Kwantificering van hypopigmentatie activiteit In Vitro

Deze methode kan nuttig zijn bij de ontwikkeling van functionele cosmetica en huidagent met anti-melanogene activiteiten. Het is er om uit te voeren en het resultaat kan snel worden verkregen. Bovendien kan deze methode nuttig zijn voor onderzoekers, die de effecten of de verbindingen willen identificeren of onderzoeken of de antimelanogene of promelanogene activiteiten willen onderzoeken.

Om te meten tyrosinase activiteit beginnen met het zaaien van B16-F10 Melaniciden op een vijf keer 10 tot de vierde cellen per put van een 24 put plaat concentratie in volledig medium gedurende 24 uur in een celcultuur incubator. De volgende dag, vervang de supernatant in elke put met DMEM aangevuld met vers bereide test verbinding en remmer controle of een negatieve controle en terug de plaat naar de incubator voor nog eens 72 uur. Spoel aan het einde van de behandeling de putten twee keer af met 300 microliter koude pbs per put en leg de plaat op ijs.

Voeg vervolgens 300 microliter lysebuffer toe aan elke put met behulp van een celschraper om de celkrassen na vijf minuten te verzamelen. Breng de resulterende celdeeltjessuspensies over op individuele 1,5 milliliter microcentrifugebuizen. En homogeniseren de lysates drie keer gedurende twee seconden op 14, 500 rpm op ijs om de intercellulaire Tyrosinase release.

Pellet het celpuin door centrifugatie en breng de supernatants over naar individuele 1,5 milliliter centrifugebuizen op ijs. Wijs 70 microliter van elke supernatant toe aan afzonderlijke putten van een duidelijke 96 put polystyreen microplaat en voeg 140 microliters van Tyrosinase substraatoplossing toe aan elke put van supernatant. Schudden van de plaat zacht om de put inhoud te mengen.

Dan incubeer de plaat op 37 graden celsius voor twee uur. En meet tyrosinase activiteit op 475 nanometer op een microplate lezer. Om het melaninegehalte van de cellen te meten na het verzamelen van het lysaat van de behandelde cellen zoals aangetoond.

Verzamel de lysates door centrifugatie en breng de supernatants over naar nieuwe buizen. Voeg 300 microliters van een normale natriumhydroxide toe aan elke pellet voor een incubatie van een uur bij 60 graden Celsius. Gevolgd door centrifugatie van de opgeloste celsuspensies.

Breng vervolgens 200 microliters van de supernatants over naar elke put van een 96 putplaat. En meet de melanine inhoud op een microplate lezer op een golflengte van 400 nanometer. Voor Fontana-Masson Kleuring, was de behandelde cellen twee keer met 300 microliters koude pbs en bevestig de cellen met 200 microliters van 10% formaline gedurende een uur bij vier graden Celsius.

Spoel de dikke cellen met gedestilleerd water en voeg 200 microliters van 58 tot 68 graden Celsius Ammoniacal zilver werkende oplossing aan elke put. Voor een uur incubatie bij 37 graden Celsius of totdat de cellen geelbruin van kleur. Spoel de gekleurde cellen met gedestilleerd water, gevolgd door twee minuten incubatie in 0,1%goudchloride bij kamertemperatuur.

Spoel de met goudchloride behandelde cellen af met gedestilleerd water en voeg 200 microliter natriumthiosulfaatoplossing toe aan de cellen. Na twee minuten spoel de cellen weer. En label de cellen met 200 microliters van kernsnel rood per put gedurende vijf minuten.

Was vervolgens de gekleurde cellen met leidingwater voordat beeldvorming onder een lichtmicroscoop. Open voor drempelanalyse de afbeeldingen in afbeelding J en selecteer afbeelding, aanpassen en Kleurdrempel. Als u het gebied wilt meten dat is bevlekt met Fontana Masson, stelt u de helderheidsparameterbalk in op nul en past u de helderheid aan op het punt waarop alle zwarte of bruine gekleurde cellen zijn opgenomen.

Selecteer Deeltjes analyseren en analyseren en schakel het selectievakje samenvatten in het venster Deeltjes analyseren en klik vervolgens op oke om een samenvatting van de resultaten te verkrijgen en de gegevens in een spreadsheet te kopiëren en plakken. Arbutin behandeling onderdrukt de cellulaire Tyrosinase activiteit aanzienlijk in vergelijking met de controle voertuig behandelde cellen. Ook het melaninegehalte van cellen gestimuleerd met Arbutin is aanzienlijk verminderd in vergelijking met de controles.

Hoewel de cellen morfologisch vergelijkbaar zijn tussen behandelingsgroepen, vermindert Arbutin het gebied van zwart pigment in vergelijking met de controle behandelde cellen. Deze methode is handig voor activiteiten screening met behulp van onze samengestelde bibliotheek. Er zijn meer dan honderden monsters die snel getest moeten worden.

Bovendien kan deze methode ook worden gebruikt om het mechanisme met melanogenese te onderzoeken. Nadat de bioactieve kandidaten verbindingen zijn geïdentificeerd, voor hun getuigenis van de studie van biologische mechanismen of commerciële toepassingen.