Een eenvoudige en effectieve methode om cardiomyocyten van muizen consequent te isoleren

Deze techniek is betrouwbaarder en efficiënter en vereist geen uitgebreide oefening of training in vergelijking met de meest gebruikte Langendorff-apparaattechnieken. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de ischemische tijd beperkt, omdat de initiële perfusie in vivo plaatsvindt. Tijdens het uitvoeren van deze techniek is het essentieel om bubbels in het spruitstuk te vermijden en overmatige beweging van het hart tijdens de spijsvertering te voorkomen, deze kunnen de opbrengst verminderen.

Sarah Sturgill, een afgestudeerde student in het laboratorium van Dr. Mark Ziolo, demonstreert deze techniek en zal deze techniek demonstreren. Begin met het opruimen van het temperatuurgeregelde spruitstuk met behulp van vers bereide perfusiebuffer. Om dit te doen, schroeft u een naald van 27 gauge in en verwijdert u de bellen met behulp van een luer lock-connector.

Zorg ervoor dat er geen bubbels achterblijven. Om de cardiomyocyt te isoleren, stelt u het borstbeen van de volledig verdoofde muis bloot en lateraal naar de middellijn, snijdt proximaal door de ribben en naar de oksel. Snijd vervolgens door het middenrif en zorg voor ondiepe sneden om het hart te vermijden.

Klem het borstbeen vast met een hemostat en vouw de ribben naar achteren om de borstholte bloot te leggen. Verwijder het hartzakje voorzichtig uit het hart voordat u de inferieure vena cava onmiddellijk distaal van het hart doorsnijdt. Injecteer drie milliliter ijskoude opruimbuffer in de rechterkamer van het hart gedurende één minuut met behulp van een naald van 27 gauge.

Houd vervolgens het hart vast met een pincet. Trek het weg van het lichaam en stel zoveel mogelijk van de aorta bloot. Klem vervolgens de opgaande aorta vast met behulp van een hemostat en snijd het hart weg.

Breng het geklemde hart snel over naar het deksel van een polypropyleen petrischaaltje met 10 milliliter warme perfusiebuffer. Plaats het geklemde hart in het ondersteunende platform en injecteer 10 milliliter temperatuurgecontroleerde perfusiebuffer bij 37 graden Celsius in de linker ventrikel gedurende vijf minuten met behulp van een gestabiliseerde naald van 27 gauge die aan het spruitstuk is bevestigd. Breng vervolgens het geklemde hart en het ondersteunende platform over naar een petrischaal met ongeveer vijf milliliter verteringsbuffer.

Wissel invoerspuiten in voor een spuit van 50 milliliter met 25 milliliter verteringsbuffer. Verwijder het spruitstuk van eventuele bubbels en de resterende perfusiebuffer vóór injectie. Vervang de naald voorzichtig in dezelfde naaldpositie in de linkerventrikeltop.

Injecteer met behulp van een perfusiepomp de verteringsbuffer van 37 graden Celsius gedurende 15 minuten in de linkerkamer met behulp van een spuit van 50 milliliter. Regel de temperatuur van de oplossing met een watermantel gekalibreerd om de oplossing van 37 graden Celsius uit te werpen. Verwijder de ventrikels uit de boezems voordat u ze overbrengt naar een bekerglas van 10 milliliter.

Voeg drie milliliter verteringsbuffer toe aan het bekerglas en snijd de ventrikels in grote stukken met een scherpe schaar. Bedek het bekerglas met aluminiumfolie en plaats het gedurende vijf minuten in een schudwaterbad voorverwarmd tot 37 graden Celsius. Na het weggooien van het supernatant, resuspensie de weefselbrokken in drie milliliter verteringsbuffer en trituleer het gedurende ongeveer vier minuten of totdat een homogeen mengsel is bereikt.

Als u klaar bent, filtert u de cellen in een polypropyleenbuis van 50 milliliter met behulp van een 70 micrometer nyloncelzeef. Was nylon celzeef met drie milliliter verteringsbuffer. Breng het filtraat terug naar een polypropyleenbuis met ronde bodem van 14 milliliter en centrifugeer het.

Gooi het supernatant weg voordat u de pellet opnieuw in drie milliliter stopbuffer plaatst. Voeg aan de celsuspensie 54 microliter 100 millimolaire calciumchloridevoorraad toe om de uiteindelijke calciumchlorideconcentratie 1,8 millimolair te maken. Laat de levende cellen 10 minuten bezinken en verwijder het supernatant met dode cellen.

Na het opnieuw suspenderen van de pellet in een opslagoplossing, kunnen de cellen worden gebruikt voor functionele experimenten en culturen. Brightfield-microscoopbeelden van geïsoleerde cellen toonden aan dat de isolatie van cardiomyocyten van muizen staafvormige rustcellen produceerde zonder membraanblebs of afgeronde randen. De cellen vertoonden ongeveer 80% opbrengst en hoge overlevingskansen die het succes van de isolatietechniek bepaalden.

Voor een succesvolle isolatie is het het belangrijkst om de bellen uit het spruitstuk te verwijderen en de naald in hetzelfde gat in het hart te steken. Eenmaal geïsoleerd, kunnen de cardiomyocyten worden gebruikt voor cellulaire en moleculaire functionele experimenten.