Beoordeling van neuronale levensvatbaarheid met behulp van Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Dubbele Verf In Cerebellaire Granule Neuron Cultuur
10 mei 2017
Dit protocol beschrijft hoe om neuronale levensvatbaarheid nauwkeurig te meten met behulp van Fluorescein Diacetate (FDA) en Propidium Iodide (PI) dubbele kleuring in gekweekte cerebellar granule neuronen, een primaire neuronale cultuur die gebruikt wordt als een in vitro model in neurowetenschappen en neurofarmacologie onderzoek.
Het algemene doel van deze procedure is om de celviabiliteit in een cerebellaire korrelneuroncultuur nauwkeurig te meten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de neurowetenschappen en neurofarmacologie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we ongewenste gliacellen kunnen onderscheiden van neuronen in MISTA-celculturen.
De procedures zullen worden gedemonstreerd door Lin Jiajia, Wang Jialing en Xu Dilin, drie bachelorstudenten uit mijn laboratorium. Begin met de dissectie van de koppen van acht dagen oude rattenpups door eerst een schaar in het foramen magnum te plaatsen en de twee zijden van de schedel door te snijden van de oren naar de ogen. Gebruik vervolgens een pincet om de schedel op te tillen.
Gebruik een pincet om het cerebellum te isoleren en plaats dit in een schaal van 35 millimeter met dissectie-oplossing. Verplaats de schaal naar de tafel van de dissectiemicroscoop en gebruik twee pincetten om de hersenvliezen en bloedvaten te verwijderen. Snijd het weefsel met een scalpel in stukjes en breng het weefsel vervolgens over in een centrifugebuis met 30 milliliters dissectie-oplossing.
Centrifugeer vijf minuten bij kamertemperatuur op 1.500 x g. Zuig na de centrifugatie het supernatant op en bewaar het pellet. Voeg vervolgens Trypsine-oplossing toe aan het pellet en resuspendeer door voorzichtig te schudden.
Plaats de buis vervolgens gedurende 15 minuten in een waterbad van 37 °C. Voeg na 15 minuten een oplossing van DNase One, soja-trypsineremmer en magnesiumsulfaat toe en schud dit. Centrifugeer vervolgens gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur op 1.500 x g.
Na het aspireren van het supernatant wordt de pellet opnieuw gesuspendeerd in een minder verdunde oplossing van DNase One, soja-trypsine-remmer en magnesiumsulfaat. Bereid vervolgens twee buizen van 15 milliliter. Plaats de helft van de cellen in elke buis en pipetteer beide 60 tot 70 keer op en neer met een Pasteur-pipet met katoenprop om de cellen te homogeniseren.
Voeg na homogenisatie drie milliliter magnesiumsulfaat- en calciumchloride-oplossing toe aan elke 15-milliliterbuis. Laat de buizen 10 minuten bij kamertemperatuur staan. Zodra de tijd is verstreken, wordt het supernatant voorzichtig verwijderd met een Pasteur-pipet met katoenprop en overgebracht naar nieuwe 15-milliliterbuizen.
Centrifugeer vijf minuten bij kamertemperatuur en 1.500 x g. Voeg kweekmedium toe aan het pellet om te verdunnen tot een celdichtheid van ongeveer 1,5 x 10⁶ cellen per milliliter. Pipetteer de cellen in een 6-wells plaat en kweek deze in de incubator bij 37 °C en 5% CO₂.
Voeg na 24 uur AraC-stamoplossing toe tot een eindconcentratie van 1 mM om de groei van de gliacellen te remmen voordat de platen terug in de incubator worden geplaatst. Voeg vervolgens op dag zeven 50 µL D-glucose-stamoplossing toe tot een eindconcentratie van 1 mM. Start de kleuring door fluoresceïne-diacetaat tot een eindconcentratie van 10 µg/mL en propidiumjodide tot een eindconcentratie van 50 µg/mL te mengen met 10 mL PBS.
Meng de FDA/PI-oplossing door te vortexen en plaats deze op ijs. Plaats de kweekplaat op ijs. Aspireer voorzichtig het kweekmedium zonder met de pipetpunt de cellen aan te raken, en voeg vervolgens langzaam koud PBS toe.
Zuig de PBS af en voeg vervolgens koude FDA/PI- of FDA/PI Hoechst-werkoplossing toe. Plaats de plaat vijf minuten op ijs. Zuig daarna de FDA/PI- of FDA/PI/Hoechst-werkoplossing af en voeg koude PBS toe aan elke wel.
