Isogene nierglomeruluschip ontworpen uit door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen

De isogene glomeruluschip zal patiëntspecifieke ziektemodellering en nefrotoxiciteitstests en geavanceerde precisiegeneeskundetoepassingen mogelijk maken. Glomerulair epitheel en endotheel zijn afgeleid van een enkele populatie van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen, of IPSC's. IPSC's bezitten onbeperkte zelfvernieuwing en kunnen zich onderscheiden in bijna elk celtype.

Deze techniek kan worden gebruikt om pathologische cellulaire fenotypen en ziekten te beoordelen. De patiëntspecifieke orgaanchip kan ook dienen als platform voor geneesmiddelenscreening en mechanistische studies. Dit model kan worden toegepast op de ontwikkeling van een lichaam op een chipsysteem dat is gepersonaliseerd voor een specifieke patiënt.

Dit systeem heeft het potentieel om patiëntspecifieke reacties te voorspellen voorafgaand aan klinische tests. Begin met het voorzichtig toevoegen van 25 microliter keldermembraanmatrix 2-oplossing aan het urinekanaal en 20 microliter aan het capillaire kanaal van de chip. Neem twee steriele conische buisdoppen van 15 milliliter en vul ze met 500 microliter steriel gedestilleerd water.

Plaats de dop in de petrischaal om uitdroging te voorkomen en plaats het deksel op de schaal. Incubeer het bij 37 graden Celsius 's nachts. Vervolgens ademt u het medium op uit T75-kolven met een 15-daagse kweek van vasculaire endotheelcellen bij 90% confluentie.

Voeg vijf milliliter cellosmiddel toe en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende vijf tot zeven minuten. Breng vervolgens de cellen over naar een conische buis van 15 milliliter en voeg vijf milliliter DMEM / F-12 toe. Centrifugeer op 200 maal G gedurende vijf minuten.

Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 300 microliter endotheelonderhoudsmedium. Tel de cellen met een hemocytometer om ongeveer 2 miljoen cellen te verkrijgen. Spoel met behulp van een P200-barrièrepunt zowel de bovenste als de onderste kanalen van de microfluïdische chip met 200 microliter DMEM / F-12 terwijl u tegelijkertijd uit de periferie van de uitlaat zuigt.

Houd de chip stevig vast met de P200-barrièrepunt bevestigd aan de aspirator, weg van de uitlaat van het onderste kanaal. Injecteer stevig 20 microliter van de vasculaire endotheelcelsuspensie in het capillaire kanaal van de chip en zuig het medium voorzichtig op uit de periferie van de uitlaat. Controleer onder de microscoop op bubbels of een ongelijke zaaidichtheid.

Keer de chip voorzichtig om zodat de cellen zich kunnen hechten aan de basale kant van het flexibele PDMS-membraan. Plaats de chip in de houdercartridge en voeg drie milliliter PBS toe aan de cartridge om te voorkomen dat het membraan uitdroogt. Incubeer de chip drie uur lang bij 37 graden Celsius.

Controleer het onderste kanaal onder de microscoop op een confluente laag cellen die aan het flexibele PDMS-membraan is bevestigd. Was de niet-losgemaakte cellen door 200 microliter endotheelonderhoudsmedium toe te voegen aan de inlaat van het onderste kanaal terwijl u aspirateert uit de periferie van de capillaire kanaaluitlaat. Plaats de chip terug in de houdercartridge en incubeer 's nachts bij 37 graden Celsius.

Spoel de volgende dag voorzichtig het capillaire kanaal met 200 microliter endotheelonderhoudsmedium. Spoel het urinekanaal met 200 microliter DMEM/F-12 en laat 50 microliter DMEM/F-12 op de inlaat- en uitlaatpoorten vallen. Uitgaande intermediaire mesodermcellen, vervang het intermediaire mesoderm-inductiemedium uit elke put van de 12 putplaat door één milliliter Trypsine EDTA en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende vijf minuten.

Schraap de cellen voorzichtig met behulp van een cellifter en dissociëer de cellen met pipetteren. Voeg twee milliliter Trypsine-neutralisatieoplossing toe aan elke put en breng de cellen over naar een conische buis van 50 milliliter. Vul het volume van de celsuspensie aan tot 50 milliliter met DMEM/F-12 en centrifugeer gedurende vijf minuten op 200 maal G.

Aspirateer het supernatant en resuspendeer de cellen in 500 microliter intermediair mesoderm inductiemedium om ongeveer 3 miljoen cellen te verkrijgen. Tel de cellen met een hemocytometer. Houd de chip vast en injecteer stevig 25 microliter celsuspensie in het urinekanaal van de chip terwijl u het medium voorzichtig uit de periferie van de uitlaat aspirateert.

Controleer op bubbels of ongelijke celzaaidichtheid. Voeg drie milliliter PBS toe aan de cartridge van de chiphouder en incubeer gedurende drie uur bij 37 graden Celsius. Spoel na incubatie beide kanalen met 200 microliter van hun respectieve celkweekmedium.

