omringende ablatieplaats te bestuderen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het nauwkeurige targeten van individuele cellen, en dat dit kan worden bereikt met een reguliere confocale microscoop die is uitgerust met een 405 nanometer laser.
We gebruiken zebravis als modelsysteem om neurodegeneratieve ziekten zoals Motoneuron Ziekte of Frontotemporale Dementie te bestuderen. Het visualiseren van de dood van een motoneuron en de daaropvolgende gevolgen biedt een uitstekende gelegenheid om de dynamische processen die bij de ziekte betrokken zijn, beter te begrijpen. Onze aanpak om cellulaire stress op dosisafhankelijke wijze toe te brengen, maakt een gedetailleerde karakterisering van cellulaire interacties mogelijk.
Bijvoorbeeld, microglia klaring na neuronale dood. Hoewel deze methode inzicht biedt in de ziektemechanismen van een levend organisme, kan deze ook op vergelijkbare wijze worden toegepast op geïsoleerde cellen in cultuur. Na het opzetten van mannelijke en vrouwelijke transgene lijnen voor paring volgens het tekstprotocol, gebruik een plastic theezeef om embryo's te verzamelen na succesvolle paai door het tankwater te zeuven.
Gebruik vervolgens eierwater om de eieren te spoelen en breng ze over in eierwater in een petrischaal. Onderzoek de embryo's onder een lichtmicroscoop om de bevruchting te bepalen. Bewaar vervolgens bevruchte eieren bij 28 graden Celsius.
Wanneer de embryo's twee tot vijf dagen na bevruchting of DPF bereiken, plaats ze dan onder een fluorescentiecompoundmicroscoop en screen de embryo's op geschikte fluorofoorexpressie. Scheid vervolgens fel gelabelde vissen in een verse schaal met eierwater voor later inbedding. Om zebravissen in agarose in te bedden, bereid een anesthesieoplossing voor door vier gram per liter MS 222 druppelsgewijs toe te voegen aan een petrischaal met eierwater.
Bereid een voorraad laag smeltende agarose en eierwater voor en verdeel deze in 1,5 milliliter microcentrifugebuizen. Plaats een aliquot in een warmteblok op 38 tot 40 graden Celsius en laat het gelijkmatig verdelen. Voor beeldvormingstijden van langer dan vier uur, pipet ongeveer 300 microliter agarose langs de binnenkant van een glasbodemschaal om een donutvormige cirkel met een kleine opening in het midden voor te bereiden.
Om de zebravis in agarose voor microscopie te monteren, gebruikt u na het anesthetiseren van de vis volgens het tekstprotocol een verstelbare pipet om een larve op te trekken en deze naar de bodem van de punt te laten zinken. Laat de larve in een minimale hoeveelheid vloeistof ingeprente agarose vallen. Trek vervolgens de vis met agarose op en giet deze snel in een eerder voorbereide, glazen bodem 35 millimeter schaal.
Gebruik onder een dissectiemicroscoop een standaard kwastje om het dier of meerdere dieren binnen de agarose op hun zij te plaatsen zodat het lichaam en de staart plat liggen. Laat de ingebedde vissen 10 tot 15 minuten zitten totdat de agarose stevig is. Gebruik vervolgens ongeveer twee milliliter eierwater met tricaine om de 35 millimeter petrischaal voorzichtig op te vullen.
Plaats de petrischaal met een ingebedde larve op de confocale microscoopstandaard en focus, met behulp van helder veldverlichting en 40x vergroting, op de dorsale zijde van het ruggenmerg van het dier. Schakel over naar een geschikte fluorescentie-instelling en visualiseer de structuur van belang om te bevestigen dat alle beeldvormingsparameters zoals nodig zijn voor de volgende ablatie zijn ingesteld. Om de dikte van de structuur voor UV laser ablatie te bepalen, gebruik de Z-aandrijving om de boven- en onderkant van de structuur van belang te verifiëren door handmatig omhoog en omlaag te focussen.
Noteer handmatig het Z-vlak dat zal worden afgebroken. Bijvoorbeeld, het centrum van de cel. Om laser ablatie uit te voeren, start de FRAP Wizard door op het vervolgkeuzemenu bovenaan het softwaremenu te klikken.
