Identificatie en karakterisering van het histologische dissectie van de prostaat lobben van de muis voor In Vitro 3D sferoïde cultuur modellen

Deze methode kan helpen bij het starten van genetisch gemanipuleerde muismodellen van prostaatkanker en onderzoek van prostaatkanker mechanisme door middel van in vivo en in vitro analyse. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het zorgt voor een volledige analyse van de prostaatkanker muis model, helemaal van weefsel dissectie tot celisolatie en culturing. Na het blootstellen van het urogenitale systeem, of UGS, stevig grijpen de urineblaas met medium stompe tangen, en til het hele systeem uit de muis buik.

Schuif een schaar onder de blaas en prostaat helemaal naar de wervelkolom om een incisie door het ruggenmerg te maken en snijd door de resterende verbindingen met de buikholte om verwijdering van de gehele UGS mogelijk te maken. Breng de UGS naar een petrischaal van zes centimeter met twee tot zes milliliter PBS onder een ontledenmicroscoop. En gebruik een paar fijne tangen en microdosische geschoren om zorgvuldig duidelijk al het vet van zowel de rug-en ventrale zijkanten van het weefsel systeem zonder knippen geen prostaatweefsel.

Wanneer al het vet is verwijderd, trek de blaas met de tangen en accijns op de blaas aan de basis. Plaats de resterende weefselventilalzijde omhoog en houd een kanaal eindigt met de tangen, volg het vat naar de basis met een schaar en accijns het schip aan de basis. Verwijder hetzelfde vat aan de andere kant en steek de tangen tussen de zaadblasels en prostaat in om het mogelijk te maken om eventuele aangrenzende bindweefsel mogelijk te maken.

Traceer vervolgens de zaadblasels naar hun basis bij de plasbuis en verwijder de vaten zonder ze te prikken. Wanneer beide akels zijn verwijderd, plaats de weefsel rug kant omhoog, zodat de rugkwab's die lijken op vleugels van een vlinder zichtbaar zijn. Houd elke rugkwab met tangen, snijd het weefsel aan de basis met een schaar om de rugkwab's te verzamelen en draai het weefsel naar de ventrale kant.

Verzamel de laterale lobben, die klein zijn en meestal wikkel de plasbuis aan de zijkant en zijn ingeklemd tussen de voorste, ventrale, en rugkwab's op dezelfde manier. Verzamel de ventrale lobben, die groter zijn dan de laterale lobben en liggen op de plasbuis ventrally. Snijd vervolgens en gooi de plasbuis weg om de voorste lobben te oogsten.

Om het prostaatweefsel voor 3D-cultuur te verwerken, breng je de kwabben over naar een schaal van 10 centimeter met twee tot drie milliliter DMEM en gebruik je een scalpel om de prostaatbuitken zo fijn en gelijkmatig mogelijk te gehakt. Breng de weefselfragmenten over naar een steriele weefselkweekkap en voeg de weefseloplossing toe aan een nieuwe buis van 15 milliliter. Breng het volume in de buis tot negen milliliter met vers medium, en voeg een milliliter van TenX collagenase voorraad oplossing aan het weefsel mengsel.

Na het vortexen, incubeer de buis met schudden voor twee uur op 37 graden Celsius om de extracellulaire matrix te degraderen. Verzamel aan het einde van de incubatie het weefsel door centrifugatie en schort de pellet opnieuw op in twee milliliter warme 05%-strips in EDTA. Na vijf minuten van 37 graden Celsius om het klijpen van de cel-aan-cel en cel-aan-matrix verklevingen te vergemakkelijken, gebruik een P1000 pipehead met een brede raad van bestuur tip om het weefsel te tritureren acht tot 10 keer te breken eventuele klonten.

Herhaal de dissociatie met een P200 pipehead tip. Neutraliseer vervolgens de trypsine met drie milliliter compleet medium. Meng 500 eenheden DNASE1 in de weefseldrijfmest en geef de oplossing vijf tot 10 keer door een vijfliter spuit uitgerust met een 18-gauge naald, gevolgd door vijf keer door een 20-gauge naald.

