Name: Een eenvoudige en effectieve methode om cardiomyocyten van muizen consequent te isoleren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: Leer een betrouwbare methode voor het isoleren van muizen-cardiomyocyten met in vivo-perfusie om ischemische tijd te beperken. Deze techniek verbetert de opbrengst en vereist minder training dan traditionele methoden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health Grants R01 HL114940 (Biesiadecki), R01 AG060542 (Ziolo) en T32 HL134616 (Sturgill en Salyer).

Alle procedures die in deze studie werden uitgevoerd, werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee aan de Ohio State University in overeenstemming met de NIH-richtlijnen.
1. Bereiding van de oplossing
OPMERKING: Zie tabel 2 voor bufferconcentraties.
<ol><li>Pre-isolatie (tot 2 weken voor myocytenisolatie)<ol><li>Perfusiebufferbasis: Bereid 1 L perfusiebufferbasis (NaCl, KCl, NaH 2 PO 4, HEPES, Glucose en BDM) voor in 1 L ultrazuiver 18,2 MΩ·cm H2O. Stel aan tot pH7,4 vóór 0,22 μm steriele filtratie. Bewaren bij 4 °C tot de dag van isolatie.</li>
		<li>Clearing buffer: Bereid 1 L clearing buffer (NaCl, KCl, NaH 2 PO 4, HEPES, Glucose, EDTA, en BDM) in 1 L ultrapure 18,2 MΩ·cm H2O. Breng aan op pH7,4 voorafgaand aan 0,22 μm steriele filtratie. Bewaren bij 4 °C tot de dag van isolatie.</li>
		<li>100 mM CaCl 2 stockoplossing: Weeg 1,11 g CaCl 2 af en los op in 100 ml ultrapuur 18,2 MΩ·cm H2 O. Bewaren bij kamertemperatuur tot de dag van isolatie.</li>
		<li>Liberase aliquots: Los 5 mg spijsverteringsenzymen op in 5 ml steriel, RNase-vrij water. Bereid 0,8 ml aliquots en bewaar bij -20 °C tot de dag van isolatie.</li>
		<li>Lamineer de gerechten: Breng 100 μL 40 μg/ml muislaminine aan op steriele petrischalen van 30 ml met glazen bodem. Laat 30 minuten zitten en verwijder overtollig laminine. Zet het laminine op een petrischaaltje met UV-incubatie op kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Bewaren bij 4 °C tot de dag van isolatie (gelamineerde petrischalen kunnen tot 2 weken worden gebruikt).</li>
		<li>DMEM-media: Voeg in een bioveiligheidskast 2,5 ml FBS, 0,5 ml penicilline-streptomycine (50 U / ml-50 μg) en 1 ml 500 mM BDM toe aan 46 ml DMEM. Bewaren bij 4 °C tot de dag van isolatie (media kunnen maximaal 2 weken worden gebruikt).</li>
		<li>M199-media: Bereid 1 l M199-media (NaHCO3, HEPES, L-glutathion, M199, BDM en BSA) in 1 l ultrapuur 18,2 MΩ·cm H2O. Stel aan tot pH 7,4 voorafgaand aan steriele filtratie (0,22 μm filter). Bewaren bij 4 °C tot de dag van isolatie.</li>
		<li>500 mM BDM-voorraad: Voeg 0,5 g BDM toe aan 10 ml ultrazuiver 18,2 MΩ·cm H2O. Bewaren bij 4 °C tot de dag van isolatie.</li>
		<li>Stabiliserende platformcreatie: Vorm playdough rond de basis van de naald die in de Luer-stopkraan is geschroefd. Vorm naar de petrischaal die het hart bevat en zorg ervoor dat de naald op de juiste hoogte is voor ventrikelinjectie (~ 5 mm boven de bodem van de schaal).</li>
	</ol></li>
	<li>De dag van isolatie<ol><li>Perfusiebuffer: Voeg op de dag van de isolatie 9,5 mg MgCl2 toe aan 100 ml perfusiebufferbasis. Laat volledig mengen voordat u 30 ml voltooide perfusiebuffer verwijdert en plaats in een schone, brede mond, 100 ml glazen fles met een schroefdopdeksel (digestiebuffer). OPMERKING: Deze toevoegingen kunnen worden gedaan op de dag van isolatie zonder extra pH-aanpassingen, omdat hun toevoeging de pH verwaarloosbaar verandert.<ol><li>Verwijder 12 ml perfusiebuffer en zet opzij (stopbuffer). Giet de resterende 58 ml perfusiebuffer in een andere schone, brede mond, 100 ml glazen fles met een schroefdopdeksel. Bewaar de resterende perfusiebuffer bij 37 °C gedurende de isolatie.</li>
		</ol></li>
		<li>Digestiebuffer: Voeg 7,5 μL CaCl2 toe aan 30 ml perfusiebuffer voor een eindconcentratie van 25 μM. Voeg onmiddellijk voorafgaand aan de isolatie 770 μL Liberase toe aan de digestiebuffer voor een eindconcentratie van 26 μg/ml.</li>
		<li>Stopbuffer: Los 240 mg BSA op in 12 ml perfusiebuffer. Bewaren bij 37 °C gedurende de gehele isolatie.</li>
		<li>Buffer opruimen: Bereid een spuit van 3 ml met opruimbuffer voor en verwijder de naald van bubbels. Bewaren op ijs tot isolatie.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Spruitstukvoorbereiding
<ol><li>Wis het temperatuurgeregelde spruitstuk met vers voorbereide perfusiebuffer en zorg ervoor dat er geen bubbels achterblijven. Gebruik een Luer-vergrendelingsconnector, schroef een naald van 27 G in en ontdoe je van bubbels. Een vrij spruitstuk is essentieel voor een succesvolle isolatie.</li>
</ol>3. Voorbereiding van dieren
<ol><li>Injecteer de muis intraperitoneaal met 100 mg/kg ketamine en 20 mg/kg xylazine naar lichaamsgewicht onmiddellijk voorafgaand aan de isolatie. Deze procedure gebruikte een mannelijke, 4 maanden oude C57Bl / 6-muis.</li>
