Amplificatie van Escherichia coli in een Continuous-Flow-PCR microfluïdische chip en de detectie ervan met een capillair elektroforesesysteem

Dit protocol beschrijft hoe je een continuous-flow-polymeraseketensysteem bouwt op basis van de microfluïdische chip, en hoe je een capillair elektroforesesysteem bouwt in het lab. Het biedt een eenvoudige manier voor de analyse van nucleïnezuren in het laboratorium. Polymerasekettingreactie is een traditionele methode die wordt gebruikt voor de amplificatie van het doelgen.

Traditionele PCR is echter zeer tijdrovend vanwege de variatie-efficiëntie bij lage temperaturen. Dit werk stelt een continuous-flow-PCR-systeem voor op basis van de microfluïdische chip. De versterkingstijd kan aanzienlijk worden verkort door de PCR-oplossing in een microkanaal te laten lopen dat op verwarmers is geplaatst die op verschillende temperaturen zijn ingesteld.

Omdat CE veel voordelen heeft, zoals hoge resolutie, hoge snelheid en uitstekende reproduceerbaarheid, werd het een populair hulpmiddel in het laboratorium voor de analyse van nucleïnezuren en eiwitten. De meeste laboratoria, vooral de laboratoria in ontwikkelingslanden, kunnen zich deze technologie echter niet veroorloven vanwege de hoge prijs van het CE-instrument. Hierin hebben we protocollen geschetst voor het fabriceren van de CF-PCR microfluïdische chip en het bouwen van een veelzijdig CE-systeem in het laboratorium.

We demonstreren ook het proces van amplificatie van Escherichia coli door het CF-PCR-systeem en de detectie van de PCR-producten door het CE-systeem. Door de procedures te volgen die in dit protocol worden beschreven, zouden gebruikers in staat moeten zijn om microfluïdische chips te fabriceren, PCR-oplossing te bereiden, een CF-PCR-systeem voor nucleïnezuuramplificatie te bouwen en een eenvoudig CE-systeem op te zetten, zelfs met beperkte middelen, om DNA-fragmenten te scheiden. Verwarm de siliconenwafel gedurende 25 minuten op 200 graden Celsius om het vocht te verwijderen.

Doseer één milliliter SU-8 2075 fotoresist per inch van de wafer. Draai het op de siliciumwafer met behulp van een spincoater op 500 tpm gedurende 5 tot 10 seconden met een versnelling van 100 tpm per seconde, en vervolgens op 2.000 tpm gedurende 30 seconden met een versnelling van 500 tpm per seconde. Bak het drie minuten zacht op 65 graden Celsius en 15 minuten op 95 graden Celsius.

Stel 150 tot 215 millijoule per vierkante centimeter in als belichtingsenergie voor de fotolithografiemachine en graveer het ontworpen patroon op de fotoresist met een fotolithografiemasker. Plaats de siliciumwafel en het masker klaar voor belichting. Bak de wafel na blootstelling twee minuten op 65 graden Celsius en zeven minuten op 95 graden Celsius.

Dompel de siliciumwafer onder in ontwikkelaarsoplossing om overtollig fotoresist te verwijderen en verwijder het wanneer de microkanalen te zien zijn. Gebruik vervolgens isopropanol om de resterende ontwikkelaarsoplossing af te spoelen. Meng het polydimethylsiloxaanprepolymeer en het uithardingsmiddel in een verhouding van 10 op 1.

Giet de gemengde PDMS-oplossing in de replicamal en laat deze gedurende 60 minuten stollen op 80 graden Celsius. Bind de PDMS-microfluïdische chip na activering op een objectglaasje met behulp van een plasmareiniger en laat ze zo snel mogelijk 30 minuten stollen bij 80 graden Celsius. Gebruik een vortexmixer en centrifugeer om ervoor te zorgen dat de reagentia goed gemengd zijn.

Bereid een centrifugebuis voor. Voeg eerst water toe aan de centrifugebuis. Voeg vervolgens het DNA-sjabloon, de primer, de buffer, het dNTP-mengsel, Tween 20, PVP toe en voeg ten slotte het DNA-polymerase toe.

Meng ten slotte de oplossing door vortex. Bereid twee PTC-keramische verwarmers, twee solid-state relais, twee temperatuurregelaars, twee temperatuursensoren en een netsnoer voor. Sluit de kachel aan op het solid-state relais.

Sluit het solid-state relais aan op de PID-temperatuurregelaar. Bevestig vervolgens de temperatuursensorsonde aan de onderkant van de twee verwarmers en sluit de terminal aan op de PID-temperatuurregelaar. Sluit ten slotte twee solid-state relais in serie aan en sluit het netsnoer aan.

3D-print een sleuf voor de twee kachels en houd de kachels op hetzelfde vlak. Plaats de microfluïdische chip op de twee verwarmers. Bereid een spuitpomp en een spuit voor en bevestig de spuit vervolgens op de spuitpomp.