Wanneer er geen grote weefselstukken meer zichtbaar zijn, filtreer de suspensie door een filter van 40 micrometer in een conische buis van 50 milliliter en verzamelt u de cellen door middel van centrifugatie. Voor celbeplating en cultuur, opnieuw schorsen de pellet in 0,5 milliliter van volledige prostaat epitheelcel groeimedium, en zinspelen de cellen op een vijf keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter van prostaat epitheliale cel groeimedium concentratie. Meng de cellen met keldermembraan extracellulaire matrix op een twee tot drie volume van de oplossing verhouding, en plaat de cel suspensie in de juiste experimentele cel cultuur container.

Plaats vervolgens de cellen in een celcultuur incubator voor 30 minuten. Wanneer de extracellulaire matrix is gestold, bedek de cultuur met voorverwarmde complete prostaat epitheelcel groeimedium, waarbij ervoor wordt gezorgd dat het keldermembraan extracellulaire matrix plug niet verstoort. Breng de cellen vervolgens vijf tot tien dagen terug naar de couveuse van de celkweek, die elke twee tot drie dagen de helft van het medium ververst.

Om bollen te oogsten, het medium zorgvuldig aan te trekken zonder het keldermembraan extracellulaire matrixgelplug te verstoren en voeg een milliliter Disbase-oplossing toe voor 100 microliters van keldermembraan extracellulaire matrix. Met behulp van een cel schraper, schraap langs de bodem van de plaat om de kelder membraan extracellulaire gels lift van de bodem van de plaat in de supernatant, en pijp van de hele oplossing een keer op te breken van de stekker in kleinere stukken. Broed de extra cellulaire matrixstukken in de celkweek incubator gedurende één tot twee uur tot het keldermembraan extracellulaire matrix volledig is opgelost.

Breng vervolgens de celsuspensie over naar een buis van 15 milliliter. En verzamel de cellen door centrifugatie voor verdere downstream manipulatie. De muis prostaat bestaat uit vier paar lobben gelegen dorsaal en ventrally aan de zaadblaasjes en urethra.

De prostaatlobben bestaan uit meerdere klierprofielen, elk bestaande uit een lumen, omgeven door secretoire epitheliale cellen. De vormen van de lobben, de organisatie van de cellen en de aard van de afscheiding variëren van kwab tot kwab. De geïsoleerde prostaatcellen beginnen te groeien in organoïden zo vroeg vier dagen na kelder membraan extracellulaire matrix cultuur.

In de komende een tot zes dagen, de meeste van de cellen groeien in vaste bollen met een fractie van de bollen vertonen een gedeeltelijke of volledige lumen. De sferoïden tonen ook een sterke beta catenine kleuring op de cel-to-cell kruispunten die co-lokaliseren met F-actin vlekken. Tijdens het proberen van deze procedure, is het zeer belangrijk om zorgvuldig te volgen de microdissection stappen.

Bijvoorbeeld, isoleer de prostaatlobben terwijl ze nog steeds gehecht aan de plasbuis, zodat u weet welke kwab is die gebaseerd op waar ze zijn met betrekking tot de plasbuis. Na de dissectieprocedure kunnen de geïsoleerde lobben worden gebruikt voor downstream-analyse, zoals RMA-sequencing, Westerse blotting of immunostaining. De primaire 3D-cultuurtechniek stelt u in staat om meer inzicht te krijgen in het prostaatkankermechanisme, omdat u het leven met sferoïden controleren op morfologie en gedragsveranderingen en alle neoplastische veranderingen in hetzelfde identificeren.

Samengevat, deze prostaat dissectie en cultuur methoden kunnen worden opgenomen in verschillende downstream toepassingen om waardevolle informatie te verstrekken voor het onderzoek naar het mechanisme van prostaatkanker met behulp van genetisch gemanipuleerde muismodellen.