	<li>Plaats de muis indien nodig op een verwarmd chirurgisch kussen om sedatie aan te moedigen. Tent de armen van de muis en plak de ledematen en de basis van de staart vast aan een blauwe labluier. Zorg ervoor dat het dier volledig wordt verdoofd door het terugtrekken van de teen-knijpreflex. Breng een steriel gordijn aan rond het operatiegebied.</li>
</ol>4. Cardiomyocyten isolatie procedure
<ol><li>Stel het borstbeen van de muis bloot en snijd, lateraal naar de middellijn, proximaal door de ribben en naar de oksel. Snijd voorzichtig volledig door het middenrif en zorg voor ondiepe snijwonden om het hart te vermijden. Klem het borstbeen vast met een hemostat en vouw de ribben naar achteren om de borstholte bloot te leggen.</li>
	<li>Verwijder voorzichtig het hartzakje uit het hart en snijd volledig door de inferieure vena cava, onmiddellijk distaal van het hart. Gebruik een spuit van 3 ml met een naald van 27 G om snel 3 ml ijskoude opruimbuffer in de rechterkamer van het hart te injecteren gedurende 1 minuut.</li>
	<li>Houd het hart voorzichtig vast met een pincet en trek weg van het lichaam, waarbij zoveel mogelijk van de aorta wordt blootgesteld. Gebruik een hemostat, klem de opstijgende aorta, zorg ervoor dat je de boezems niet klemt en snijd het hart uit de borst.</li>
	<li>Breng het geklemde hart snel over naar het deksel van een polypropyleen petrischaaltje met ongeveer 10 ml warme perfusiebuffer. Plaats het geklemde hart in het ondersteunende platform en gebruik een gestabiliseerde naald van 27 G die aan het spruitstuk is bevestigd om gedurende 5 minuten 10 ml temperatuurgecontroleerde 37 °C perfusiebuffer in de linkerkamer te injecteren.</li>
	<li>Breng het geklemde hart en het steunplatform over in een petrischaaltje met ongeveer 5 ml verteringsbuffer. Wissel invoerspuiten in voor een spuit van 50 ml met 25 ml verteringsbuffer.</li>
	<li>Verwijder het spruitstuk van eventuele bubbels en de resterende perfusiebuffer vóór injectie. Vervang de naald voorzichtig in dezelfde naaldpositie in de linkerventrikeltop.</li>
	<li>Gebruik een perfusiepomp om de temperatuurgecontroleerde 37 °C verteringsbuffer gedurende 15 minuten in de linker ventrikel te injecteren met behulp van een spuit van 50 ml. Regel de temperatuur van de oplossing met een watermantel die vooraf is gekalibreerd om een oplossing van 37 °C aan het einde van de naald uit te werpen.</li>
	<li>Verwijder de ventrikels uit de boezems en breng over in een bekerglas van 10 ml. Voeg 3 ml verteringsbuffer toe aan het bekerglas en snijd met een scherpe schaar de ventrikels in grote stukken. Bedek het bekerglas met aluminiumfolie en plaats gedurende 5 minuten in een schudwaterbad voorverwarmd tot 37 °C.</li>
	<li>Gooi het supernatant weg en zorg ervoor dat er geen brokken weefsel worden verwijderd. Resuspendeer de weefselbrokken in 3 ml verteringsbuffer en trituleer gedurende ongeveer 4 minuten of totdat een homogeen mengsel is bereikt.</li>
	<li>Filter de cellen door een 70 μm nylon celzeef in een polypropyleenbuis van 50 ml.</li>
	<li>Breng het filtraat terug naar een 14 ml polypropyleenbuis met ronde bodem en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 100 tpm. Gooi het supernatant weg en resuspensie de pellet in 3 ml stopbuffer.</li>
	<li>Voeg 54 μL CaCl 2-voorraad van 100 mM toe aan de geresuspendeerde cellen voor een uiteindelijke CaCl2-concentratie van 1,8 mM. Deze stap kan ook stapsgewijs worden uitgevoerd om de celopbrengst te verhogen.</li>
	<li>Laat levende cellen 10 minuten bezinken door de zwaartekracht voordat u het supernatant met dode cellen verwijdert. Resuspendie van de pellet in opslagoplossing (perfusieoplossing met 200 μM CaCl2). Deze cellen kunnen nu worden gebruikt voor functionele experimenten (d.w.z. calciumbeeldvorming / -contractie, patchklem, enz.), Cultuur, enz. OPMERKING: De cellen kunnen ook worden geresuspendeerd in laboratorium- of experimentafhankelijke oplossingen.</li>
</ol>5. Celkweek
<ol><li>Tel de cellen met behulp van een hemocytometer of door een veldweergave te tellen met behulp van een gerasterde afdeklaag. Omdat myocyten erg groot zijn, is tellen met behulp van een hemocytometer niet altijd nauwkeurig. Dit wordt gebruikt om een idee te krijgen van hoeveel cellen er ongeveer uit de isolatie zijn gehaald.</li>
	<li>Verdun de cellen tot ~ 25.000 cellen / ml met DMEM-media. Voeg 1 ml celoplossing toe aan elk putje.</li>
	<li>Incubeer bij 37 °C, 95% O 2, 5% CO 2 gedurende2 uur.</li>
	<li>Zuig voorzichtig DMEM-media uit elke put en voeg 2 ml M199-media toe.</li>
	<li>Incubeer bij 37 °C, 95% O 2, 5% CO2 gedurende maximaal 24 uur.</li>
</ol>

