Computer numerieke controle Micromilling van een microfluïdisch acrylapparaat met een gespreide beperking voor magnetische immunoassays op basis van nanodeeltjes

Ons protocol beschrijft een micromillingmethode met hoge resolutie om een acryl microfluïdisch apparaat te fabriceren voor kwantitatieve immunodetectie van analytconcentraties vergelijkbaar met de gouden standaard ELISA-techniek. Het hoogtepunt is de fabricage van een eenvoudig en goedkoop thermoplastisch microfluïdisch apparaat zonder cleanroom, dat kortere testtijden en goede detectielimieten op een kwantitatieve manier mogelijk maakt. Begin met oppervlakteslijpen.

Snijd 9 x 25 millimeter rechthoeken van 1,3 millimeter dik PMMA met de 800 micrometer eindmolenbit. Bevestig een van deze rechthoeken voorzichtig met dubbelzijdig plakband aan het piëzo-elektrische platform. Sluit de Z-sensor aan en plaats deze op het oppervlak van de PMMA-rechthoek.

Selecteer de detectiepen en beweeg deze over het sensoroppervlak. Laat de pin handmatig zakken zonder contact te maken met de sensor. Activeer de Z-zero sensing-modus.

Draai de 200 micrometer eindfreesbit op 14.500 tpm. Laat het langzaam zakken naar de oorsprongscoördinaat op de z-as. Reset vervolgens de z-as 30 micrometer onder de oorsprong.

Stel deze coördinaat in als de nieuwe Z-oorsprong. Klik op de knop Knippen in de software van de micromolenmachine om het snijpaneel te activeren. Klik op de knop Toevoegen en selecteer het TXT-bestand met een eerder gemaakte code voor het slijpen van het acryloppervlak.

Klik op de knop Uitvoer om het proces te starten. Stel voor het frezen van de beperking van vijf micrometer eerst de rotatiesnelheid van het eindfreesbit in op 11.000 tpm. Verhoog vervolgens het platform met 6,5 micrometer met de interface van het piëzo-elektrische platform.

Verplaats de eindfreesbit langs de y-as met 500 micrometer. Breng het piëzo-elektrische platform terug naar de beginwaarde op de z-as met de besturingsinterface. Voer vervolgens het frezen van microkanalen uit door het eerder gemaakte ontwerpbestand vanuit de ontwerpsoftware te openen.

Klik op de knop Afdrukken, open het eigenschappenmenu en klik op het kleurenvenster dat overeenkomt met de laag met het te bewerken ontwerp. Stel de fabricageparameters in het gereedschapspaneel in. Voor het frezen van gaten, schakel over naar de 800 micrometer eindfreesbit.

Activeer de ontwerplaag van de gaten met een diameter van 1,2 millimeter door op het overeenkomstige kleurvenster te klikken en de bijbehorende fabricageparameters te selecteren. Machine twee extra gaten op contralaterale hoeken van de rechthoek voor de uitlijning van het acrylaat op een omgekeerde manier op een nieuw platform. Draai het acrylaat om en plak het met dubbelzijdig plakband over de adapter met de bewerkte pilaren.

Open het bestand met het ontwerp van de gaten voor het tegenovergestelde vlak van de ontwerpsoftware. Fres de resterende helft van de reagensinlaat- en uitlaatgaten met een diameter van 1,5 millimeter en een diepte van 0,7 millimeter. Reinig beide rechthoekige acrylplaten met isopropylalcohol en spoel af met gedestilleerd water.

Dompel het acrylaat gedurende 10 minuten onder in een ultrasoon bad. Droog beide acrylplaten en plak ze met dubbelzijdige tape aan de binnenkant van een glazen petrischaaldeksel. Plaats vervolgens de basis van de glazen petrischaal in een grotere glazen petrischaal.

Giet een milliliter chloroform in de basis van de petrischaal en plaats snel het deksel met de acrylplaten. Voeg onmiddellijk gedestilleerd water toe aan de basis van de grotere petrischaal tot het niveau van het petrischaaldeksel. Laat het acrylaat één minuut aan chloroformgas ontsnappen.

Kantel vervolgens de petrischaal om de waterafdichting te verbreken en leg de petrischaal onmiddellijk bloot. Voor het verlijmen, lijn beide acrylaten uit met de chloroform blootgestelde zijden face-to-face en vorm een sandwich. Plaats de acrylverf gedurende twee intervallen van twee minuten in de pers en verander de uitlijning van het acrylaat.

Bevestig vervolgens twee tot drie centimeter slang aan elk van de gaten van het apparaat met onmiddellijke drogende vloeibare lijm. Vul de kanalen met gedestilleerd water met behulp van een spuit. Dompel het apparaat gedurende 10 minuten onder in een ultrasoon bad.