Sluit een siliconenslang aan met een spuit en sluit een stalen naald aan op de bovenkant van de siliconenslang. Steek de stalen naald in de inlaat van de microfluïdische chip. Plaats een pipetpunt bij de uitgang van de chip om de PCR-producten op te vangen.

Gebruik een hoogspanningsvoeding om een elektrisch veld met een pulserend veld op te wekken. Kijk, dit is een hoogspanningsvoeding. Dit zijn positieve en negatieve elektroden.

Gebruik een kwiklamp als lichtbron en filter de excitatiegolflengte van de kwiklamp door een filter. Plaats het capillair op de microscooptafel. Verzamel de fluorescentie-emissie met het objectief en detecteer deze vervolgens met een fotomultiplicatorbuis.

Dit is onze microscoop en dit is ons capillair. Nu doen we het licht aan in donkere kameromstandigheden. Excitatielicht wordt opgevangen door het objectief.

Gebruik de zelf ontwikkelde LABVIEW-software om de stroomvoorziening aan te sturen en de data-acquisitie te voltooien. Stel de temperatuur van de verwarmers van het CF-PCR-systeem vooraf in op 65 graden Celsius en 95 graden Celsius. Plaats de microfluïdische chip op de twee verwarmingsblokken.

Steek de punt van de siliconenslang in een centrifugebuisje met 50 microliter PCR-oplossing. Trek aan de zuiger van de spuit om de oplossing langzaam op te zuigen. Bevestig de spuit op een spuitpomp.

Steek de stalen naald in de inlaat van de microfluïdische chip. Stel het debiet van de pomp in op 10 microliter per minuut en druk op de startknop om de oplossing in het microkanaal bij de inlaat van de microchip te duwen. Verzamel de PCR-producten aan de uitgang van de microfluïdische chip.

Bereid een capillair voor met een totale lengte van 8 centimeter en een effectieve lengte van 6 centimeter. Bereid de scheidingsbuffer voor door 100 microliter 1%HEC, twee microliter 100x SYBR Green en 98 microliter ultrapuur water te mengen om 0,5% HEC met 1x SYBR Green te verkrijgen. Vul het capillair met de voorbereide scheidingsbuffer met behulp van een vacuümpomp.

Voer de injectiespanning en de injectietijd in op de software-interface, klik op de startknop en wacht tot de PCR-producten elektrodynamisch in het capillair zijn gebracht. Voer de gelijkspanning in op de software-interface, klik op de startknop en voer de elektroforese uit met 100 volt per centimeter elektrische veldsterkte. Klik op de stopknop nadat alle DNA-fragmenten in het capillair zijn gescheiden.

Spoel het capillair na elke run gedurende één minuut met gesteriliseerd water. Deze afbeelding vertegenwoordigt het elektroferogram van PCR-producten en DNA-markers. We amplificeerden eerst het doelgen van Escherichia coli in het CF-PCR-systeem, en de PCR-oplossing duurde ongeveer 10 minuten en 30 seconden van de inlaat naar de uitlaat van de chip.

De grootte van het doelamplicon van Escherichia coli was 544 bp. Daarna analyseerden we de geamplificeerde PCR-producten in het capillaire elektroforesesysteem. Daarnaast voerden we ook de capillaire elektroforese van 100 bp DNA-ladder uit onder dezelfde experimentele omstandigheden.

De grootte van het PCR-product kan worden geëvalueerd aan de hand van het elektroferogram van de DNA-ladder. Elk experiment werd drie keer uitgevoerd op reproduceerbaarheid. Gegevens in deze afbeelding laten zien dat de piek die overeenkomt met PCR-producten van Escherichia coli werd waargenomen na scheiding, en dat de migratietijd van PCR-producten in de microfluïdische chip consistent was met die in een thermische cycler.

Zowel PCR als CE zijn twee populaire biotechnologieën bij de analyse van nucleïnezuren. Dit artikel beschrijft de amplificatie van Escherichia coli en de detectie van de PCR-producten met behulp van de CF-PCR- en CE-systemen, beide in eigen huis gebouwd. Het doelgen van Escherichia coli werd binnen 10 minuten met succes geamplificeerd en de DNA-fragmenten kleiner dan 1.500 bp werden binnen acht minuten gescheiden.

Ook het CF-PCR-systeem op basis van de microfluïdische chip en het CE-systeem dat in dit werk is geïntroduceerd, zijn gemakkelijk te fabriceren en kunnen een eenvoudige manier bieden voor de analyse van nucleïnezuren in het laboratorium. Het kan slechts één monster tegelijk versterken en detecteren, wat de brede toepassing ervan beperkt. Daarom is de ontwikkeling van een geïntegreerde CF-PCR en CE microfluïdische chiparray voor high-throughput detectie van ziekteverwekkers nog steeds onderweg.