<ol><li>Ziolo, M. T., Dollinger, S. J., Wahler, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocytes+isolated+from+rejecting+transplanted+rat+hearts+exhibit+reduced+basal+shortening+which+is+reversible+by+aminoguanidine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit reduced basal shortening which is reversible by aminoguanidine.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 30 (5), 1009-1017 (1998).</li>
<li>Ziolo, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocytes+isolated+from+rejecting+transplanted+rat+hearts+exhibit+a+nitric+oxide-mediated+reduction+in+the+calcium+current%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit a nitric oxide-mediated reduction in the calcium current.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (9), 1691-1699 (2001).</li>
<li>Traynham, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diesterified+nitrone+rescues+nitroso-redox+levels+and+increases+myocyte+contraction+via+increased+SR+Ca%282%2B%29+handling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Diesterified nitrone rescues nitroso-redox levels and increases myocyte contraction via increased SR Ca(2+) handling.</a> PLoS One. 7 (12), 52005(2012).</li>
<li>Nixon, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+troponin+I+Ser-150+and+Ser-23%2F24+phosphorylation+sustains+thin+filament+Ca%282%2B%29+sensitivity+and+accelerates+deactivation+in+an+acidic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Combined troponin I Ser-150 and Ser-23/24 phosphorylation sustains thin filament Ca(2+) sensitivity and accelerates deactivation in an acidic environment.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 177-185 (2014).</li>
<li>Swager, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Claudin-5+levels+are+reduced+from+multiple+cell+types+in+human+failing+hearts+and+are+associated+with+mislocalization+of+ephrin-B1%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Pathology%22%5BJournal%5D)">Claudin-5 levels are reduced from multiple cell types in human failing hearts and are associated with mislocalization of ephrin-B1.</a> Cardiovascular Pathology. 24 (3), 160-167 (2015).</li>
<li>Pinckard, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+endocrine+role+for+the+BAT-released+lipokine+12%2C13-diHOME+to+mediate+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">A novel endocrine role for the BAT-released lipokine 12,13-diHOME to mediate cardiac function.</a> Circulation. 143 (2), 145-159 (2021).</li>
<li>Roof, S. R., Shannon, T. R., Janssen, P. M., Ziolo, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+increased+systolic+Ca2%2B+and+phospholamban+phosphorylation+during+beta-adrenergic+stimulation+on+Ca2%2B+transient+kinetics+in+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of increased systolic Ca2+ and phospholamban phosphorylation during beta-adrenergic stimulation on Ca2+ transient kinetics in cardiac myocytes.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (4), 1570-1578 (2011).</li>
<li>Harris, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise-induced+3%27-sialyllactose+in+breast+milk+is+a+critical+mediator+to+improve+metabolic+health+and+cardiac+function+in+mouse+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Exercise-induced 3'-sialyllactose in breast milk is a critical mediator to improve metabolic health and cardiac function in mouse offspring.</a> Nature Metabolism. 2 (8), 678-687 (2020).</li>
<li>Roof, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXL-1020%2C+a+novel+nitroxyl+%28HNO%29+prodrug%2C+is+more+effective+than+milrinone+in+models+of+diastolic+dysfunction-a+cardiovascular+therapeutic%3A+an+efficacy+and+safety+study+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">CXL-1020, a novel nitroxyl (HNO) prodrug, is more effective than milrinone in models of diastolic dysfunction-a cardiovascular therapeutic: an efficacy and safety study in the rat.</a> Frontiers in Physiology. 8, 894(2017).</li>
<li>Milani-Nejad, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+and+large+animal+models+in+cardiac+contraction+research%3A+advantages+and+disadvantages%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages.</a> Pharmacology and Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).</li>
<li>Harary, I., Farley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+studies+of+single+isolated+beating+heart+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vitro studies of single isolated beating heart cells.</a> Science. 131 (3414), 1674-1675 (1960).</li>
<li>Kono, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+collagenases+and+other+proteolytic+enzymes+in+the+dispersal+of+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Roles of collagenases and other proteolytic enzymes in the dispersal of animal tissues.</a> Biochimica Biophysica Acta. 178 (2), 397-400 (1969).</li>