Zorg ervoor dat de fluorescentiemicroscoop correct is ingesteld. Detecteer de fluorescentie-emissies voor FDA, PI en Hoechst respectievelijk bij 520, 620 en 460 nanometer, met een belichtingstijd tussen 100 en 300 milliseconden en een analoge versterking van 2,8 x. Neem na het verzamelen van de fluorescentiebeelden een beeld op onder normaal licht met behulp van de fasecontrastmodus.
Voor FDA/PI-dubbelkleuring kunnen de afbeeldingen van de cellen over elkaar worden gelegd door de FDA-positieve laag bovenop de PI-positieve laag te slepen in software voor beeldbewerking. Pas de opaciteit van de FDA-positieve laag aan door 50% in te vullen in het veld Opaciteit van het Lagenpaneel. Voeg de twee lagen samen door het Laagmenu te openen en op de knop Zichtbare lagen samenvoegen te klikken.
Stel het contrast van de overlay-afbeeldingen in door 50 in te voeren in het Contrastveld onder Afbeelding, Aanpassingen, Helderheid/Contrast. Controleer of er geen FDA- en PI-dubbel positieve cellen aanwezig zijn in de overlay-afbeeldingen. Voor FDA/PI/Hoechst-triplestaining worden de afbeeldingen van de cellen over elkaar gelegd door opnieuw de FDA-positieve laag over de PI-positieve laag te slepen, de opaciteit van de FDA-positieve laag aan te passen en de afbeeldingen zoals voorheen samen te voegen.
Sleep vervolgens de Hoechst-positieve laag over de samengevoegde laag. Pas de opaciteit van de Hoechst-positieve laag aan door 50% in te voeren in het veld Opaciteit van het Lagenpaneel, en voeg de twee lagen samen door het Laagmenu te openen en op de knop Zichtbare lagen samenvoegen te klikken. Maak visueel onderscheid tussen grote, onregelmatige gliacellen en granulaire neuronen van het cerebellum door de beelden die in fluorescentiemodus zijn genomen te vergelijken met die in fasecontrastmodus.
De volgende afbeeldingen laten zien dat zowel kleine neuronen als grote, onregelmatige gliacellen aanwezig zijn in de CGN-cultuur. Deze afbeelding toont GAP-43 amino-kleuring van een CGN-cultuur na acht dagen in vitro. De blauwe pijlen geven de neuronen aan.
Hier wordt de GFAP-aminokleuring van glialle cellen getoond. De witte pijl geeft een glialle cel aan. Deze fasecontrastafbeelding toont de morfologie van de cellen.
FDA/PI-kleuring, waarmee gliacellen van neuronen kunnen worden onderscheiden, is voordelig voor de nauwkeurige evaluatie van de neuronale levensvatbaarheid in CGN-culturen. Dit is een samengevoegde afbeelding van drievoudig gekleurde cellen die zijn gekweekt in een normaal groeimedium. De pijl geeft een typische gliacel aan.
Hier is een soortgelijke cultuur behandeld met medium met een laag kaliumgehalte, en de pijl geeft opnieuw een typische gliacel aan. Let ook op het uiterlijk van de rode propidiumjodide-kleuring. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in twee uur worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd.
Een soortgelijke strategie kan worden toegepast op andere gemengde celculturen, zoals primaire corticale culturen en primaire hippocampaal-culturen, om de neuronale levensvatbaarheid nauwkeurig te analyseren.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode om de neuronale levensvatbaarheid in gecultiveerde granulaire neuronen van het cerebellum nauwkeurig te meten met behulp van dubbele kleuring met fluoresceïne-diacetaat (FDA) en propidiumjodide (PI). Deze techniek is essentieel voor het onderscheiden van neuronen van gliacellen in MISTA-celculturen.
Belangrijkste Componenten van de Studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Neurofarmacologie
- Celbiologie
Achtergrond
- Cerebellaire korrelneuronen zijn een primaire neuronale cultuur die in onderzoek wordt gebruikt.
- Nauwkeurige meting van de celviabiliteit is cruciaal voor neurowetenschappelijke studies.
- Fluoresceïne-diacetaat en propidiumjodide zijn veelgebruikte viabiliteitskleuringen.
- Deze methode maakt het mogelijk om onderscheid te maken tussen neuronale en gliale cellen.
Doel van de studie
- Om een betrouwbaar protocol te bieden voor het meten van de neuronale levensvatbaarheid.
- Om onderzoek in de neurofarmacologie en neurowetenschappen te faciliteren.
- Om het begrip van celculturen in experimentele settings te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Dissectie van acht dagen oude rattenpups om cerebellaire granulaire neuronen te verkrijgen.