Bevestig lege P200-barrièrepunten in beide uitgangen van de urine- en capillaire kanalen. Pipetteer 200 microliter endotheelonderhoudsmedium en injecteer de helft ervan in de capillaire kanaalinlaat. Laat de pipetpunt in de inlaat los, zodat zowel de inlaat als de uitlaat van het kanaal zijn bevestigd aan pipetpunten gevuld met medium.

Herhaal deze procedure voor de urinekanaalinlaat met 200 microliter intermediair mesodermonderhoudsmedium. Incubeer de chips met tips ingebed op 37 graden Celsius 's nachts. Om de chips aan te sluiten op de bioreactor van de orgaanchip, verwijdert u eerst P200-tips uit de kanalen.

Voeg druppels van de respectieve media toe aan de in- en uitlaat van de urine- en capillaire kanalen om uitdroging te voorkomen. Voeg drie milliliter warm podocyteninductiemedium toe aan het urine-inlaatreservoir en drie milliliter warm endotheelonderhoudsmedium aan het capillaire inlaatreservoir. Voeg 300 microliter van de betreffende media toe aan de uitlaatreservoirs direct boven de uitlaatpoort.

Schuif de peulen op de lade en in de bioreactor van de orgaanchip. Gebruik de draaiknop om de prime-cyclus gedurende twee minuten te selecteren en te starten. Inspecteer de onderkant van de pod visueel op kleine druppeltjes bij alle vier de vloeistofpoorten.

Om vloeistof-vloeistofcontact te bereiken tussen de onderkant van de pod en microfluïdische chippoorten, schuift u de chipdrager voorzichtig in de pod. Druk zachtjes op het tabblad van de chipdrager in en omhoog. Zuig overtollig medium van het oppervlak van de chip.

Stel het debiet van de orgaanchipbioreactor in op 60 microliter per uur. Stel de cyclische belasting in op 10% op 0,4 hertz. Gebruik de draaiknop op de bioreactor van de orgaanchip om de regelcyclus te selecteren en twee uur te laten draaien.

Inspecteer de uitlaatreservoirs visueel op een toename van het mediumniveau. Gebruik de draaiknop op de bioreactor van de orgaanchip om de regelcyclus te selecteren. Na dag 17 van de kweek, aspirateer dagelijks het medium uit de uitlaatreservoirs van het urinekanaal diagonaal weg van de poort, maar houd een medium in het reservoir.

Vul het urinekanaalinlaatreservoir aan met maximaal drie milliliter podocyteninductiemedium om de twee dagen gedurende vijf dagen. Na vijf dagen aspirateer het medium uit het urinekanaal, maar houd een medium in het reservoir. Vul het urinekanaalinlaatreservoir dagelijks aan met drie milliliter podocytenonderhoudsmedium.

Zuig op dezelfde manier het medium uit de capillaire kanaaluitlaat en vul de inlaatreservoirs dagelijks aan met endotheelonderhoudsmedium. Met behulp van dit protocol werden door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen gebruikt om een functioneel in vitro model van de glomerulus te ontwikkelen door vasculaire endotheelcellen en podocyten te verspreiden. Op dag 21 na podocyteninductie en vasculaire endotheelvoortplanting brachten de cellen in de chips afstammingsidentificatiemarkers tot expressie zoals Podocine en Nephrine voor podocyten, VE Cadherine en PECAM-1 voor vasculaire endotheelcellen.

Zowel de podocyten- als de vasculaire endotheelcellagen drukten Collageen IV uit, het meest voorkomende GBM-eiwit in de nierglomerulus. De glomeruluschips filterden selectief kleine moleculen zoals inuline uit het capillair in het urinekanaal, terwijl ze voorkwamen dat grote eiwitten zoals albumine het capillaire kanaal verlieten, wat een selectieve moleculaire filtratiefunctie vertoonde. Tijdens endotheelinductie op dag vier tot zeven kan een toename van het celaantal resulteren in een secundaire laag cellen, maar overzaaien kan aggregatie veroorzaken die differentiatie kan belemmeren.

Onverwachte vloeistofdoorkruisstroom tussen de urine- en capillaire kanalen kan worden waargenomen in geval van onvoldoende binding van de PDMS-chipcomponenten, verstopping in het vloeistofstroompad of gecompromitteerde filtratiebarrière. Bij het zaaien van endotheel en epitheel en het onderhouden van de chips vanaf dag 15 is het belangrijk om bij elke stap visueel te inspecteren op luchtbellen in de kanalen. In de isogene glomeruluschip kunnen klinisch relevante kandidaat-geneesmiddelen worden toegediend om hun therapeutisch potentieel of toxiciteitsniveaus te testen.

Deze techniek opent nu mogelijkheden om de genetische basis van menselijke nierziekten te begrijpen en gepersonaliseerde therapieën te ontwikkelen.