<li>Baker, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+apparatus+for+mammalian+heart+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">An improved apparatus for mammalian heart perfusion.</a> The Journal of Physiology. 115 (1), 30-32 (1951).</li>
<li>Powell, T., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+technique+for+the+isolation+and+purification+of+adult+cardiac+muscle+cells+having+respiratory+control+and+a+tolerance+to+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 72 (1), 327-333 (1976).</li>
<li>Motayagheni, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+Langendorff+technique+for+mouse+heart+cannulation%3A+Improved+heart+quality+and+decreased+risk+of+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Modified Langendorff technique for mouse heart cannulation: Improved heart quality and decreased risk of ischemia.</a> MethodsX. 4, 508-512 (2017).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+procedure+for+isolating+adult+mouse+cardiomyocytes+for+epicardial+activation+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">An improved procedure for isolating adult mouse cardiomyocytes for epicardial activation mapping.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (24), 11257-11263 (2021).</li>
<li>Jian, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cannulation+methods+for+cardiomyocytes+isolation+from+heart+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo cannulation methods for cardiomyocytes isolation from heart disease models.</a> PLoS One. 11 (8), 0160605(2016).</li>
<li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified%2C+Langendorff-free+method+for+concomitant+isolation+of+viable+cardiac+myocytes+and+nonmyocytes+from+the+adult+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">A simplified, Langendorff-free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart.</a> Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li>
<li>Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+efficient+method+for+the+isolation+of+postnatal+murine+cardiac+myocyte+and+fibroblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Physiology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96 (5), 535-539 (2018).</li>
<li>Myachina, T. A., Butova, X. A., Khohlova, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+Langendorff-free+method+for+isolation+of+cadiomyocytes+from+adult+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22AIP+Conference+Proceedings%22%5BJournal%5D)">A modified Langendorff-free method for isolation of cadiomyocytes from adult rat heart.</a> AIP Conference Proceedings. 2174 (1), 020140(2019).</li>
<li>Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+antegrade+perfusion+method+for+isolating+viable+single+cardiomyocytes+from+neonatal+to+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal to aged mice.</a> Physiological Reports. 6 (9), 13688(2018).</li>
<li>Omatsu-Kanbe, M., Fukunaga, R., Mi, X., Matsuura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antegrade+perfusion+method+for+cardiomyocyte+isolation+from+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An antegrade perfusion method for cardiomyocyte isolation from mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (171), e61866(2021).</li>
<li>Bers, D. M., Patton, C. W., Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+the+preparation+of+Ca2%2B+buffers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A practical guide to the preparation of Ca2+ buffers.</a> Methods in Cell Biology. 99, 126(1994).</li>
<li>Grosso, D. S., Frangakis, C. J., Carlson, E. C., Bressler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+myocytes+from+the+adult+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Preparative+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of myocytes from the adult rat heart.</a> Preparative Biochemistry. 7 (5), 383-401 (1977).</li>
<li>Thum, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Butadione+Monoxime+increases+the+viability+and+yield+of+adult+cardiomyocytes+in+primary+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Butadione Monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures.</a> Cardiovascular Toxicology. 1 (1), 61-72 (2001).</li>
<li>Wolska, B. M., Solaro, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+isolation+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+for+studies+of+contraction+and+microfluorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry.</a> American Journal of Physiology. 271 (3), 1250-1255 (1996).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten om bekend te maken.

