Het volgen van superparamagnetische ijzer oxide-gelabelde mesenchymale stamcellen met behulp van MRI na intranasale levering in een traumatisch hersenletsel Murine model

Deze methode kan helpen bij het bepalen van de basisverdeling van de lobitic stamcel na intranasale levering aan de hersenen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat vergemakkelijkt de niet-invasieve levering en het bijhouden van mesenchymale stamcellen naar de hersenen. Ook, de meerdere doseringen zijn mogelijk om de therapeutische effecten van de getransplanteerde cellen te maximaliseren in het chronische stadium na de verwondingen.

Deze techniek maximaliseert het aantal cellen geleverd aan de plaats van letsel en minimaliseert de progressie van lobitic cel in andere weefsels. Hoewel deze techniek inzicht geeft in het gebruik van mesenchymale stamcellen in traumatische hersenletseltherapieën, kan het ook worden gebruikt voor het onderzoek naar niet-traumatisch hersenletsel. Voor mesenchymale stamcel etikettering met super paramagnetic ijzeroxide, voeg zes milliliter van etikettering medium tot een 80%confluent mesenchymale stamcel cultuur in een T 75 kolf voor een 24-uurs incubatie bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide.

De volgende dag, zorgvuldig aspirate de super natant en was de cellen twee keer met zes milliliter PBS per wasbeurt. Om te bepalen of de cellen met succes zijn gelabeld, controleer de cultuur onder een fluorescerende microscoop. Om een CCI-letsel op te wekken, gebruik je na het bevestigen van een gebrek aan reactie op de pedaalreflex elektronische tondeuses om de vacht van het rugoppervlak van de schedel te scheren en het geschoren gebied meerdere malen schoon te maken met een steriel wattenstaafje gedrenkt in jodium.

Gebruik een wattenstaafje gedrenkt in 70%ethanol om het jodium na het laatste wattenstaafje te verwijderen en het dier in een stereotactisch frame te plaatsen. Zet de muis vast met het oor en de neus bars en maak een 2,5 centimeter midsagittale incisie in de geschoren huid om toegang te krijgen tot het oppervlak van de schedel. Gebruik een wattenschijfje om het weefsel dat de schedel bedekt te verwijderen en het oppervlak van de schedel gedurende 10 seconden schoon te maken met een wattenstaafje gedrenkt met 3%waterstofperoxide.

Droog de schedel met een vers wattenschijfje en gebruik een potlood om een cirkel van vier millimeter rond de coördinaten van keuze op het blootgestelde bot te tekenen. Met behulp van een micro boor uitgerust met een 0,5 millimeter diameter ronde boer, zorgvuldig dun de schedel op de gemarkeerde cirkel zonder druk uit te oefenen. Verwijder alle botstof met een schoon en droog wattenstaafje en gebruik steriele gevijfde tangen om de resulterende botflap zorgvuldig te verwijderen.

Wanneer de dura mater is blootgesteld, breng de muis in het stereotactische frame van het CCI-apparaat en bevestig het dier met het oor en de neus bars, zodat het hoofd is niveau in de rostrocaudal richting. Na de instructies op de controlebox, nul de impactor tip aan de blootgestelde corticale oppervlak met behulp van de X en Y controle wielen op de basis van het botslichaam om de impactor tip direct boven de gewenste cortex coördinaten worden beïnvloed uit te lijnen. Gebruik de controlebox om de experimentparameters in te stellen op een snelheid van vijf meter per seconde, een verblijfstijd van 250 milliseconden en een letseldiepte van één millimeter om een lichte verwonding op te wekken.

Druk vervolgens op de slagknop op het controlevak. Wattenstaaf alle bloeden die optreedt met een steriele wattenstaafje en verwijder de muis uit het frame. Sluit de incisie met zijde chirurgische hechtingen en breng actuele antibiotica toe op de site voordat u de muis op een verwarmingskussen plaatst met monitoring tot volledige recumbency.

Een dag na de verwonding, behandel de super paramagnetic ijzeroxide gelabeld mesenchymale stamcelcultuur met drie milliliter trypsine. Na vijf minuten bij 37 graden Celsius, start de reactie met zeven milliliter voorverwarmd DMEM-medium, aangevuld met 10% foetale runderserum en verzamel de celsuspensie in een conische buis van 15 milliliter. Sediment de cellen door centrifugatie en opnieuw op te schorten de pellet in PBS voor het tellen.

Pas vervolgens de celconcentratie aan op 1,5 keer 10 tot de vijf cellen per 18 microliter PBS. Voor cellevering, na bevestiging van het gebrek aan respons op teenknijpen, scruffeert de muis terwijl de schedel wordt geïmmobiliseerd. Plaats de punt van een pipet met vier eenheden hyaluronidase per microliter PBS in de buurt van de nare van de muis onder een hoek van 45 graden, en beheer drie microliters van hyaluronidase suspensie in elk neusgat.

