Karakterisering van Amyloïde Structuren in Aging C. Elegans met behulp van Fluorescentie Lifetime Imaging
March 27th, 2020
Fluorescentie levenslange beeldvorming monitoren, kwantificeert en onderscheidt de aggregatie tendensen van eiwitten in het leven, veroudering, en benadrukt C. elegans ziekte modellen.
De methode stelt ons in staat om geïntegreerde amyloïde eiwitstructuren duidelijk te onderscheiden van de oplosbare en zelfs geaccumuleerde tegenhangers. De techniek wordt in vivo uitgevoerd op een niet-invasieve manier met weinig of geen toxische bijwerkingen. Omdat het afhangt van de fluorescerende eigenschappen van de fluorofofof zelf, is het zeer robuust en reproduceerbaar na verloop van tijd.
FLIM is gebruikt op het gebied van kankerdiagnose. We gebruiken het echter om de basismechanismen van eiwitaggregatie te bestuderen die inderdaad relevant zijn voor neurodegeneratieve ziekten. De methodologie kan worden gebruikt op het gebied van eiwitaggregatie.
Zolang de ziekte geassocieerde eiwit is gelabeld met een fluorescerende sonde, het kan worden gevolgd en gecontroleerd na verloop van tijd. Verbindingen en strategieën die aggregatie bevorderen of voorkomen, kunnen met succes worden bestudeerd. Elk biologisch systeem dat het mogelijk maakt om te worden gevisualiseerd door lichtmicroscopie is geschikt voor FLIM, hetzij in vivo of ex vivo, bijvoorbeeld in celkweek, in gefixeerde of door middelgrote monsters en in alle benodigde middelen.
Zorg ervoor dat u de eigenschappen van uw geselecteerde fluorofolaat in de aaltjes test voordat u experimentele gegevens verkrijgt en test of de installatie volledig functioneel is voordat u metingen verwerft. Om te beginnen, groeien en onderhouden van aaltjes op 20 graden Celsius op NGM platen. Leeftijd de aaltjes tot dag vier van het leven als de jonge volwassenen en dag acht van het leven als de oude volwassenen.
Op de dag van de beeldvorming, beginnen met het voorbereiden van de beeldvorming dia's. Plaats agarose en dubbel gedestilleerd water bij een volumeconcentratie van 3%. Breng het in een magnetron te smelten en laat het dan iets afkoelen.
Snijd de punt van een een milliliter pipet tip en neem ongeveer 200 microliter van de gesmolten agarose. Pipette de agarose op een schone glazen glijbaan en onmiddellijk plaats een tweede op de top het vermijden van de vorming van eventuele bubbels. Laat de glijbanen drogen en verwijder voorzichtig de bovenste glazen schuif.
Het resultaat is een glazen schuif met een gelijkmatig egaal oppervlak waar de aaltjes worden geplaatst. Zodra de imaging setup is klaar voor gebruik, werken onder een stereo microscoop, plaats een 10 microliter druppel van verdovingsstof op een agarose pad en voorzichtig overdracht vijf tot 10 aaltjes in. Gebruik een wimperpunt om de aaltjes te scheiden.
Houd ze dicht bij elkaar, maar niet aanraken om gemakkelijker lokalisatie van de aaltjes tijdens het verwerven van afbeeldingen mogelijk te maken. Leg de aaltjes voorzichtig over met een coverslip. Neem binnen een uur na montage metingen.
Zorg ervoor dat de aaltjes volledig onbeweeglijk zijn. Open de FLIM acquisitie software. Zoek de tabknop en druk op uitvoer.
Plaats de dia met de gemonteerde C.elegans op het podium en gebruik een 10X vergrotingslens in transmissiemodus, lokaliseer de positie van de aaltjes op de dia. Verwijder de dia, schakel de doelstelling om naar een 63X vergrotingslens en breng het vereiste onderdompelingsmedium aan. Plaats de dia op het podium en lokaliseer de aaltjes.
Begin met het scannen van het monster. Selecteer een interessegebied en focus op het maximale projectievlak. Bekijk op de interface van de FLIM-software het aantal gedetecteerde fotonen.
De ADC-waarde moet tussen één keer 10 tot de vierde en één keer 10 tot de vijfde liggen. Verleg indien nodig de focus op een ander vlak of verhoog de laserkracht om meer fotonen te verzamelen. Zorg ervoor dat u foton stapelen te voorkomen, maar het verzamelen van een voldoende hoeveelheid fotonen om een goede levensduur fit en meting te creëren.
Selecteer op de menubalk het tabblad om de acquisitieparameters in te stellen. Selecteer scansynchronisatie om detectie van één foton mogelijk te maken. Stel de overname in op een vaste tijd of een vast aantal fotonen.