Het belangrijkste voordeel van onze Langendorff-vrije cardiomyocytenisolatietechniek is dat het hypoxie en ischemische tijd beperkt door geen cannulatie naar een Langendorff-apparaat te vereisen. Als alternatief voor klassieke Langendorff-technieken die enkele minuten nodig hebben om het hart te verwijderen, te reinigen en op te hangen, wat vaak resulteert in ischemische schade aan de myocyt, omvat onze methode een in vivo zuivering van bloed via een ijskoude reinigingsoplossing. De ijskoude zuiveringsb...

Al tientallen jaren is een essentieel idee in de hartbiologieliteratuur het moleculaire werkingsmechanisme. Het werkingsmechanisme moet worden vastgesteld om betrouwbare studies te kunnen publiceren. Een gevestigde strategie om het moleculaire mechanisme te bepalen is geïsoleerde cardiomyocytenstudies, die cardiomyocyten van hoge kwaliteit vereisen voor het verkrijgen van betrouwbare gegevens. Cellulaire en moleculaire experimenten uitgevoerd op cardiomyocyten om het werkingsmechanisme te bepalen zijn de gouden standaard voor het onderzoeken van contractie1, elektrofysiologie2, calcium (Ca 2+) cyclus3, myofilament Ca2+ gevoeligheid4, cytoskelet5, metabolisme6, effecten van hormonen7, signaalmoleculen8, geneesmiddelenstudies9 enz. De muis is de voorkeurssoort geworden voor de meeste hartbiologische experimenten vanwege het gemak van genetische manipulatie, zijn kleine formaat, zijn relatief korte levensduur, lage kosten, enz.10. De betrouwbare isolatie van hoogwaardige cardiomyocyten van muizen is echter niet triviaal met de huidige technieken.
Labs isoleren cardiomyocyten al bijna 70 jaar11. Vrijwel alle technieken om cardiomyocyten te isoleren zijn afhankelijk van de vertering van het hart via verschillende enzymen (collagenase, protease, trypsine, enz.). In de vroege perioden (jaren 1950-1960) werd de brokmethode gebruikt, waarbij het hart werd verwijderd, in veel kleinere stukjes werd gesneden en in oplossing werd geïncubeerd met collagenase / protease / trypsine12. In de jaren 1970 implementeerden laboratoria de verbeterde "Langendorff" -methode13, die cardiomyocyten isoleerde met behulp van een op coronaire perfusie gebaseerde isolatietechniek (retrograde perfusie met enzym via het Langendorff-apparaat); Deze techniek blijft de dominante methode van myocytenisolatie in het veld vandaag, ~50 jaar later14,15,16. Recent werk is verschoven naar het in vivo cannuleren van het hart om de hypoxietijd en ischemische schade te beperken, wat resulteert in superieure cardiomyocytenisolaties (betere opbrengsten en hogere kwaliteit)17. Onlangs is dit geëvolueerd naar het uitvoeren van in vivo, Langendorff-vrije hartperfusies 18,19,20,21,22. We hebben de Langendorff-vrije cardiomyocytenisolatietechniek ontwikkeld op basis van de Ackers-Johnson et al.18-techniek en verschillende componenten aangepast van de vele eerdere isolatietechnieken. Deze belangrijke aanpassingen omvatten de injectie van een ijskoude opruimbuffer en de integratie van een ondersteunend platform om de naald te stabiliseren, waardoor minder manipulatie van het hart mogelijk is. Ook gedetailleerd in deze techniek is temperatuurregeling van geïnjecteerde buffers (37 °C), die de tijd tussen in vivo injectie en spijsvertering verkortte als gevolg van minder EDTA-perfusie zoals eerder gepubliceerd18. Door manipulatie van het hart te verminderen en daardoor de grootte van de punctieplaats te minimaliseren, wordt een grondige en constante perfusie van de kransslagaders verkregen. We verfijnden de techniek ook met een secundaire brokmethode vertering, de hoeveelheid EDTA in de geïnjecteerde clearingbuffer en veranderden de pH. Onze beschreven techniek is betrouwbaarder, efficiënter en vereist niet de uitgebreide training / oefening in vergelijking met het gebruik van het Langendorff-apparaat (tabel 1).