Plaats het dier vijf minuten lang met het gezicht op een schone pad voordat u de behandeling vier keer herhaalt voor een totaal van 100 eenheden hyaluronidasebehandeling. Na de laatste behandeling, plaats de muis terug op de pad voor 30 minuten, voordat de muis zoals net aangetoond. Met het hoofd geïmmobiliseerd, beheren drie microliters van de mesenchymale stamcel suspensie in elk neusgat over een periode van drie seconden per oplossing levering, waarbij de muis in positie voor 30 seconden totdat de monster druppels volledig zijn verdwenen.

Herhaal de levering na twee minuten tot drie keer totdat het volledige volume mesenchymale stamcel is geleverd. Breng de muis vervolgens terug naar zijn kooi met controle tot volledige recumbency. Om de migratie van de mesenchymale stamcellen door MRI te volgen, plaatst u de verdoofde muis op de beeldhouder van de MR-imager.

Zet het dier vervolgens op zijn plaats en verplaats de houder naar het midden van de MRI-spoel. Stel de herhalingstijd in op 1500 milliseconden en de echotijd op 2,8 milliseconden. Stel vervolgens het gezichtsveld in op 16 bij 16 millimeter, de aanschafmatrix op 128 bij 128 en de snijdikte op 0,75 bij 0,8 millimeter met vier signaalgemiddelden en een fliphoek van 90 graden om T2-stergewogen scans te verkrijgen met behulp van een spinchonopvolging.

Nadat u de scans hebt voltooid, trekt u de muishouder uit het MRI-spoelcentrum en keert u de muis terug naar zijn kooi met controle tot volledige recumbency. Als u de gelabelde mesenchymale stamcellen op de T2-stergewogen afbeeldingen wilt bijhouden en kwantificeren, opent u de gegevens in de snap-software voor it-case snap en selecteert u actief label. Als u segmentaties wilt maken van de hypointensegebieden en de laesie of andere hersendelen van belang, met behulp van verschillende labelkleuren voor elk segment.

Gebruik het veelhoekgereedschap in de hoofdgereedschapsbalk om de hypointensegebieden te selecteren die de superparamagnetische ijzeroxide met het label mesenchymale stamcellen vertegenwoordigen en klik op accepteren. De gesegmenteerde gebieden worden weergegeven in dezelfde kleur als het actieve label dat aan dat specifieke segment is toegewezen. Wanneer alle segmenten zijn gesegmenteerd, gebruik dan het scalpelgereedschap om een 3D-kaart van de gesegmenteerde gebieden te ontwikkelen om de mesenchymale stamceldistributie in de hele hersenen weer te geven.

Als u een kwantitatieve analyse wilt uitvoeren van het volume- en intensiteitsgete van de gesegmenteerde hypointensegebieden die de gelabelde cellen vertegenwoordigen, klikt u op segmentatie en selecteert u volume en statistieken. 24 uur na intranasale levering worden superparamagnetische ijzeroxide gelabeld mesenchymale stamcellen gedetecteerd als sterke hypointense gebieden die bemiddelen bij de corticale verwonding op T2-stergewogen beelden, wat wijst op de gerichte migratie van superparamagnetische ijzeroxide naar de letselplaats. Deze migratie blijft zichtbaar tot 14 dagen na levering zonder merkbare vermindering van het signaal.

Gewonde dieren die met PBS zijn behandeld, vertonen op geen enkel moment hypointense-gebieden, wat aangeeft dat de waargenomen hypointensegebieden overeenkomen met het superparamagnetische ijzeroxide met het label mesenchymale stamcellen en zijn niet te wijten aan signaalartefacten. De bio-verdeling van de gelabelde mesenchymale stamcellen kan worden gevisualiseerd met behulp van 3D-reconstructie, histologisch door Pruisische blauwe vlekken, of door florescentie detectie van FITC gelabeld super paramagnetic ijzeroxide binnen de gelabelde mesenchymale stamcellen. Zorg ervoor dat u de MRI-resultaten valideert met esthologie of andere methoden.

Als super magnetische ijzeroxide deeltjes kunnen blijven in weefsels na de cel sterft, wat leidt tot vals-positieve signalen. Na deze procedure kan mogelijke gematigde niet-invasieve tracking in kwantificering worden toegepast om vragen te beantwoorden over het honen van de vaardigheden en het behoud van mesenchymale stamcellen in de hersenen. Na deze ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van regeneratieve geneeskunde om methoden te verkennen voor het verbeteren van cel honen naar specifieke gebieden van de hersenen.