Elektrowetting-based Digital Microfluidics Platform for Automated Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Door de activering van afzonderlijke druppels te automatiseren, kunnen complexe sequenties van een laboratoriumeenheid in één chip worden gebracht. Ons digitale microfluïde platform pakt snelle specifieke in-field detectie van viruspathogenen aan. Deze methode is gebaseerd op kwantitatieve detectie van specifieke antigenen met behulp van EWOD-gebaseerde digitale microfluidics in combinatie met magnetische immunoprecipitatie.

In deze bijdrage wordt de methode beoordeeld aan de hand van monsters die verschillende concentraties bacteriën, sporen, virussen en eiwitten bevatten. Dit proces is volledig geautomatiseerd, sequentiële, schaalbare en veelzijdige. De volgorde van en het druppelvolume kunnen worden aangepast aan de vereisten van een bepaald protocol.

Omzeilen van de antilichaam-gebaseerde sensing volledig, digitale microfluidics platform zou kunnen bouwen aan een potentiële toepassing op basis van aptamer biosensing waar de magnetische kralen dragen specifieke aptamers voor het vastleggen en detectie van nucleotide sequenties. Bij het proberen van deze techniek voor de eerste keer, is het belangrijk om het type oppervlakteactieve werking te overwegen en hoe het interageert met uw keuze van biochemie en de hydrofobe polymeer coating. Begin met het verwijderen van de magneet van de digitale microfluidics of DMF platform en het plaatsen van het op de bank.

Plaats een schone actuatieplaat op het roterende stadium met het chroom naar boven gericht, waarbij de plaat wordt uitgelijnd met de linkerbovenhoek van het verzonken stadium. Klem de bedieningsplaat vanaf de bovenkant met behulp van het paneel met de 47 contactpennen, die de plaat op zijn plaats zetten en de uitlijning met de contactpennen vergemakkelijken. Zet vervolgens de 0,5 millimeter shim en de twee millimeter PMMA separator op het roterende podium om een gecontroleerde opening tussen de actuatie- en afdekplaten te bieden.

Om de druppels op de voorgestelde laadpaden te laden, worden vier druppels van 2,5 microliter uit de lopende buffer op de B,A, R en E aangegeven pads met één druppel per pad aangegeven. Dan aliquot 2,5 microliter luminol waterstofperoxide oplossing op de E aangeduid pad. Vervolgens, aliquot 2,5 microliter van Neutravidin geconjugeerd aan HRP biotinylated secundaire antilichamen en microbeads op de F, G, en ik aangeduid pads respectievelijk.

Tot slot, aliquot 2.5 microliter van het onbekende monster op de C aangeduid pad. Plaats de afdekplaat op het oppervlak van het tuig naast het ronde uitsparingsgebied en schuif deze lateraal in de uitsparing en bovenop de actuatieplaat. Leg de permanente magneet op de cover plaat en zet het vast door het schuiven van de twee vergrendelingen, draai dan het podium met 180 graden en inspecteer het visueel om ervoor te zorgen dat de geladen druppels zijn nog steeds op zijn plaats.

Controleer of de laadpositie voor elke druppel overeenkomt met de geprogrammeerde actuatiereeks in de software. Plaats de gescreende fototector in de sleuf van de roterende fase en sluit de kabel aan. Plaats het deksel over het DMF-platform en start de programmareeks met behulp van de software-interface.

Droplet locatie wordt geregistreerd via capacitieve sensing en kan vervolgens worden waargenomen op de gebruikersinterface. De programmareeks vraagt berichten die op de interface verschijnen om de operator te informeren dat de luminoldruppel klaar is om de geëxtraheerde magnetische kralen te verzamelen of de detectiedruppel is klaar om naar de detectiesite te worden verplaatst. In beide gevallen is de bevestiging van de operator vereist om door te gaan.