Druk beginnen met acquisitie. Open de software en importeer FLIM-gegevensbestanden via bestand, laad FLIM-gegevens. Laad alle monsters van één voorwaarde, zelfs als het in verschillende sessies en uit verschillende biologische herhalingen wordt verkregen.
Indien nodig, segmenteren om nematode signaal voor veel FLIM beeld via segmentatie, segmentatie manager. Sleep het bijsnijdgereedschap rond het interessegebied totdat het is gemarkeerd. Druk op OK, druk op OK. Selecteer een klein gebied waar de op intensiteit gebaseerde afbeelding van een C.elegans wordt weergegeven.
De vervalcurve van dat gebied verschijnt in het grote vervalvenster aan de rechterkant van de interface. Om de levensduur te extrapoleren, stelt u op het tabblad gegevens een willekeurige geïntegreerde minimumwaarde in tussen 40 tot 300 om pixels uit te sluiten die te zwak zijn om een goede pasvorm te produceren. Selecteer een tijdsminimum en een maximum aantal tijd om het FLIM-signaal tot deze waarden te beperken.
Wijzig het vooraf ingestelde aantal foton van één niet. Voer de herhalingssnelheid in megahertz van de laser gebruikt tijdens de overname. Voer een maximale poortwaarde in om alle verzadigde pixels uit te sluiten.
Selecteer op het tabblad Levensduur een globale fitting die moet worden gebruikt. Wijzig geen andere parameter, behalve het aantal exponentiële selectie als bekend is dat het gekozen fluorescentieverval multi-exponentieel is en meer dan één levensduur vertoont. Upload de IRF via het IRF-menu.
Als u de IRF-shift wilt schatten, selecteert u IRF, schat u de IRF-verschuiving. Er wordt automatisch een set waarden weergegeven op het tabblad IRF. Zodra dit is vastgesteld, mag u geen andere parameters van dit tabblad wijzigen.
Zodra alle parameters zijn ingesteld, drukt u op fit dataset. De resulterende pasvorm die in een blauwe lijn wordt gemarkeerd, moet overlappen met alle gebeurtenissen. Een goede pasvorm wordt verkregen wanneer alle gebeurtenissen langs de pasvorm worden uitgelijnd.
Klik op het tabblad parameters in de rechterbovenhoek van de interface van de software en selecteer statistiek, gewogen gemiddelde en controleer of de vierkante waarde van de chi zo dicht mogelijk bij een waarde is. De levensduurwaarde van de geselecteerde afbeelding wordt dus onthuld als tau one. Exporteer alle informatie van belang via bestand, export intensiteit beelden, fit resultaat tabel, afbeeldingen, histogrammen.
Representatieve kaarten van C.elegans die gespierde Q40 RFP uitdrukken op dag vier of dag acht van het leven worden hier getoond. De langere Q-rek van de IQ85 was meer vatbaar voor aggregatie en vertoonde een fluorescentie levenslange verschuiving in het histogram al op dag vier van het leven. In feite, op dag vier, foci vorming werd waargenomen voor IQ85, terwijl nog steeds afwezig in IQ44.
Bij veroudering vertoonde IQ44 echter ook focivorming en dus een verminderde fluorescentieleven. Ten slotte werd focivorming niet gedetecteerd, noch was een verminderde fluorescentieleven in de NQ40CFP-stam. Voor deze stam, waren er slechts subtiele niet-significante veranderingen in de gemiddelde fluorescentie leven bij veroudering.
Zodra het nematodemodel is vastgesteld, is de hoeveelheid ingezameld foton van het grootste belang om een goede levenslange pasvorm te verkrijgen. De methode kan verder worden samengevoegd met verschillende technieken, zoals Forster resonantie energieoverdracht, FRET, fluorescentieherstel na fotobleaching, FRAP of meting. Al deze aanpassingen geven extra informatie over de eigenschappen van de eiwitstudies en de geaggregeerde vorm.
Op het gebied van eiwitaggregatie en eiwithomeostase, de techniek toegestaan om elke verstoring opgelegd aan het systeem, de distributie van verschillende eiwitsoorten, en de handel en in het algemeen het verschil en de betekenis van oplosbare en onoplosbare eiwitfracties binnen het levende organisme te onderzoeken. De verdovings natrium azide is giftig en moet worden behandeld met handschoenen en bril en verdund onder een rookkap. Omdat de techniek op microscopie is gebaseerd, is het belangrijk om alle waarschuwingen met betrekking tot het werken met lasers te volgen.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie maakt gebruik van fluorescentielevensduurbeeldvorming (FLIM) om eiwitaggregatie in levende C. elegans-modellen te monitoren en kwantificeren. De techniek maakt niet-invasieve observatie van eiwitstructuren mogelijk die relevant zijn voor neurodegeneratieve ziekten.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Biofysica
- Celbiologie
Achtergrond
- Eiwitaggregatie is een belangrijk kenmerk bij neurodegeneratieve ziekten.
