De fabricage en werking van een continu flow, micro-elektroporatiesysteem met permeabilisatiedetectie

Deze methode stelt onderzoekers in staat om optimale elektroporatiepulsingsomstandigheden voor het gewenste celtype te bepalen, terwijl de behoefte aan de traditionele empirische experimentele benadering wordt geminimaliseerd. Deze methode maakt gebruik van micro-elektroporatietechnieken om een schaalbaar microfluïdisch actuatieapparaat te vervaardigen dat in staat is om de mate van celmembraanpermeabilisatie tijdens het elektroporatieproces elektrisch te bewaken. Kishankumar Busha, een masterstudent uit mijn laboratorium, demonstreert de procedure.

Om te beginnen bevestigt u de siliciumwafer aan de klauwplaat van de wafer spin coater met behulp van het vacuümsysteem van de spin coater. Programmeer vervolgens de spinner. Doseer vervolgens vier milliliter SU-8 2010 fotoweerstand op het midden van de siliciumwafer en voer het programma uit.

Zodra het systeem tot stilstand komt, schakelt u de stofzuiger uit. Bevestig vervolgens het fotomasker met de 2D-microfluïdische kanaalontwerpen op de maskerhouder en plaats de siliciumwafer met de SU-8-coating naar boven gericht op de waferhouder. Stel de belichtingsinstellingen in voor 150 millijullen per vierkante centimeter en laat de machine draaien.

Na de UV-blootstelling dompelt u de siliciumwafer gedurende drie tot vier minuten onder in de SU-8 developer-oplossing met zachte agitatie. Verwijder vervolgens de wafer uit de oplossing en spoel het oppervlak af met isopropanol. Plaats vervolgens de siliciumwafel gedurende 30 minuten in een oven van 150 graden Celsius voor een harde bakbeurt.

Laat het vervolgens afkoelen tot kamertemperatuur voordat u stylusproilometrie gebruikt om de exacte hoogte en helling van de zijwanden van het kanaal te meten. Plaats vervolgens een milliliter fotoweerstand op het oppervlak van de glasschuif en voer het programma opnieuw uit. Zodra het systeem tot stilstand komt, schakelt u de stofzuiger uit en verwijdert u de glasschuif.

Nadat u het fotomasker met de 2D-elektrodeontwerpen op de maskerhouder hebt bevestigd, plaatst u de glazen wafer met de S-1818-coating naar boven gericht op de waferhouder en lijnt u deze uit. Stel de belichtingsinstellingen in voor 215 millijullen per vierkante centimeter en laat de machine draaien. Na de belichting dompelde u de glazen schuif gedurende twee minuten onder in de MF-319-ontwikkelaarsoplossing, waarbij zachte agitatie werd aangebracht.

Verwijder vervolgens de glazen wafer en spoel het oppervlak af met gedeïoniseerd water. Plaats ten slotte de glasschuif in de oven van 150 graden Celsius voor een harde bak, zodat het oppervlak van de substraten naar boven is gericht. Haal na 30 minuten de glijbaan uit de oven en bescherm deze tegen licht.

Om de glasschuif te etsen, dompelt u deze gedurende één minuut onder in een 10 tot 1 gebufferde fluorwaterstofzuuroplossing in een polytetrafluorethyleencontainer. Breng vervolgens over en was de glasglijders drie keer in gedeïoniseerd water. Vervolgens sputtert het gebruik van een fysiek dampafzettingssysteem titanium gedurende acht minuten met een snelheid van 100 angstroms per minuut en platina gedurende 10 minuten met 200 angstroms per minuut.

Om vervolgens de fotoweerstand op te tillen, dompelt u de met metaal gecoate glazen glijbanen gedurende 10 minuten onder in een acetonbad en soniceert u het bad om agitatie te introduceren. Gebruik indien nodig een met aceton gedrenkt doekje om eventuele resten te verwijderen. Volgende voor polydimethylsiloxaan replica molding maakt de PDMS elastomeer basis met een verharder op een 10 tot 1 gewichtsverhouding in een wegwerpcontainer geplaatst op een elektronische balans.

Giet vervolgens de PDMS-oplossing over de siliciumwafer en plaats het mengsel onder een vacuüm om luchtbellen te verwijderen. Nadat u het mengsel minimaal vier uur op 65 graden Celsius hebt uitgehard, gebruikt u de punt van een scheermesje om het gegoten PDMS uit te snijden en uit de siliciumwafer te pellen. Verwijder vervolgens met behulp van een geslepen biopsiepunch het PDMS uit de inlaat en uitgangen van het apparaat.

