Beeldvorming en kwantificering van mitochondriale morfologie in C. elegans tijdens veroudering
17 januari 2025
Dit protocol biedt een gestandaardiseerde benadering voor het in beeld brengen van de mitochondriale morfologie in meerdere weefsels van C. elegans tijdens veroudering.
Dit protocol biedt een gestandaardiseerde benadering om de veranderingen in mitochondriale morfologie over meerdere weefsels in beeld te brengen en te kwantificeren. In C elegance wordt mitochondriale morfologie vaak geassocieerd met de functionaliteit ervan. Veranderingen in de mitochondriale morfologie kunnen worden waargenomen onder verschillende ziektetoestanden en met de progressie van veroudering, die vaak correleren met ontregeling in de mitochondriale functie, Verschillende weefsels en zie elegantie.
Vertoon unieke mitochondriale structuren die verschillende beeldvormingsstrategieën vereisen. Daarom is het selecteren van een geschikte microscoop en het optimaliseren van de monstervoorbereiding essentieel voor succesvolle weefselspecifieke beeldvorming van mitochondriën en C Elegance. Hier hebben we ervoor gekozen om de transgene cele-stammen te gebruiken die mitochondriale gelokaliseerde GFP tot expressie brengen in plaats van conventionele mitochondriale kleurstoffen.
Dit stelt ons in staat om off-target-effecten, onale bi-penetrantie en de complexe monstervoorbereidingsstappen te vermijden die nodig zijn om mitochondriën in verschillende weefsels te visualiseren met behulp van een kleurstof. De primaire focus van ons lab is het bestuderen van mitochondriale homeostase tijdens stress en veroudering. Het standaardiseren van een mitochondriaal beeldvormingsprotocol is essentieel om extramentale fouten te minimaliseren en reproduceerbare resultaten te genereren met betrekking tot veranderingen in de mitochondriale morfologie onder verschillende biologische omstandigheden.
Zorg om te beginnen voor schone glazen dia's. Voeg voor de monstervoorbereiding 10 tot 20 microliter M nine-oplossing toe aan het glasplaatje en plaats het gewenste aantal volwassen wormen op specifieke leeftijden in de oplossing. Bedek op de dia de wormen in de M nine-oplossing met een afdekglas om de spier in beeld te brengen.
Mitochondriën, duw tegen het dekglaasje om de wormen te rollen. Sluit vervolgens met een nagellak de zijkanten van het dekglas af om verdamping van de M nine-oplossing te voorkomen. Gebruik een standaard groothoekmicroscoop om spier- en epidermale mitochondriën af te beelden die de fluorescerende tags tot expressie brengen.
Gebruik een confocale microscoop voor het in beeld brengen van de darmmitochondriën en optimaliseer de beeldvormingsinstellingen voor de specifieke experimentele opstelling. Om de analyse te starten, opent u de Fiji-applicatie na installatie om de mito mapper-macro te downloaden en te installeren. Download eerst de broncode.
Kopieer de code die wordt vermeld onder Een IJM-code voor MIT mapper 1.0. Open Fiji en ga naar plug-ins, gevolgd door nieuw en macro plak de gekopieerde code in het macrovenster. Sla de macro vervolgens op voor toekomstig gebruik via bestand en sla op als.
Navigeer naar het bestand en open vervolgens voor het openen van een 3D-microscopisch beeld met Zs.In Fiji, maak een maximale projectie onder afbeelding, gevolgd door stapels en Z-project. Selecteer het bereik van segmenten in scherpgestelde afbeeldingen voor maximale projectie en kies maximale intensiteit als projectietype om het maximale geprojecteerde beeld op te slaan. Ga als tiff naar bestand en klik op opslaan zoals gevolgd door tiff.
Snijd de interessegebieden bij uit de volledige afbeelding met de rechthoekige tool en navigeer naar afbeelding en bijsnijden. Ga naar het bestand, gevolgd door opslaan als en tiff om de bijgesneden afbeelding in Tiff-formaat op te slaan. Sleep de eerder opgeslagen mito-kaart of het macrobestand naar de werkbalk van Fiji.
Klik op uitvoeren. Selecteer desgevraagd de map met het TIFF-bestand dat in de vorige stap is opgeslagen. Wanneer u wordt gevraagd om een gebied te selecteren, maakt u een rechthoek in de afbeelding met behulp van de rechthoektool en drukt u op OK om te bevestigen.