Bepaal in het nieuwe venster de beeldparameters voor de ablatieaanpak door het formaat, de scansnelheid en de gemiddelde waarde te selecteren. Als het Z-vlak voor ablatie nog niet is geselecteerd, druk op de Live knop en focus door het monster totdat de fluorescente structuur of het gewenste Z-vlak dat zal worden afgebroken scherp staat. Zodra de algemene beeldparameters zijn ingesteld, gaat u naar de Bleach stap om de specifieke ablatiecomponenten te bepalen.
Activeer vervolgens de 405 nanometer laser door deze te activeren voor de blekingsprocedure. Gebruik vervolgens de Optie Inzoomen om de blekingsintensiteit bij het geselecteerde ROI te maximaliseren door het scanveld te verkleinen, waardoor de verblijftijd maximaal is. Selecteer een of meerdere ROI's voor de ablatie door een van de tekenhulpmiddelen in het Image Acquisition venster te gebruiken.
Richt het axon heuveltje, bijvoorbeeld, met het cirkelvormige tekenhulpmiddel van ongeveer vier tot acht micrometer. Nadat de ROI is vastgesteld, selecteert u de Time Course knop en bevestigt u het aantal cycli dat de ROI's zullen worden gescand en afgebroken. Kies de Pre-Bleach en Post-Bleach frames naar wens om een overzicht van het hele beeld te geven net voor en direct na het blekingsproces.
Deze instellingen bieden onderzoekers meerdere lagen verfijning. Door het aanpassen van de laservermogen, scansnelheid, lijngemiddelde, grootte van het gebied van belang en herhalingen, biedt deze techniek een hoge mate van vrijheid om stress of dood in individuele cellen te veroorzaken. Nadat alle noodzakelijke ablatieparameters zijn vastgesteld, drukt u op Run Experiment en bewaakt u de efficiëntie van de ablatie.
Verwijs naar het tekstprotocol voor aanvullende details. In dit experiment werd UV laser ablatie uitgevoerd op GFP-expresserende motoneuronen in het ruggenmerg van transgene zebravissen. GFP-expressie aangedreven door motoneuron promotors zoals 3 MINX een, IO een of MET, maakt hoge resolutie visualisatie van de cel
Overzicht
Dit artikel beschrijft een nieuwe ablatietechniek met resolutie op enkelcelniveau waarmee onderzoekers selectief individuele cellen in celculturen en levende dieren kunnen stressen of doden. Door gebruik te maken van een standaard confocale UV-laser biedt deze methode inzicht in cellulaire reacties en interacties na gerichte celdood.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Onderzoek naar neurodegeneratieve ziekten
Achtergrond
- Gerichte manipulatie van individuele cellen is uitdagend gebleken.
- Het begrijpen van cellulaire reacties op stress is cruciaal bij neurodegeneratieve ziekten.
- Microglia en astrocyten spelen een belangrijke rol als reactie op neuronale dood.
- Zebravissen dienen als een effectief model voor het bestuderen van deze processen.
Doel van de studie
- Om een nauwkeurige methode te ontwikkelen voor het induceren van stress of celdood in individuele cellen.
- Om het lot van stervende cellen en de omringende cellulaire reacties te bestuderen.
- Om het begrip van de mechanismen achter neurodegeneratieve ziekten te vergroten.
Gebruikte methoden
- Gebruik van een confocale microscoop uitgerust met een 405 nm laser voor ablatie.
- Toepassing van een dosisafhankelijke aanpak om cellulaire stress op te wekken.
- Inbedding van zebravislarven in agarose voor beeldvorming en ablatie.
- Monitoring van cellulaire responsen na ablatie met behulp van fluorescentiemicroscopie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle ablatie van motorneuronen in transgene zebravisjes.
- Onmiddellijk vervagen van fluorescentie na ablatie duidt op effectieve targeting.
- Karakterisering van microgliële klaring na neuronale dood.
- Inzichten in dynamische processen die betrokken zijn bij neurodegeneratieve ziekten.
Conclusies
- De ontwikkelde techniek maakt een hoge precisie mogelijk bij het bestuderen van responsen van individuele cellen.
- Deze methode kan worden toegepast in zowel in vivo als in vitro settings.
