Isolatie en differentiatie van primaire Myoblasten van muis skeletspieren Explants
15 oktober 2019
Myoblasten zijn prolifererende precursor cellen die differentiëren om polynucleated myotubes en uiteindelijk skeletspieren myofibers vormen. Hier presenteren we een protocol voor efficiënte isolatie en cultuur van primaire myoblasten van jonge volwassen muis skeletspieren. De methode maakt moleculaire, genetische, en metabole studies van spiercellen in de cultuur.
Dit is een protocol voor de isolatie van primaire muisspierstamcellen voor de studie van metabolisme ex vivo. Dit protocol biedt een veel grotere populatie stamcellen in vergelijking met andere protocollen die we in het verleden hebben geprobeerd. En belangrijker nog, als we deze stamcellen eenmaal onderscheiden in myobuizen, vertonen ze normale fysiologie, dus dingen zoals circadiane ritmes.
Wanneer u deze procedure voor de eerste keer probeert, maakt u gedetailleerde notities en slaat u verschillende afbeeldingen op omdat elk weefsel er anders uitziet en er variatie zal zijn in de uitgroei van myoblasten. Zonder visuele demonstratie is het moeilijk om te weten of u de juiste cellen isoleert. We profiteerden van de genereuze hulp van anderen die ons deze methode lieten zien toen we het in ons lab vestigden.
Na het bereiden van de schotel voor dissectie volgens het manuscript, bereiden een vochtige kamer door het plaatsen van twee tot drie vellen dik absorberend papier in een plastic zak en gebruik een pipet om het oppervlak van het papier nat met steriel water. Plaats de kamer gedurende vijf minuten onder UV-licht om te steriliseren. Ontleed de gewenste spier van een vier tot acht weken oude muis en spoel zachtjes in PBS met 40 microgram per milliliter gentamycine te steriliseren.
Gebruik steriele tangen om de spier over te brengen naar een steriele 10 centimeter niet-gecoate petrischaal. Voeg 0,5 tot een milliliter beplating media over de spier zodanig dat het weefsel vochtig is, maar niet zweven. Gebruik een steriele scalpel of scheermesje om de spier voorzichtig in kleine stukjes te snijden.
Gebruik tangen of een pipet om de spierfragmenten over te brengen op het oppervlak van een voorgecoate plaat van zes centimeter. Heel voorzichtig overlay een extra 0,8 milliliter beplating media over het weefsel. Plaats de schaal van zes centimeter met de spierfragmenten in de vochtige kamer en breng deze gedurende 48 uur terug naar een couveuse op 37 graden Celsius en 5%kooldioxide.
Bereid en verwarm myoblast media, trypsine en PBS-gentamycine in een waterbad bij 37 graden Celsius. Om een T25-kolf voor elke spiergroep te coaten, voeg twee milliliter coatingoplossing toe aan het oppervlak van de kolf, schud voorzichtig om een gelijkmatige laag op het oppervlak te creëren en broed de kolf een uur lang uit op vier graden Celsius. Nu met een pipet, verwijder de beplating media uit de spier explants en voorzichtig spoelen de spier explants met twee milliliters PBS-gentamycine.
Verwijder de PBS snel en laat de plaat niet in de PBS zitten. Voeg vervolgens voorzichtig een milliliter PBS-gentamycine toe en plaats de plaat gedurende één minuut in de 37 graden Celsius-incubator. Gebruik een P1000 pipet om de PBS met cellen te verzamelen in een 15 milliliter centrifugebuis.
Voeg vervolgens een milliliter trypsine toe aan de plaat en breng deze gedurende drie minuten terug naar de 37 graden Celsius-incubator. Tik voorzichtig op de platen om de myoblasten los te maken. Verzamel de trypsine met cellen en combineer met de PBS-collectie.
Voeg acht milliliter myoblast media toe aan de centrifugebuis en draai voorzichtig om om te mengen. Leg voorzichtig twee milliliter beplatingsoplossing op de spierplaten en breng de platen terug naar de 37 graden Celsius incubator. Draai de centrifugebuizen met cellen in een centrifuge gedurende drie minuten op 200 keer g.
Aspirate de supernatant en houd ongeveer een milliliter in de buis. Voeg voorzichtig myoblast media toe, breng de cellen over naar de voorgecoate kolf en plaats de kolf in de 37 graden Celsius incubator. Aspirate de media van P0 myoblast T25 kolven.
Spoel de cellen kort met twee milliliter warme PBS-gentamycine en spoel de PBS uit de kolf aan. Pipette twee milliliter warme PBS in elke kolf met myoblasten. Plaats de kolven met PBS drie minuten in de 37 graden Celsius incubator.
Tik vervolgens stevig op de zijkant van de kolf om de cellen los te maken. Controleer onder een lichtmicroscoop op vrij zwevende myoblasten. Plaats de kolven rechtop in een weefselkweekkap en spoel de onderkant van de kolven met 10 milliliter myoblast media twee tot drie keer om ervoor te zorgen dat alle cellen worden losgemaakt.