Ga ten slotte naar het bestand en sla de gegevens met alle waarden met betrekking tot mitochondriale morfologie op als een dot CSV-bestand. Mitochondriale morfologie was weefselspecifiek met tubulaire mitochondriën die uitgelijnd waren met spiervezels in spieren die met elkaar verbonden webachtige structuren in de darm waren, en meer afgerond of ovaal. Mitochondriën in de hypodermis beeldvorming met een confocale microscoop verbeterden de visualisatie van darmmitochondriën door onscherp licht te verminderen in vergelijking met samengestelde microscopie.
Op dia's vertoonden mitochondriën fragmentatie na 30 minuten in de M nine-buffer, waarbij epidermale mitochondriën de meest prominente fragmentatie vertoonden. Veroudering resulteerde in mitochondriale fragmentatie in alle weefsels die eruitzagen als afgekapte en bolvormige structuren. Kwantificering van de MIT-mapper gaf aan dat de objectlengte veranderde in spieren en het verbindingspunt veranderde in de hypodermis.
Overzicht
Dit protocol stelt een gestandaardiseerde methode vast voor het visualiseren en kwantificeren van mitochondriale morfologie in C. elegans in verschillende weefsels tijdens het verouderingsproces. De studie benadrukt de relatie tussen mitochondriale structuur en functionaliteit, en laat zien hoe veranderingen in morfologie optreden als reactie op veroudering en ziekte.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Onderzoeksgebied
- Mitochondriale morfologie
- Veroudering
- C. elegans als modelorganisme
Achtergrond
- Mitochondriale morfologie is cruciaal voor zijn functie.
- Veranderingen kunnen duiden op ziektetoestanden en de progressie van veroudering.
- Verschillende weefsels in C. elegans vereisen unieke benaderingen voor beeldvorming.
Gebruikte methoden
- Fluorescente beeldvorming met behulp van transgene C. elegans die mitochondriaal-gelocaliseerde GFP tot expressie brengen.
- C. elegans
- Breedveld- en confocale microscopie voor weefselspecifieke beeldvorming.
Belangrijkste resultaten
- Weefselspecifieke mitochondriale morfologieën werden gedocumenteerd.
- Veroudering leidde tot waarneembare fragmentatie in alle weefsels.
- Kwantitatieve analyse onthulde significante veranderingen in mitochondriale structuur.
Conclusies
- De studie toont een betrouwbare methode aan voor het beoordelen van mitochondriale veranderingen in C. elegans.
- Het begrijpen van deze dynamiek kan verder onderzoek naar veroudering en mitochondriale disfunctie bevorderen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Quantitative imaging of mitochondrial morphology in C. elegans enables high-confidence assessment of organelle dynamics during aging, supporting early discovery and mechanistic de-risking in metabolic and age-related disease research. Standardized protocols and robust quantification reduce variability, enhancing predictive confidence for target validation and translational continuity. This approach strengthens portfolio decisions by providing reproducible, tissue-specific mitochondrial phenotyping across the discovery pipeline.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of mitochondrial structural changes linked to functional decline during aging.
- Supports biological de-risking by distinguishing tissue-specific mitochondrial phenotypes.
- Facilitates predictive confidence in target selection for metabolic and aging-related pathways.
Screening & Assay Development
- Provides validated, reproducible imaging protocols for downstream phenotypic screening.
- Standardizes quantification of mitochondrial morphology using single-copy GFP constructs and mitoMAPR analysis.
- Enables reliable comparison of compound or genetic perturbations on mitochondrial structure.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mitochondrial phenotypes in C. elegans with disease-relevant cellular changes observed in higher organisms.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling cross-tissue and cross-age comparisons.
- Reduces translational risk by providing quantitative, tissue-specific readouts of mitochondrial health.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical model validation, supporting robust mitochondrial phenotyping at each stage.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven assessment of mitochondrial dynamics and pathway clarification during aging.
- Screening: Delivers standardized, quantitative outputs for assay readiness and reproducibility.
- Analytics: Provides objective morphological measurements and CSV data for statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Facilitates alignment of mitochondrial biomarkers between C. elegans and mammalian systems when supported by data.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable imaging and analysis workflow adaptable to diverse tissues and experimental conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in mitochondrial research.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized imaging and analysis protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by minimizing experimental variability.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets and models based on robust mitochondrial phenotyping.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microscopy, transgenic C. elegans handling, and image analysis.
- Needs access to wide field and confocal microscopes, as well as Fiji software with mitoMAPR macro.
- Demands cross-team standardization of imaging parameters and sample preparation.
- Adaptable to multiple tissues but may require optimization for specific experimental setups.
- Potential limitations include tissue-specific imaging challenges and time-dependent morphological changes ex vivo.
