Beeldvorming en kwantificering van mitochondriale morfologie in C. elegans tijdens veroudering

Dit protocol biedt een gestandaardiseerde benadering om de veranderingen in mitochondriale morfologie over meerdere weefsels in beeld te brengen en te kwantificeren. In C elegance wordt mitochondriale morfologie vaak geassocieerd met de functionaliteit ervan. Veranderingen in de mitochondriale morfologie kunnen worden waargenomen onder verschillende ziektetoestanden en met de progressie van veroudering, die vaak correleren met ontregeling in de mitochondriale functie, Verschillende weefsels en zie elegantie.

Vertoon unieke mitochondriale structuren die verschillende beeldvormingsstrategieën vereisen. Daarom is het selecteren van een geschikte microscoop en het optimaliseren van de monstervoorbereiding essentieel voor succesvolle weefselspecifieke beeldvorming van mitochondriën en C Elegance. Hier hebben we ervoor gekozen om de transgene cele-stammen te gebruiken die mitochondriale gelokaliseerde GFP tot expressie brengen in plaats van conventionele mitochondriale kleurstoffen.

Dit stelt ons in staat om off-target-effecten, onale bi-penetrantie en de complexe monstervoorbereidingsstappen te vermijden die nodig zijn om mitochondriën in verschillende weefsels te visualiseren met behulp van een kleurstof. De primaire focus van ons lab is het bestuderen van mitochondriale homeostase tijdens stress en veroudering. Het standaardiseren van een mitochondriaal beeldvormingsprotocol is essentieel om extramentale fouten te minimaliseren en reproduceerbare resultaten te genereren met betrekking tot veranderingen in de mitochondriale morfologie onder verschillende biologische omstandigheden.

Zorg om te beginnen voor schone glazen dia's. Voeg voor de monstervoorbereiding 10 tot 20 microliter M nine-oplossing toe aan het glasplaatje en plaats het gewenste aantal volwassen wormen op specifieke leeftijden in de oplossing. Bedek op de dia de wormen in de M nine-oplossing met een afdekglas om de spier in beeld te brengen.

Mitochondriën, duw tegen het dekglaasje om de wormen te rollen. Sluit vervolgens met een nagellak de zijkanten van het dekglas af om verdamping van de M nine-oplossing te voorkomen. Gebruik een standaard groothoekmicroscoop om spier- en epidermale mitochondriën af te beelden die de fluorescerende tags tot expressie brengen.

Gebruik een confocale microscoop voor het in beeld brengen van de darmmitochondriën en optimaliseer de beeldvormingsinstellingen voor de specifieke experimentele opstelling. Om de analyse te starten, opent u de Fiji-applicatie na installatie om de mito mapper-macro te downloaden en te installeren. Download eerst de broncode.

Kopieer de code die wordt vermeld onder Een IJM-code voor MIT mapper 1.0. Open Fiji en ga naar plug-ins, gevolgd door nieuw en macro plak de gekopieerde code in het macrovenster. Sla de macro vervolgens op voor toekomstig gebruik via bestand en sla op als.

Navigeer naar het bestand en open vervolgens voor het openen van een 3D-microscopisch beeld met Zs.In Fiji, maak een maximale projectie onder afbeelding, gevolgd door stapels en Z-project. Selecteer het bereik van segmenten in scherpgestelde afbeeldingen voor maximale projectie en kies maximale intensiteit als projectietype om het maximale geprojecteerde beeld op te slaan. Ga als tiff naar bestand en klik op opslaan zoals gevolgd door tiff.

Snijd de interessegebieden bij uit de volledige afbeelding met de rechthoekige tool en navigeer naar afbeelding en bijsnijden. Ga naar het bestand, gevolgd door opslaan als en tiff om de bijgesneden afbeelding in Tiff-formaat op te slaan. Sleep de eerder opgeslagen mito-kaart of het macrobestand naar de werkbalk van Fiji.

Klik op uitvoeren. Selecteer desgevraagd de map met het TIFF-bestand dat in de vorige stap is opgeslagen. Wanneer u wordt gevraagd om een gebied te selecteren, maakt u een rechthoek in de afbeelding met behulp van de rechthoektool en drukt u op OK om te bevestigen.

Ga ten slotte naar het bestand en sla de gegevens met alle waarden met betrekking tot mitochondriale morfologie op als een dot CSV-bestand. Mitochondriale morfologie was weefselspecifiek met tubulaire mitochondriën die uitgelijnd waren met spiervezels in spieren die met elkaar verbonden webachtige structuren in de darm waren, en meer afgerond of ovaal. Mitochondriën in de hypodermis beeldvorming met een confocale microscoop verbeterden de visualisatie van darmmitochondriën door onscherp licht te verminderen in vergelijking met samengestelde microscopie.

Op dia's vertoonden mitochondriën fragmentatie na 30 minuten in de M nine-buffer, waarbij epidermale mitochondriën de meest prominente fragmentatie vertoonden. Veroudering resulteerde in mitochondriale fragmentatie in alle weefsels die eruitzagen als afgekapte en bolvormige structuren. Kwantificering van de MIT-mapper gaf aan dat de objectlengte veranderde in spieren en het verbindingspunt veranderde in de hypodermis.