Programmeer vervolgens de plasmagenerator voor PDMS-binding. Plaats vervolgens de PDMS- en elektrodeglasschuif in het systeem met de functies naar boven gericht en voer het programma uit. Nadat het programma is voltooid, verwijdert u de apparaten en gebruikt u een stereoscoop om snel kanaalfuncties uit te lijnen met de elektroden.

Oefen stevig druk uit vanuit het midden van het PDMS naar de zijkanten om ongewenste luchtbellen op de verlijmingsinterface te verwijderen. Oogst de HEK293-cellen, centrifugeer ze en resuspensieer de pellet in elektroporatiebuffer met ongeveer vijf miljoen cellen per milliliter. Voeg vervolgens plasma-DNA-codering voor GFP toe aan een uiteindelijke concentratie van 20 microgram per milliliter en meng voorzichtig.

Breng vervolgens de plasma-DNA-celsuspensie over in een spuit van één kubieke centimeter voor experimenten. Plaats het microdevice via een diahouder op het podium van de microscoop. Schakel vervolgens het opgeladen gekoppelde apparaat, de CCD-camera, in en breng het microfluïdische kanaal in beeld.

Vervolgens stelt u voor elektroporatie met één cel het debiet van de spuitpomp in op 0,1 tot 0,3 microliter per minuut om de stroom van afzonderlijke cellen door de elektrodenset te garanderen. Stel vervolgens de pulsparameters in voor de initiële en laagste elektroporatiepuls voor elektrische energie. Volg een vooraf bepaald aantal celdetecties per pulstoepassing.

Aan het einde van elke geteste toestand ademt u cellen uit de microdevice-uitgang en vult u de uitlaat aan met herstelmedia. Herhaal tot de volgende elektroporatiepulsconditie en herhaal dit totdat alle elektroporatiepulscondities zijn getest. Bepaal vervolgens de elektroporatiepulsparameters voor populatiegebaseerde feedback met hoge doorvoer.

Voor populatiegebaseerde feedbackgestuurde elektroporatie stelt u het pompdebiet van de spuit in op één tot drie microliter per minuut en stelt u de pulsamplitude in op de geoptimaliseerde toestand. Schakel vervolgens de triggermodus uit en stel de pulsbreedte in op de transittijd van de cel. Nadat het gewenste aantal cellen is geëlektropoeerd, schakelt u zowel de spuitpomp als de functiegenerator uit.

Breng vervolgens de cellen van het uitlaatreservoir over in een celkweekkolf of -plaat van de juiste grootte gevuld met voorverwarmde herstelmedia en breng de kweekkolf of -plaat over in een incubator. Voor gegevensanalyse laadt u de gegevens in een analysesoftware en genereert u een plot van stroom versus tijd voor elke pulserende toestand. Bepaal vervolgens de mate van celmembraanpermeabilisatie, genereer de celmembraanpermeabilisatiekaart over alle geteste pulsomstandigheden en controleer de optimale pulserende toestand.

Leg na de incubatie epifluorescentiebeelden vast met FITC en verre rode filters en analyseer de beeldsets handmatig of via een algoritme. De werkingsprincipes achter de single cell level permeabilization detection voor een enkele pulsamplitude worden hier belicht. Na elke elektroporatiepulsparameter wordt de op een na hoogste energie-elektroporatiepuls getest.

De celmembraanpermeabilisatiekaart voor HEK293-cellen toonde een duidelijke correlatie tussen toegepaste elektrische energie en de mate van celmembraanpermeabilisatie. In dit experiment werd een elektrische veldsterkte van 1,8 kilovolt per centimeter en een puls van 670 microseconden als optimaal bepaald. Bij deze waarden werd een elektrotransfectie-efficiëntie van 70% bereikt.

In tegenstelling tot een elektrische veldsterkte van 0,4 kilovolt per centimeter en een pulsduur van drie milliseconden, was de elektrotransfectie-efficiëntie na 24 uur minder dan 5%De term recept, die vaak wordt gebruikt bij het beschrijven van het specifieke van het microfabricageproces, is het belang van het volgen of optimaliseren van elke stap om een functionerend apparaat met succes te fabriceren. Deze elektroporatietechnologie kan worden gebruikt in aanvullende biomedische onderzoeksprojecten zoals het genereren en testen van CAR T-cellen of het optimaliseren en testen van CRISPR-Cas9 genbewerkingstechnieken. Deze micro-elektroporatietechnologie maakt het mogelijk om de reacties van verschillende celtypen elektrisch te ondervragen om de elektrische pulserende omstandigheden toe te passen en die informatie te correleren met de levering van klinisch relevante moleculaire lading.