- Verder onderzoek kan deze aanpak benutten om ziektemechanismen te verkennen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Deze methode maakt precieze, dosisafhankelijke ablatie van individuele cellen mogelijk met behulp van standaard confocale microscopie, wat een schaalbare benadering biedt voor het bestuderen van cellulaire stressresponsen en intercellulaire signalering in modellen van neurodegeneratieve ziekten. Door real-time visualisatie van microgliale en astrocytaire reacties op gerichte neuronale beschadiging mogelijk te maken, ondersteunt het mechanistische risicoreductie bij vroege targetvalidatie en fenotypische screening-workflows. De techniek vergroot het voorspellend vertrouwen bij de identificatie van leadverbindingen door kwantitatieve, reproduceerbare read-outs te leveren van celdoodkinetiek en gliale activatie in fysiologisch relevante systemen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken via gecontroleerde inductie van cellulaire stress in individuele neuronen binnen intact weefsel.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbaar platform voor functionele targetvalidatie met gebruik van dosis- en tijdsafhankelijke ablatieparameters.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door resultaten van single-cell dood te koppelen aan stroomafwaartse gliale responsen die relevant zijn voor neuro-inflammatoire pathways.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve, op fluorescentie gebaseerde uitlezingen van axonale degeneratie en cellulaire fragmentatie voor de standaardisatie van assays.
- Operationele waarde: Faciliteert de gereedheid voor high-content screening door aanpasbare laserparameters (vermogen, scansnelheid, ROI-grootte) voor een consistente inductie van stress.
- Schaalbaarheid: Maakt hergebruik van het platform mogelijk in celculturen en in vivo zebravismodellen zonder dat er gespecialiseerde apparatuur nodig is buiten een confocale systeem uitgerust met een 405-nm laser.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Verbindt observaties van single-cell ablatie in de ontdekkingsfase met de preklinische validatie van neurodegeneratieve mechanismen in zebravissen.
- Afstemming van biomarkers: Ondersteunt de evaluatie van microgliële activatie en axonale degeneratie als translateerbare biomarkers van neuronale beschadiging.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Maakt mechanistische risicoreductie mogelijk door dosisafhankelijke fenotypes van celsterfte en de omringende cellulaire responsen te karakteriseren voorafgaand aan het testen van verbindingen.
Integratie van pipeline en workflow
De methode integreert in vroege discovery-workflows door hypothese-gestuurde ablatiestudies mogelijk te maken, die bijdragen aan de betrouwbaarheid van het target en de verduidelijking van signaalpaden vóór de lead-optimalisatie.
- Discovery Biology: Ondersteunt mechanistische risicoreductie door nauwkeurige, reproduceerbare inductie van cellulaire stress om doodtepaden en de dynamiek van gliale activatie te verduidelijken.
- Screening: Levert kwantitatieve, tijdopgeloste resultaten (bijv. fluorescentieverlies, blebbing, axonale degeneratie) die geschikt zijn voor geautomatiseerde beeldgebaseerde analyse bij compound-screening.
- Analytics: Verschaft dosis-respons- en tijdverloopgegevens die statistische vergelijking van ablatiecondities en cellulaire reacties tussen experimentele groepen mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Handhaaft continuïteit van schade aan individuele cellen in zebravissen tot fenotypische modellen van neurodegeneratieve ziekten, wat targetvalidatie op basis van biomarkers ondersteunt.
- Hergebruik binnen de organisatie: Fungeert als een herbruikbare capaciteit voor verschillende neuroscience discovery-teams, aanpasbaar aan diverse celtypen en ziektemodellen met behulp van standaard confocale infrastructuur.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie door ambiguïteit in cel-specifieke doodsmechanismen en gliale reacties te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie door controle over laserparameters en compatibiliteit met conventionele confocale microscopen.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go-besluitvorming door vroege beoordeling van target-engagement mogelijk te maken via fenotypische read-outs van neuronale dood en neuro-inflammatie.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door mechanistische data te genereren over dosisafhankelijke celdood en downstream cellulaire interacties.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in confocale microscopie, het werken met zebravissen en de optimalisatie van parameters voor fluorescentie-gebaseerde ablatie.
- Afhankelijk van toegang tot een confocale microscoop die is uitgerust met een 405-nm laser en geschikte filtersets voor UV-excitatie en emissiedetectie.
- Noodzaak tot standaardisatie van laservermogen, scansnelheid, ROI-grootte en repetitieaantallen tussen gebruikers en sessies voor reproduceerbare ablatieresultaten.
- Vereist aanpassing van inbeddings- en beeldvormingsprotocollen bij toepassing van de methode op verschillende modelsystemen (bijv. celculturen versus intacte organismen).
- Praktische beperkingen omvatten potentiële fototoxiciteit buiten de beoogde ROI en variabiliteit in de laseroutput tussen confocale systemen, wat kalibratie per instrument noodzakelijk maakt.