De lichtintensiteit geproduceerd door chemiluminescent reactie wordt gelezen door fotodetector en opgenomen in real time. Als u in de visuele modus wilt werken voor optimalisatie van protocollen, start u de programmareeks met behulp van de software-interface. De geautomatiseerde druppelactuatie kan worden gevisualiseerd op de chip voor elk van de kritische teststappen, zoals magnetische extractie van de kralen, kralen resuspensie en mengen.

Wanneer gevraagd, monteer de fotodetector gescreend kan in de spleet van de roterende fase. Sluit de kabel van de gescreende fototector aan door de pinnen in het stopcontact te plaatsen. Plaats het deksel over het DMF-platform en hervat de test.

Druppels worden gemonitord via capacitieve sensing en kunnen worden waargenomen op de gebruikersinterface. Om de apparatuur schoon te maken, opent u het DMF-platformdeksel en draait u het podium 180 graden. Los de magneetbehuizing los en verwijder de magneet uit het draaistadium.

Haal de siliciumwafer met een pincet uit de slip en spoel deze af met gedestilleerd water. Droog het vervolgens met perslucht en plaats deze in een petrischaaltje waar de wafer kan worden opgeslagen en hergebruikt. Gebruik een micropipet om het vloeibare afval van het pad te verwijderen zonder het oppervlak aan te raken en het oppervlak schoon te maken door de vloeistof met absorberend papier van de actuatieplaat te afvoeren.

Om de impact van de actuatiespanning te onderzoeken, werd een druppel uit de buffer op verschillende actuatiespanningen aangedreven en werd de beweging ervan geregistreerd. Een correlatie tussen Vrms en de gemiddelde snelheid werd aangetoond en een snelheidsplateau werd waargenomen na een bepaalde Vrms-waarde. De levensduur van de actuatieplaat werd verminderd toen de hoge waarden voor Vrms werden gebruikt.

Voor de werking van de extractielaboratorium werd de druppel met de zwevende kralen naar het scheidingsterrein in het midden van de mengzone gereden. Vervolgens werd de magneet automatisch geactiveerd om de chip te benaderen en de kralen te richten. Vervolgens werd de druppel verplaatst naar het afvalkussen, waardoor de kralen achterbleef.

De extractie- en menginstallatiebewerkingen op de EWOD-chip vergemakkelijkten een geminiaturiseerde snelle en reproduceerbare monsterverwerking met opeenvolgende detectie van de ziekteverwekkers in 6 tot 10 minuten. Incubatietijden en conjugaatconcentraties varieerden om de optimale omstandigheden voor de test te vinden. Er werd vastgesteld dat de incubatietijd van 160 seconden en conjugaatconcentratie van twee microgram per milliliter de beste signaal-ruisverhouding bereikten.

Variaties in het protocol kunnen worden geïntroduceerd om de gewenste niveaus van automatisering te bereiken. De acht-staps ELISA werd gebruikt om verschillende antigenen zoals Bacillus atrophaeus sporen en de MS2 bacteriofaag te detecteren. Ondertussen werd het 10-stappenprotocol gebruikt om E.coli te kwantificeren.

Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de toegepaste spanningen, de concentraties van analyten en reagentia optimaal zijn voor de activering van de druppels en een succesvolle magnetische scheiding op de chip. Om een nauwkeurige meting te bereiken, moet de bindingscapaciteit van kralen worden overwogen en kunnen seriële verdunningen van de analyten nodig zijn. Door het type antilichaam uit te wisselen, kon men verschillende ziekteverwekkers detecteren dan die in de resultatensectie.

De methode kan ook worden toegepast voor bijvoorbeeld biomarkerdetectie of point-of-care diagnostiek. Naast de reeds gepresenteerde toepassingen is het systeem ontwikkeld met in-field detectie van pathogene pathogenen in de lucht in het achterhoofd. DMF is een ideaal platform voor deze toepassing omdat het druppelvolume overeenkomt met de output van andere sampler die we onlangs hebben ontwikkeld.