Verzamel de cel media mengsel in een 15 milliliter centrifuge buis. Centrifuge gedurende drie minuten op 200 keer g. Aspirate de media te laten ongeveer een milliliter in de buis voorzichtig om de cel pellet te voorkomen.
Voeg voorzichtig een passend volume van myoblast media toe aan de centrifugebuis en meng voorzichtig. Verdeel het celmengsel over nieuwe T75-kolven per stuk. Voeg 10 milliliter myoblast media toe aan elke nieuwe T75-kolf.
Schud de kolven voorzichtig horizontaal om de cellen te verdelen en plaats ze 's nachts op 37 graden Celsius in de couveuse. In dit protocol kwamen primaire cellen uit de explants naar voren onder een standaard lichtmicroscoop. Vroege oogsten van myoblasten verschenen als kleine ronde en heldere bollen.
Differentiatie van myoblasten duurde vier tot zes dagen waarin de morfologie van de cellen veranderde van enkele ronde bollen naar langwerpige gesmolten lange multi-nucleated vezels. Volledig gedifferentieerde myotubes werden opgeleverd die klaar waren voor het meten van het zuurstofverbruik. Deze cellen kunnen worden gebruikt voor een aantal downstream toepassingen.
We gebruiken ze bijvoorbeeld vaak om substraatflux in Seahorse-instrumenten te bestuderen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft de isolatie van primaire myoblasten uit jonge volwassen muisskeletspieren, waardoor de studie van spiercelmetabolisme ex vivo mogelijk wordt. De methode levert een grotere populatie stamcellen op in vergelijking met eerdere technieken, waardoor gedetailleerde fysiologische studies mogelijk zijn.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Spierfysiologie
Achtergrond
- Myoblasten zijn precursorcellen die zich differentiëren in myobuizen en skeletspiervezels.
- Het begrijpen van het spiercelmetabolisme is cruciaal voor verschillende biologische studies.
- Eerdere protocollen leverden kleinere populaties spierstamcellen op.
- Visuele demonstratie is essentieel voor het succesvol isoleren van de juiste cellen.
Doel van het onderzoek
- Om een efficiënte methode voor het isoleren van primaire myoblasten te presenteren.
- Om moleculaire en genetische studies van spiercellen mogelijk te maken.
- Om inzichten te bieden in spiercelmetabolisme en -fysiologie.
Gebruikte methoden
- Isolatie van primaire myoblasten uit muisskeletspier.
- Kweek van myoblasten voor differentiatie in myobuizen.
- Visuele documentatie van weefselexplanten tijdens de procedure.
- Vergelijking met eerdere isolatieprotocollen.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol levert een grotere populatie myoblasten op.
- Myobuizen afgeleid van deze cellen vertonen normale fysiologische kenmerken.
- Variatie in weefselexplanten vereist zorgvuldige observatie en documentatie.
- Succesvolle isolatie wordt verbeterd door visuele begeleiding van ervaren onderzoekers.
Conclusies
- Deze methode is effectief voor het bestuderen van spiercelmetabolisme.
- Het biedt een betrouwbare aanpak voor het verkrijgen van primaire myoblasten.
- Toekomstige studies kunnen dit protocol gebruiken voor verschillende spiergerelateerde onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Robust isolation and differentiation of primary myoblasts from mouse skeletal muscle explants enables reproducible ex vivo modeling of muscle cell metabolism for early-stage drug discovery. This system supports high-fidelity investigation of metabolic pathways, substrate utilization, and genetic perturbations in a scalable, standardized format. The approach enhances predictive confidence for target validation and mechanistic de-risking in muscle-related therapeutic programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of metabolic pathways and functional target validation in primary muscle cells.
- Supports mechanistic de-risking by providing physiologically relevant myotube models with normal circadian rhythms.
- Facilitates hypothesis-driven studies on muscle metabolism and gene function using exogenous DNA or viral vectors.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible source of primary myoblasts for quantitative metabolic assays, including substrate flux analysis.
- Supports assay standardization and scalability for downstream compound screening in muscle cell systems.
- Enables preparation of differentiated myotubes suitable for high-content metabolic readouts.
Translational & Preclinical Research
- Offers a disease-relevant ex vivo system for studying metabolic phenotypes across mouse models.
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling direct measurement of oxygen consumption and substrate utilization.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by bridging in vitro and in vivo muscle biology.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early target validation through assay development and preclinical metabolic studies.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification in primary muscle cells.
- Screening: Delivers reproducible, scalable cell populations for quantitative metabolic assays.
- Analytics: Enables measurement of oxygen consumption rates and substrate flux for comparative analysis.
- Translational Research: Provides an ex vivo platform for aligning metabolic findings with in vivo models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow for repeated use across muscle metabolism projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in muscle metabolism studies.
- Operational Value: Enhances reproducibility, scalability, and standardization of primary cell workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency in early-stage muscle target programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of muscle-related therapeutic assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell isolation and differentiation techniques.
- Needs access to sterile tissue culture facilities and metabolic assay instrumentation.
- Demands rigorous cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- May require adaptation for different mouse models or muscle tissue sources.
- Visual documentation and training are critical due to variability in explant outgrowth.
