Isolatie en differentiatie van primaire Myoblasten van muis skeletspieren Explants

Dit is een protocol voor de isolatie van primaire muisspierstamcellen voor de studie van metabolisme ex vivo. Dit protocol biedt een veel grotere populatie stamcellen in vergelijking met andere protocollen die we in het verleden hebben geprobeerd. En belangrijker nog, als we deze stamcellen eenmaal onderscheiden in myobuizen, vertonen ze normale fysiologie, dus dingen zoals circadiane ritmes.

Wanneer u deze procedure voor de eerste keer probeert, maakt u gedetailleerde notities en slaat u verschillende afbeeldingen op omdat elk weefsel er anders uitziet en er variatie zal zijn in de uitgroei van myoblasten. Zonder visuele demonstratie is het moeilijk om te weten of u de juiste cellen isoleert. We profiteerden van de genereuze hulp van anderen die ons deze methode lieten zien toen we het in ons lab vestigden.

Na het bereiden van de schotel voor dissectie volgens het manuscript, bereiden een vochtige kamer door het plaatsen van twee tot drie vellen dik absorberend papier in een plastic zak en gebruik een pipet om het oppervlak van het papier nat met steriel water. Plaats de kamer gedurende vijf minuten onder UV-licht om te steriliseren. Ontleed de gewenste spier van een vier tot acht weken oude muis en spoel zachtjes in PBS met 40 microgram per milliliter gentamycine te steriliseren.

Gebruik steriele tangen om de spier over te brengen naar een steriele 10 centimeter niet-gecoate petrischaal. Voeg 0,5 tot een milliliter beplating media over de spier zodanig dat het weefsel vochtig is, maar niet zweven. Gebruik een steriele scalpel of scheermesje om de spier voorzichtig in kleine stukjes te snijden.

Gebruik tangen of een pipet om de spierfragmenten over te brengen op het oppervlak van een voorgecoate plaat van zes centimeter. Heel voorzichtig overlay een extra 0,8 milliliter beplating media over het weefsel. Plaats de schaal van zes centimeter met de spierfragmenten in de vochtige kamer en breng deze gedurende 48 uur terug naar een couveuse op 37 graden Celsius en 5%kooldioxide.

Bereid en verwarm myoblast media, trypsine en PBS-gentamycine in een waterbad bij 37 graden Celsius. Om een T25-kolf voor elke spiergroep te coaten, voeg twee milliliter coatingoplossing toe aan het oppervlak van de kolf, schud voorzichtig om een gelijkmatige laag op het oppervlak te creëren en broed de kolf een uur lang uit op vier graden Celsius. Nu met een pipet, verwijder de beplating media uit de spier explants en voorzichtig spoelen de spier explants met twee milliliters PBS-gentamycine.

Verwijder de PBS snel en laat de plaat niet in de PBS zitten. Voeg vervolgens voorzichtig een milliliter PBS-gentamycine toe en plaats de plaat gedurende één minuut in de 37 graden Celsius-incubator. Gebruik een P1000 pipet om de PBS met cellen te verzamelen in een 15 milliliter centrifugebuis.

Voeg vervolgens een milliliter trypsine toe aan de plaat en breng deze gedurende drie minuten terug naar de 37 graden Celsius-incubator. Tik voorzichtig op de platen om de myoblasten los te maken. Verzamel de trypsine met cellen en combineer met de PBS-collectie.

Voeg acht milliliter myoblast media toe aan de centrifugebuis en draai voorzichtig om om te mengen. Leg voorzichtig twee milliliter beplatingsoplossing op de spierplaten en breng de platen terug naar de 37 graden Celsius incubator. Draai de centrifugebuizen met cellen in een centrifuge gedurende drie minuten op 200 keer g.

Aspirate de supernatant en houd ongeveer een milliliter in de buis. Voeg voorzichtig myoblast media toe, breng de cellen over naar de voorgecoate kolf en plaats de kolf in de 37 graden Celsius incubator. Aspirate de media van P0 myoblast T25 kolven.

Spoel de cellen kort met twee milliliter warme PBS-gentamycine en spoel de PBS uit de kolf aan. Pipette twee milliliter warme PBS in elke kolf met myoblasten. Plaats de kolven met PBS drie minuten in de 37 graden Celsius incubator.

Tik vervolgens stevig op de zijkant van de kolf om de cellen los te maken. Controleer onder een lichtmicroscoop op vrij zwevende myoblasten. Plaats de kolven rechtop in een weefselkweekkap en spoel de onderkant van de kolven met 10 milliliter myoblast media twee tot drie keer om ervoor te zorgen dat alle cellen worden losgemaakt.

Verzamel de cel media mengsel in een 15 milliliter centrifuge buis. Centrifuge gedurende drie minuten op 200 keer g. Aspirate de media te laten ongeveer een milliliter in de buis voorzichtig om de cel pellet te voorkomen.

Voeg voorzichtig een passend volume van myoblast media toe aan de centrifugebuis en meng voorzichtig. Verdeel het celmengsel over nieuwe T75-kolven per stuk. Voeg 10 milliliter myoblast media toe aan elke nieuwe T75-kolf.

Schud de kolven voorzichtig horizontaal om de cellen te verdelen en plaats ze 's nachts op 37 graden Celsius in de couveuse. In dit protocol kwamen primaire cellen uit de explants naar voren onder een standaard lichtmicroscoop. Vroege oogsten van myoblasten verschenen als kleine ronde en heldere bollen.

Differentiatie van myoblasten duurde vier tot zes dagen waarin de morfologie van de cellen veranderde van enkele ronde bollen naar langwerpige gesmolten lange multi-nucleated vezels. Volledig gedifferentieerde myotubes werden opgeleverd die klaar waren voor het meten van het zuurstofverbruik. Deze cellen kunnen worden gebruikt voor een aantal downstream toepassingen.

We gebruiken ze bijvoorbeeld vaak om substraatflux in Seahorse-instrumenten te bestuderen.