<table><tbody><tr><td>10 cc Bd Luer-Lok Syringe</td><td>Fisher Sci</td><td>14-827-52</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Pyrex Low-Form Beaker</td><td>Cole-Palmer</td><td>UX-34502-01</td><td></td></tr><tr><td>100 mL polypropylene cap glass media storage bottle</td><td>DWK Life Sciences</td><td>UX-34523-00</td><td></td></tr><tr><td>14 mL Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap</td><td>Fisher Sci</td><td>14-959-11B</td><td></td></tr><tr><td>2,3-Butanedione Monoxime</td><td>Sigma</td><td>B0753</td><td>>98%</td></tr><tr><td>3 cc BD Luer-Lok Syringe</td><td>Fisher Sci</td><td>14-823-435</td><td></td></tr><tr><td>35 mm glass bottom dishes</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.0-20-C</td><td></td></tr><tr><td>50 mL BD Syringe without Needle</td><td>Fisher Sci</td><td>13-689-8</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Conical Centrifuge Tubes</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-22999-84</td><td></td></tr><tr><td>95% O2 5% CO2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AIMS Space Gel Heating Pad</td><td>Fisher Sci</td><td>14-370-223</td><td></td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide 27 G X 1/2" Hypodermic Needles</td><td>Becton Dickinson</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A3803</td><td>Heat shock fraction, lyophilized powder, essentially fatty acid free, >98%</td></tr><tr><td>Calcium Chloride dihydrate</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td>>99%</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td>Suitable for cell culture, >99.5%</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher Sci</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Sci</td><td>AAA1071336</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 100 mm TC-treated Cell Culture Dish</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>R&amp;D Systems (Bio-techne)</td><td>S11195</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Isotemp Heated Immersion Circulators</td><td>Fisher Sci</td><td>13-874-432</td><td></td></tr><tr><td>Hartman Mosquito Hemostatic Forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>15921</td><td></td></tr><tr><td>Hausser Scientific Hy-Lite Counting Chamber Set</td><td>Fisher Sci</td><td>02-671-11</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td>>99.5%</td></tr><tr><td>Labeling Tape</td><td>Fisher Sci</td><td>15-901-10R</td><td></td></tr><tr><td>Legato 100 Syringe Pump</td><td>kdScientific</td><td>788100</td><td></td></tr><tr><td>L-glutathione</td><td>Fisher Sci</td><td>ICN19467980</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TH Research Grade</td><td>Sigma</td><td>5401135001</td><td>High thermolysin concentration</td></tr><tr><td>M199</td><td>Fisher Sci</td><td>MT10060CV</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride</td><td>Invitrogen</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Laminin</td><td>Corning</td><td>354232</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Fisher Sci</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>>99%</td></tr><tr><td>Precision Digital Reciprocating Water Bath</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>TSCIR19</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>Suitable for cell culture</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td>>99%</td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic</td><td>Sigma</td><td>S5011</td><td>>99%</td></tr><tr><td>Sterile Cell Strainer 70 &micro;m</td><td>Fisher Sci</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>Student Fine Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>VWR Absorbent Underpads</td><td>Fisher Sci</td><td>NC9481815</td><td></td></tr></tbody></table>

een eenvoudige en effectieve methode om cardiomyocyten van muizen consequent te isoleren

A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes

De behoefte aan reproduceerbare maar technisch eenvoudige methoden die hoogwaardige cardiomyocyten opleveren, is essentieel voor onderzoek in de hartbiologie. Cellulaire en moleculaire functionele experimenten (bijv. Contractie, elektrofysiologie, calciumcyclus, enz.) op cardiomyocyten zijn de gouden standaard voor het vaststellen van mechanismen van ziekte. De muis is de soort bij uitstek voor functionele experimenten en de beschreven techniek is specifiek voor de isolatie van cardiomyocyten van muizen. Eerdere methoden die een Langendorff-apparaat vereisen, vereisen een hoge mate van training en precisie voor aorta-cannulatie, wat vaak resulteert in ischemie. Het veld verschuift naar Langendorff-vrije isolatiemethoden die eenvoudig zijn, reproduceerbaar zijn en levensvatbare myocyten opleveren voor fysiologische gegevensverzameling en cultuur. Deze methoden verminderen de ischemietijd aanzienlijk in vergelijking met aortacannulatie en resulteren in betrouwbaar verkregen cardiomyocyten. Onze aanpassing aan de Langendorff-vrije methode omvat een eerste perfusie met ijskoude reinigingsoplossing, het gebruik van een stabiliserend platform dat zorgt voor een stabiele naald tijdens perfusie en extra verteringsstappen om betrouwbaar verkregen cardiomyocyten te garanderen voor gebruik in functionele metingen en cultuur. Deze methode is eenvoudig en snel uit te voeren en vereist weinig technische vaardigheid.

Er zijn een paar elementen om te onderzoeken bij het bepalen van het succes van een isolatie. Ten eerste moeten de cardiomyocyten staafvormig zijn zonder membraanblebs, zoals de cellen geïsoleerd in figuur 1. Een typische isolatie levert ~80% op van de myocyten die staafvormig zijn. Als de isolatie iets minder dan 50% staafvormige cellen oplevert, wordt het beschouwd als een mislukte isolatie en worden cardiomyocyten niet gebruikt. Ten slotte moeten de cardiomyocyten rustig zijn. Spontane sa...

De gouden standaard in de cardiologie voor cellulaire en moleculaire functionele experimenten zijn cardiomyocyten. Dit artikel beschrijft aanpassingen aan de niet-Langendorff-techniek om cardiomyocyten bij muizen te isoleren.

Een eenvoudige en effectieve methode om cardiomyocyten van muizen consequent te isoleren

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and ...

