Geautomatiseerde Behavioral analyse van grote C. elegans populaties met behulp van een breed veld-of-view Tracking Platform

Dus deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden in een drugsontdekkingsproces over hoe een specifiek medicijn zich gedraagt in een levend organisme. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat grote monsterformaten snel en efficiënt kunnen worden gescreend. Deze techniek heeft al een grote impact bij de ontdekking van geneesmiddelen door een zeer quanititatieve beoordeling van de effecten van kandidaat-geneesmiddelen mogelijk te maken.

Deze methode biedt nieuwe mechanistische inzichten in het ontstaan en de progressie van misfolding ziekten. Bovendien kan deze methode ook worden toegepast op andere systemen, zoals veroudering en genetische screenings. We zijn erg enthousiast over deze kans om nieuwe fysieke methoden te introduceren in de ruimte van drugsontdekking.

Deze demonstartions van deze methode is van cruciaal belang omdat de screeningstappen een hoge vertrouwdheid met deze novo automatische techniek vereisen. Het aantonen van de procedure zal Sam Casford zijn, een zoekassistent van ons laboratorium. Voeg voor het begin van de procedure 2,2 millileter van elke geneesmiddelenverbinding bij de juiste concentratie toe aan zes 5-fluordeoxyuridine- of FUDR-platen per wormstam, door de verbinding zorgvuldig over het hele oppervlak van de plaat te verspreiden en de platen onder steriele omstandigheden te drogen.

Terwijl de platen drogen, gebruik 15 milliliter M9 buffer om de wormen te wassen van vijf rijke nematode groeifactor platen, en de overdracht van de bevrijde wormen in een kegelvormige buis voor centrifugatie. Stel de aaltjes opnieuw op in drie milliliter verse M9-buffer voor kwantificering van het aantal wormen in het larvalestadium van L4 en zaad 700 L4-larven op elk van de zes droge FUDR-platen per wormsoort, per verbinding. Wanneer alle aaltjes zijn ingezaaid, plaatst u de platen met de stammen waarvoor parlyse wordt veroorzaakt door de temperatuur 24 uur lang op 24 graden celsius te verhogen.

De volgende dag, zet de podiumlichten van de parallelle worm tracker, en maak het glas stadium van de tracker met 70 procent ethanol. Als er geen zichtbare resten achterblijven, verwijder dan de lensdop en gebruik een luchtdring om de beeldlens schoon te maken. Controleer of de camera correct is aangesloten en geïnstalleerd en begin met opnemen met de software voor het vastleggen van afbeeldingen.

Pas de camera-instellingen aan om 20 frames per seconde op te nemen, met de juiste mono-16 opnameparameters. Gebruik een lege petrischaal van negen centimeter om ervoor te zorgen dat het podium op de juiste hoogte is ingesteld en pas het podium indien nodig aan. Voeg onder steriele omstandigheden drie milliliter M9-oplossing toe aan een beweeglijkheidsscreeningplaat en gebruik twee milliliter M9-oplossing om een derde van het oppervlak van twee door aaltjes geladen FUDR-platen van dezelfde experimentele groep in de zeefplaat te wassen.

Plaats vervolgens de screeningplaat op het trackerpodium. Gebruik een enkele worm om de camera scherp te stellen, en beginnen met het opnemen van de dieren. Wanneer de opname is voltooid, gooi de beweeglijkheidsplaat weg en markeer de FUDR-platen als één keer gebruikt voordat u ze terugbreek naar de couveuse.

Als u de videogegevens wilt analyseren, opent u de grafische gebruikersinterface voor de parallelle wormtrackergegevensanalyse en gebruikt u de browsefunctie om de video van belang te laden. Selecteer een uitvoerbestemmingsmap en controleer of 600 tot 1200 frames zijn ingesteld voor een analyse van 30 seconden. Plaats een conversiefactor van 0,029 tot millimeter voor de beeldvorming van een petrischaaltje van negen centimeter op volledige resolutie en selecteer de houd dead tracking algorithhm.

Stel onder het tabblad zoekparameters de z-gebruiksafbeeldingen in op 100, de Z-padding op 3, de standaardpixels op 54, de drempelwaarde op 9, de opening op 1 en de afsluiting op 2. Pas de filterparameters aan op een minimale grootte van 20, een maximale grootte van 180 en een worm van 0,94. Stel de parameters van de vormende trajecten in op een maximale afstandsbeweging van 10, een minimale lengte van 150 en een geheugen van 10.

Stel de bochten en snelheid parameters op een bocht drempel drempel van 1,8, een minimum bochten van 0, en een frames om de snelheid van 150 schatten. Stem de dode wormstatistieken af op een maxmim beat per minuut van 5 en een maximale snelheid van 1. Selecteer de uitvoermap en selecteer het aantal uitvoerframes op 50 en de tekengrootte op 10.

Gebruik de voorbeeldfunctie om de parameters te testen en de voorbeeldafbeeldingen uit te voeren om te controleren of de wormen zichtbaar zijn in de acht drempels. Start vervolgens de functie Starttaak en combineer de afzonderlijke resultaten voor de hele gegevensset om de testresultaatbestanden te analyseren, waardoor de resultaten worden opgeslagen via de functie exporteren naar TSV. Deze methode maakt het mogelijk de karakterisering van nematode fenotypes voor grote populatiestudies van verschillende wormmodellen van neurodegeneratieve ziekte, zoals Frontotemporale dementie, de ziekte van Parkinson, de ziekte van Alzheimer, en Amyotrofische laterale sclerose.

Evenals de karakterisering van de effecten van potentiële therapeutische moleculen, met behulp van worm modellen van de ziekte van Parkinson en de ziekte van Alzheimer. De hoge nauwkeurigheid van deze metingen wordt bereikt door het verhogen van het aantal wormen dat kan worden geanalyseerd in vergelijking met traditionele methoden. Tijdens het uitvoeren van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om de tijd tussen de toevoeging van de wormen aan de beweeglijkheid en het begin van de tracking te minimaliseren.

Na deze procedure kunnen andere methoden worden uitgevoerd om de resultaten aan te vullen en te koppelen aan eiwitaggregatie. Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van neurodegeneratieve en misfolding ziekten, zoals Parkinson en Alzheimer, om de juiste ontdekkingstoepassingen te verkennen. Vergeet niet dat het werken met FUDR zeer gevaarlijk kan zijn en dat de voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van nitrilhandschoenen, altijd moeten worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.