Leeg vervolgens het water in de kanalen van het apparaat en gebruik een spuit om 5% BSA-oplossing te introduceren. Bereid een suspensie van ijzeren microdeeltjes met een diameter van 7,5 micrometer in 5% BSA. Incubeer de chip en de microdeeltjessuspensie met de blokkerende oplossing gedurende ten minste één uur bij kamertemperatuur.

Steek vervolgens de microdeeltjes in de chip met een spuitnaald door de uitlaatslang aan de zijkant. Plaats de chip verticaal en draai de chip vervolgens in twee stappen van 90 graden, zodat de microdeeltjes zich richten en compact zijn op de beperking van vijf micrometer. Sluit alle slangen van het acrylapparaat af met warmte.

Knip de inlaatslang door tot er nog maar een paar millimeter over is. Vul de doseernaald met wasbuffer en steek deze in de gesneden slang. Laat de oplossing druppelen en sluit de naald vervolgens aan op het apparaat.

Knip de uitlaatslang uit het laterale kanaal en sluit deze vervolgens aan op de spuitpomp. Herhaal vervolgens dezelfde procedure voor de uitlaatslang van het hoofdkanaal. Bevestig vervolgens de chip aan de magneet.

Voor immunodetectie, houd de wasbuffer gedurende 10 minuten stromen met 50 microliter per uur. Verwijder de resterende wasbuffer van de doseernaald met een micropipette en voeg 50 microliter van de nanodeeltjessuspensie toe. Laat de nanodeeltjessuspensie zeven minuten stromen met een stroomsnelheid van 100 microliter per uur.

Verander vervolgens het debiet in 50 microliter per uur en zet de stroom nog eens 15 minuten voort. Vervang de doseernaald en laat de wasbuffer gedurende 10 minuten met dezelfde snelheid stromen. Verwijder de resterende wasbuffer van de doseernaald met een micropipette en voeg 100 microliter van het fluorogene substraat toe.

Pas het debiet en de tijdparameters aan voor substraatinvoer, fluorescentiemeting en wasstap. Activeer de invoerstroom van het fluorogene substraat gedurende zes minuten met 50 microliter per uur. 15 seconden voordat de substraatstroom stopt, schakelt u de fluorescentie van de microscoop in.

Start de opname met de software van de microscoopcamera 10 seconden voordat het substraat stopt met een belichtingstijd van 1.000 milliseconden. Klik op de knop Start van de gewenste debietparameter onmiddellijk nadat de substraatwas stopt. Voer gedurende zes minuten beeldvorming uit met één frame per seconde.

Klik op de knop Start van de wasstroom onmiddellijk nadat de geselecteerde meetstroom is gestopt. Lysozyme geconjugeerde nanodeeltjes en paardenradijsperoxidase geconjugeerd secundair antilichaam werden gebruikt voor de immunoassay. Een toename van de fluorescentie-intensiteit voor verschillende concentraties van primair antilichaam werd waargenomen bij vergelijking van regio's voor en na de val, waaruit bleek dat de verandering in substraatfluorescentie recht evenredig is met de concentratie van primair antilichaam.

Voor een bepaalde concentratie van primair antilichaam werd de fluorescentie-intensiteit uitgezet als functie van de tijd bij verschillende stroomsnelheden van het fluorogene substraat. De conversiecapaciteit van het substraat door het HRP-enzym was omgekeerd evenredig met het debiet, een maximale intensiteit werd verkregen voor een stroomsnelheid van één microliter per uur. Voor de verschillende stroomsnelheden voor verschillende primaire antilichaamconcentraties toonden curven van de fluorescentieverschillen na en vóór immunoreactie aan dat voor een concentratie van 1.000 nanogram per milliliter de fluorescentie verzadigd is voor alle geëvalueerde stroomsnelheden.

Er werd een kalibratiecurve opgesteld met behulp van de maximale waarde van de verschillen in fluorescentie-intensiteit verkregen met betrekking tot de concentratie van primair antilichaam voor elk debiet. De hoge variabiliteit en hoge fluorescentieniveaus bij één microliter per uur suggereerden dat de snelheid de stroom van het reagerende substraat niet bevordert en de neiging heeft zich net na de val op te hopen. Speciale aandacht moet worden besteed aan de afdichtingsstappen van de microkanalen, omdat blootstelling aan chloroform zeer gevoelig is voor temperatuur.

Voor reproduceerbare resultaten moet de temperatuur altijd hetzelfde zijn. Ons systeem helpt te begrijpen waar compactheid en grootte van microdeeltjes, nanodeeltjesgrootte, antigenen, detectieantilichaam en substraat bepalende factoren zijn voor de detectielimiet in op nanodeeltjes gebaseerde microfluïdische immunoassay.