Deze techniek is betrouwbaarder en efficiënter en vereist geen uitgebreide oefening of training in vergelijking met de meest gebruikte Langendorff-apparaattechnieken. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de ischemische tijd beperkt, omdat de initiële perfusie in vivo plaatsvindt. Tijdens het uitvoeren van deze techniek is het essentieel om bubbels in het spruitstuk te vermijden en overmatige beweging van het hart tijdens de spijsvertering te voorkomen, deze kunnen de opbrengst verminderen.Sarah Sturgill, een afgestudeerde student in het laboratorium van Dr. Mark Ziolo, demonstreert deze techniek en zal deze techniek demonstreren. Begin met het opruimen van het temperatuurgeregelde spruitstuk met behulp van vers bereide perfusiebuffer. Om dit te doen, schroeft u een naald van 27 gauge in en verwijdert u de bellen met behulp van een luer lock-connector.Zorg ervoor dat er geen bubbels achterblijven. Om de cardiomyocyt te isoleren, stelt u het borstbeen van de volledig verdoofde muis bloot en lateraal naar de middellijn, snijdt proximaal door de ribben en naar de oksel. Snijd vervolgens door het middenrif en zorg voor ondiepe sneden om het hart te vermijden.Klem het borstbeen vast met een hemostat en vouw de ribben naar achteren om de borstholte bloot te leggen. Verwijder het hartzakje voorzichtig uit het hart voordat u de inferieure vena cava onmiddellijk distaal van het hart doorsnijdt. Injecteer drie milliliter ijskoude opruimbuffer in de rechterkamer van het hart gedurende één minuut met behulp van een naald van 27 gauge.Houd vervolgens het hart vast met een pincet. Trek het weg van het lichaam en stel zoveel mogelijk van de aorta bloot. Klem vervolgens de opgaande aorta vast met behulp van een hemostat en snijd het hart weg.Breng het geklemde hart snel over naar het deksel van een polypropyleen petrischaaltje met 10 milliliter warme perfusiebuffer. Plaats het geklemde hart in het ondersteunende platform en injecteer 10 milliliter temperatuurgecontroleerde perfusiebuffer bij 37 graden Celsius in de linker ventrikel gedurende vijf minuten met behulp van een gestabiliseerde naald van 27 gauge die aan het spruitstuk is bevestigd. Breng vervolgens het geklemde hart en het ondersteunende platform over naar een petrischaal met ongeveer vijf milliliter verteringsbuffer.Wissel invoerspuiten in voor een spuit van 50 milliliter met 25 milliliter verteringsbuffer. Verwijder het spruitstuk van eventuele bubbels en de resterende perfusiebuffer vóór injectie. Vervang de naald voorzichtig in dezelfde naaldpositie in de linkerventrikeltop.Injecteer met behulp van een perfusiepomp de verteringsbuffer van 37 graden Celsius gedurende 15 minuten in de linkerkamer met behulp van een spuit van 50 milliliter. Regel de temperatuur van de oplossing met een watermantel gekalibreerd om de oplossing van 37 graden Celsius uit te werpen. Verwijder de ventrikels uit de boezems voordat u ze overbrengt naar een bekerglas van 10 milliliter.Voeg drie milliliter verteringsbuffer toe aan het bekerglas en snijd de ventrikels in grote stukken met een scherpe schaar. Bedek het bekerglas met aluminiumfolie en plaats het gedurende vijf minuten in een schudwaterbad voorverwarmd tot 37 graden Celsius. Na het weggooien van het supernatant, resuspensie de weefselbrokken in drie milliliter verteringsbuffer en trituleer het gedurende ongeveer vier minuten of totdat een homogeen mengsel is bereikt.Als u klaar bent, filtert u de cellen in een polypropyleenbuis van 50 milliliter met behulp van een 70 micrometer nyloncelzeef. Was nylon celzeef met drie milliliter verteringsbuffer. Breng het filtraat terug naar een polypropyleenbuis met ronde bodem van 14 milliliter en centrifugeer het.Gooi het supernatant weg voordat u de pellet opnieuw in drie milliliter stopbuffer plaatst. Voeg aan de celsuspensie 54 microliter 100 millimolaire calciumchloridevoorraad toe om de uiteindelijke calciumchlorideconcentratie 1,8 millimolair te maken. Laat de levende cellen 10 minuten bezinken en verwijder het supernatant met dode cellen.Na het opnieuw suspenderen van de pellet in een opslagoplossing, kunnen de cellen worden gebruikt voor functionele experimenten en culturen. Brightfield-microscoopbeelden van geïsoleerde cellen toonden aan dat de isolatie van cardiomyocyten van muizen staafvormige rustcellen produceerde zonder membraanblebs of afgeronde randen. De cellen vertoonden ongeveer 80% opbrengst en hoge overlevingskansen die het succes van de isolatietechniek bepaalden.Voor een succesvolle isolatie is het het belangrijkst om de bellen uit het spruitstuk te verwijderen en de naald in hetzelfde gat in het hart te steken. Eenmaal geïsoleerd, kunnen de cardiomyocyten worden gebruikt voor cellulaire en moleculaire functionele experimenten.

a-simple-effective-method-to-consistently-isolate-mouse

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Primaire muis cardiomyocytkweken is een van de cruciale instrumenten voor het onderzoek myofibrillar inrichting en functie. Het volgende protocol beschrijft de isolatie en de cultuur van primaire cardiomyocyten van neonatale muis harten. De resulterende cardiomyocytkweken kunnen vervolgens worden gebruikt voor een verscheidenheid van biomechanische, biochemische en celbiologische assays.