- Toepassing van fluoresceïne-diacetaat (FDA) voor levende celkleuring.
- Gebruik van propidiumjodide (PI) voor het kleuren van dode cellen.
- Analyse van gekleurde cellen om de levensvatbaarheid te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle differentiatie tussen levensvatbare neuronen en dode cellen.
- Demonstratie van het protocol door bachelorstudenten.
- Validatie van de methode voor gebruik in diverse neurowetenschappelijke toepassingen.
- Verbeterd begrip van de cellevensvatbaarheid in gekweekte neuronen.
Conclusies
- De FDA- en PI-kleuringsmethode is effectief voor het beoordelen van de neuronale levensvatbaarheid.
- Dit protocol kan nuttig zijn voor toekomstig onderzoek in de neurowetenschappen en neurofarmacologie.
- Een nauwkeurige beoordeling van de levensvatbaarheid is cruciaal voor de experimentele integriteit.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Een nauwkeurige beoordeling van de neuronale levensvatbaarheid in gemengde gliale-neuronale culturen is cruciaal voor betrouwbare neurofarmacologische screening en targetvalidatie. Deze methode verbetert het voorspellend vertrouwen door specifieke neuronale read-outs mogelijk te maken, waardoor valse signalen door gliale contaminatie worden verminderd. Het ondersteunt vroege besluitvorming bij discovery door een schaalbare, reproduceerbare maatstaf voor levensvatbaarheid te bieden voor compoundscreening in cerebellaire en aanverwante neuronale modellen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door signalen van neuronale levensvatbaarheid te isoleren van gliale interferentie.
- Operationele waarde: Biedt een gestandaardiseerde fluorescentiegebaseerde uitlezing voor het onderscheiden van levende en dode neuronen in primaire culturen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve levensvatbaarheidsgegevens die compatibel zijn met high-content imaging-workflows voor compound screening.
- Operationele waarde: Ondersteunt de reproduceerbaarheid van de assay via gedefinieerde kleuringsprotocollen en instellingen voor fluorescentiemicroscopie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Verbetert de getrouwheid van ziekterelateerde systemen door neuron-specifieke levensvatbaarheidsmetingen in gemengde culturen te waarborgen.
- Operationele waarde: Maakt continuïteit mogelijk van ontdekking naar preklinische validatie via overdraagbare levensvatbaarheidsbeoordelingen in corticale, hippocampale en cerebellaire modellen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van de vroege preparatie van neuronale modellen tot de beoordeling van de levensvatbaarheid na toevoeging van verbindingen, ter ondersteuning van de identificatie van lead-verbindingen en preklinische triage.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing door neuronale responsen te isoleren in gemengde glia-neuronale culturen.
- Screening: Levert assay-klare, reproduceerbare levensvatbaarheidsgegevens voor het evalueren van de effecten van verbindingen op het overleven van neuronen.
- Analytiek: Biedt gemultiplexte fluorescentie-uitlezingen (FDA, PI, Hoechst) die een kwantitatieve vergelijking van de levensvatbaarheid tussen verschillende condities mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Legt een verband met preklinisch werk door te waarborgen dat levensvatbaarheidsbeoordelingen de neuronale, en niet de gliale, biologie weerspiegelen in ziekterelevante modellen.
- Herbruikbaarheid binnen de organisatie: Vestigt een herbruikbaar platform voor levensvatbaarheid dat toepasbaar is op meerdere primaire neuronale culturesystemen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen door mechanistische ambiguïteit door gliale contaminatie in levensvatbaarheidsassays te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en schaalbaarheid door gedefinieerde parameters voor celpreparatie, kleuring en beeldvorming.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door neuron-specifieke levensvatbaarheidsgegevens te leveren, waardoor uitval in een laat stadium door valse neurotoxiciteitssignalen wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen mogelijk op basis van nauwkeurige profielen van neuronale levensvatbaarheid.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de dissectie van primaire neuronale culturen en fluorescentiemicroscopie.
- Afhankelijk van toegang tot fluorescentiemicroscopie met geschikte filtersets voor FDA (520 nm), PI (620 nm) en Hoechst (460 nm).
- Noodzaakt standaardisatie tussen teams voor de timing van de kleuring, de behandeling van antilichamen en de protocollen voor beeldanalyse.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij uitbreiding naar andere typen neuronale culturen buiten de granulaire neuronen van het cerebellum.
- Praktische beperkingen omvatten de noodzaak voor zorgvuldige optimalisatie van de kleuringsduur en concentratie om toxiciteit of signaalverzadiging te voorkomen.