- FLIM biedt een methode om onderscheid te maken tussen verschillende eiwittoestanden.
- De techniek wordt in vivo uitgevoerd met minimale toxiciteit.
- FLIM heeft toepassingen buiten de neurowetenschap, inclusief kankerdiagnose.
Doel van het onderzoek
- Om de mechanismen van eiwitaggregatie te onderzoeken.
- Om onderscheid te maken tussen geïntegreerde amyloïdestructuren en oplosbare eiwitten.
- Om FLIM toe te passen in de context van veroudering en stress in C. elegans-modellen.
Gebruikte methoden
- Fluorescentielevensduurbeeldvorming (FLIM)
- In vivo beeldvorming van C. elegans
- Niet-invasieve observatietechnieken
- Analyse van de dynamische processen van eiwitaggregatie
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle differentiatie van amyloïde-eiwitstructuren van oplosbare tegenhangers.
- Aangetoond robuustheid en reproduceerbaarheid van FLIM over tijd.
- Benadrukt de relevantie van eiwitaggregatie voor neurodegeneratieve ziekten.
- Toonde minimale toxische bijwerkingen van de beeldvormingstechniek.
Conclusies
- FLIM is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van eiwitaggregatie in levende organismen.
- De methode kan het begrip van de mechanismen van neurodegeneratieve ziekten verbeteren.
- Toekomstige toepassingen kunnen zich uitstrekken naar andere gebieden, inclusief kankeronderzoek.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Fluorescence lifetime imaging (FLIM) enables noninvasive, quantitative monitoring of amyloid fibrilization in living models, supporting target validation and mechanistic de-risking in neurodegenerative disease programs. By distinguishing integrated amyloid structures from soluble species without staining, FLIM provides predictive confidence in early discovery workflows. The method’s robustness and reproducibility facilitate cross-functional collaboration and scalable assay development for protein homeostasis research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by distinguishing amyloid fibrils from soluble and accumulated protein species in vivo.
- Operational Value: Supports biological de-risking through quantitative, fluorescence-lifetime-based readouts that correlate directly with aggregation levels.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by allowing comparison of fibrilization across genetic backgrounds, environmental stimuli, or amyloid variants.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by enabling label-free, longitudinal tracking of protein aggregation in specific cells such as neurons.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through FLIM’s independence from fluorophore expression levels and resistance to photobleaching.
- Scalability: Enables reliable compound evaluation by detecting aggregation-promoting or -preventing strategies in any light-microscopy-compatible biological system.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery through preclinical validation by monitoring aggregation dynamics across aging and proteostasis network perturbations in disease-relevant models.
- Risk-Adjusted Decisions: Supports advancement decisions by quantifying soluble versus insoluble protein fractions in living organisms over time.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive value when studying protein homeostasis, enabling comparison of trafficking and distribution of protein species without further staining.
Pipeline & Workflow Integration
FLIM integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical studies by providing quantitative, noninvasive readouts of protein aggregation in living systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling visualization of amyloid structures in specific cells such as neurons during aging.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs through photon collection and lifetime fitting that exclude dim pixels and saturated signals for robust measurements.
- Analytics: Provides statistical outputs such as chi-square values near one and weighted mean lifetime (tau one) to compare conditions and assess fit quality.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling observation of aggregation in aging models and upon proteostasis network perturbation, relevant to neurodegenerative disease mechanisms.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for comparing fibrilization across different amyloid proteins, genetic backgrounds, or environmental stimuli in vivo.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in protein aggregation studies.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of amyloid detection in vivo without staining or bleaching.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early detection of aggregation propensity.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative, longitudinal aggregation data in disease-relevant models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence lifetime imaging and laser safety protocols.
- Needs FLIM-capable microscopy setup with appropriate objectives (e.g., 63X immersion) and photon detection capabilities.
- Demands cross-team standardization of acquisition parameters such as scan sync, repetition rate, gate max, and photon collection thresholds (10⁴–10⁵ ADC).
- Involves adaptation considerations across model systems, including agarose pad preparation, anesthetic use (e.g., sodium azide), and immobilization protocols.
- Includes practical limitations such as the need to pre-test fluorophore properties in the nematode model and avoid photon pileup during acquisition.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:25
Synchronization of C. elegans and Mounting Nematodes onto Microscopy Slides
2:58
Acquisition of FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) Data
4:32
Analysis of FLIM Data Using FLIMfit Software
7:15
Results: Fluorescence Lifetimes
8:15
Conclusion