Isolatie en cultuur van de Neonatale Mouse Cardiomyocytes

Hier beschrijven we de isolatie van volwassen muis cardiomyoctyes met behulp van een Langendorff perfusie-systeem. De resulterende cellen Ca2 +-tolerante, elektrisch rustende en kan gekweekt en getransfecteerd met adeno-of lentivirussen om genexpressie te manipuleren. Hun functionaliteit kan ook worden geanalyseerd met behulp van het MMSYS systeem en patch clamp technieken.

Isolatie, Cultuur en functionele karakterisering van volwassen muis Cardiomyoctyes

Individuele cardiomyocyten van wilde type en mutante muizen kunnen uit het hart worden geïsoleerd om hun contractiliteit en calciumtransienten te bestuderen. Dit maakt het mogelijk om de bijdrage van cellulaire disfunctie aan hartdisfunctie, van welke oorzaak dan ook, te karakteriseren.

Isolatie en fysiologische analyse van de Muis Cardiomyocyten

We beschrijven een betrouwbare methode voor het isoleren van volwassen muis hartspiercellen. Dit protocol geeft een consistent resultaat voor de cultuur van functionele volwassen hartspiercellen uit verschillende genetisch gemodificeerde muizen.

Isolatie en cultuur van de volwassen muis Cardiomyocytes voor mobiele Signalering en<em&gt; In vitro</em&gt; Hypertrofie

Dit protocol beschrijft een stapsgewijze methode voor de reproduceerbare isolatie en langdurige kweek van volwassen muis-cardiomyocyten met een hoge opbrengst, zuiverheid en levensvatbaarheid.

Isolatie, Cultuur en Transductie van Adult Mouse Cardiomyocytes

Dit protocol wordt gebruikt om enkelvoudige atriale cardiomyocyten van het volwassen muis hart te isoleren met behulp van een Brok digestie benadering. Deze aanpak wordt gebruikt om te isoleren van rechts of links atriale myocyten die kunnen worden gebruikt voor het karakteriseren van Atrium myocyten elektrofysiologie in Patch-clamp studies.

Isolatie van atriale Myocyten van volwassen muizen

Hier presenteren we een protocol voor de isolatie, transfectie, en de lange termijn cultuur van volwassen muis en rat cardiomyocyten.

Isolatie, transfectie, en lange termijn cultuur van volwassen muis en rat cardiomyocyten

Een methode wordt beschreven voor de gelijktijdige isolatie van myocyten en niet-myocyten van zowel de atria als ventrikels van een enkel volwassen muizenhart. Dit protocol resulteert in consistente opbrengsten van zeer levensvatbare cardiale myocyten en niet-myocyten en beschrijft optimale celspecifieke kweekomstandigheden voor fenotyping en in vitro analyse.

Gelijktijdige isolatie en cultuur van atriale myocyten, ventriculaire myocyten en niet-myocyten uit een volwassen muizenhart

We ontwikkelden een simple-methode voor het isoleren van hoogwaardige individuele muishartcellen door de antegrade perfusietechniek. Deze methode is Langendorff-vrij en nuttig voor het isoleren van ventriculaire en atriale myocyten of interstitiële cellen, zoals hartfibroseblasten of voorlopers.

Een Antegrade Perfusie methode voor Cardiomyocyt isolatie van muizen

Muismodellen maken het mogelijk om belangrijke mechanismen van aritmogenese te bestuderen. Voor dit doel zijn cardiomyocyten van hoge kwaliteit nodig om patchklemmetingen uit te voeren. Hier wordt een methode beschreven om murine atriale en ventriculaire myocyten te isoleren via retrograde enzymgebaseerde Langendorff-perfusie, die gelijktijdige metingen van calciumtransiënten en L-type calciumstroom mogelijk maakt.

Isolatie van hoogwaardige murine atriale en ventriculaire myocyten voor gelijktijdige metingen van Ca2+ transiënten en L-type calciumstroom

Dit protocol beschrijft modificaties van de Langendorff-methode, waaronder de diepte van aorta-cannulatie voor gelijktijdige isolatie van atriale en ventriculaire myocyten van volwassen muizen.

Modificaties van de Langendorff-methode voor gelijktijdige isolatie van atriale en ventriculaire myocyten van volwassen muizen

Leer een betrouwbare methode voor het isoleren van muizen-cardiomyocyten met in vivo-perfusie om ischemische tijd te beperken. Deze techniek verbetert de opbrengst en vereist minder training dan traditionele methoden.

Een eenvoudige en effectieve methode om cardiomyocyten van muizen consequent te isoleren

Meer video's verkennen