Name: Een microfluïdische platform voor Precision Small-volume monster verwerking en het gebruik ervan te Grootte Aparte Biologische Deeltjes met een akoestische microdevice (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Leer geautomatiseerde deeltjesscheiding met een akoestisch microfluïdisch apparaat voor biomedische toepassingen. Deze methode biedt precisie, modulariteit en minimaliseert analyetverlies bij kleine volumes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd uitgevoerd onder auspiciën van het U.S. Department of Energy door Lawrence Livermore National Laboratory onder Contract DE-AC52-07NA27344, en gedeeltelijk ondersteund door LLNL’s Laboratory Directed Research and Development (LDRD) programma, 14-LW-077. De auteurs danken Michael Wilson, Mark Stenglein en Joe DeRisi aan de Universiteit van Californië, San Francisco voor het genereus verstrekken van GGV en Boa-cel monsters. EJF erkent ondersteuning van het LLNL Lawrence Scholar Graduate Program. MS erkent ondersteuning van het UC Office of the President Lab Fees Research Program. LLNL-JRNL-665235

<ol><li>Gossett, D. R., Weaver, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label+free+cell+separation+and+sorting+in+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Label free cell separation and sorting in microfluidic systems.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3249-3267 (2010).</li>
<li>Lenshof, A., Laurell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+separation+of+cells+and+particles+in+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Continuous separation of cells and particles in microfluidic systems.</a> Chemical Society Reviews. 39 (3), 1203-1217 (2010).</li>
<li>Sajeesh, P., Sen, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+separation+and+sorting+in+microfluidic+devices+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluidics+and+Nanofluidics%22%5BJournal%5D)">Particle separation and sorting in microfluidic devices a review.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 17 (1), 1-52 (2014).</li>
<li>Bhagat, A. A. S., Bow, H., Hou, H. W., Tan, S. J., Han, J., Lim, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+cell+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+%26+Biological+Engineering+%26+Computing%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for cell separation.</a> Medical & Biological Engineering & Computing. 48 (10), 999-1014 (2010).</li>
<li>McGrath, J., Jimenez, M., Bridle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deterministic+lateral+displacement+for+particle+separation+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Deterministic lateral displacement for particle separation a review.</a> Lab Chip. 14 (21), 4139-4158 (2014).</li>
<li>Jubery, T. Z., Srivastava, S. K., Dutta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dielectrophoretic+separation+of+bioparticles+in+microdevices+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22ELECTROPHORESIS%22%5BJournal%5D)">Dielectrophoretic separation of bioparticles in microdevices A review.</a> ELECTROPHORESIS. 35 (5), 691-713 (2014).</li>
<li>Jin, C., McFaul, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technologies+for+label+free+separation+of+circulating+tumor+cells+from+historical+foundations+to+recent+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Technologies for label free separation of circulating tumor cells from historical foundations to recent developments.</a> Lab on a Chip. 14 (1), 32(2014).</li>
<li>Trujillo, F. J., Juliano, P., Barbosa Cánovas, G., Knoerzer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+suspensions+and+emulsions+via+ultrasonic+standing+waves+%E2%80%93+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasonics+Sonochemistry%22%5BJournal%5D)">Separation of suspensions and emulsions via ultrasonic standing waves – A review.</a> Ultrasonics Sonochemistry. 21 (6), 2151-2164 (2014).</li>
<li>Bridle, H., Miller, B., Desmulliez, M. P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+microfluidics+in+waterborne+pathogen+monitoring+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Research%22%5BJournal%5D)">Application of microfluidics in waterborne pathogen monitoring A review.</a> Water Research. 55, 256-271 (2014).</li>
<li>Mariella Jr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation+the+weak+link+in+microfluidics-based+biodetection%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+microdevices%22%5BJournal%5D)">Sample preparation the weak link in microfluidics-based biodetection.</a> Biomedical microdevices. 10 (6), 777-784 (2008).</li>
<li>Gor’kov, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+forces+acting+on+a+small+particle+in+an+acoustic+field+in+an+ideal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Soviet+Physics+Doklady%22%5BJournal%5D)">On the forces acting on a small particle in an acoustic field in an ideal fluid.</a> Soviet Physics Doklady. 6, 773-775 (1962).</li>
<li>Settnes, M., Bruus, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forces+acting+on+a+small+particle+in+an+acoustical+field+in+a+viscous+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+E%22%5BJournal%5D)">Forces acting on a small particle in an acoustical field in a viscous fluid.</a> Physical Review E. 85 (1), 016327(2012).</li>
<li>Barnkob, R., Augustsson, P., Laurell, T., Bruus, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustic+radiation+and+streaming-induced+microparticle+velocities+determined+by+microparticle+image+velocimetry+in+an+ultrasound+symmetry+plane%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+E%22%5BJournal%5D)">Acoustic radiation and streaming-induced microparticle velocities determined by microparticle image velocimetry in an ultrasound symmetry plane.</a> Physical Review E. 86 (5), (2012).</li>
<li>Bruus, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustofluidics+7+The+acoustic+radiation+force+on+small+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Acoustofluidics 7 The acoustic radiation force on small particles.</a> Lab Chip. 12 (6), 1014-1021 (2012).</li>
<li>Fong, E. J., Johnston, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustic+focusing+with+engineered+node+locations+for+high+performance+microfluidic+particle+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Acoustic focusing with engineered node locations for high performance microfluidic particle separation.</a> Analyst. 139 (5), 1192-1200 (2014).</li>
<li>Fong, E. J., Bora, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuously+Variable+Node+Position+in+a+High+Throughput+Acoustofluidic+Device%5BTitle%5D)+AND+%22Micro+Total+Analysis+Systems%22%5BJournal%5D)">Continuously Variable Node Position in a High Throughput Acoustofluidic Device.</a> Micro Total Analysis Systems. , 1184-1186 (2014).</li>
<li>Jung, S. Y., Notton, T., Fong, E., Shusteff, M., Weinberger, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+tuning+of+acoustofluidic+pressure+nodes+by+altering+net+sonic+velocity+enables+high-throughput+efficient+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Spatial tuning of acoustofluidic pressure nodes by altering net sonic velocity enables high-throughput efficient cell sorting.</a> Lab on a Chip. 15 (4), 1000-1003 (2015).</li>
<li>Franssila, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+Reactive+Ion+Etching%5BTitle%5D)+AND+%22Introduction+to+Microfabrication%22%5BJournal%5D)">Deep Reactive Ion Etching.</a> Introduction to Microfabrication. , 255-270 (2010).</li>
<li>Sharma Rao, B., Hashim, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Photomask+Design+Using+CAD+Software+for+Application+in+Lab+On+Chip+Biomedical+Nanodiagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Photomask Design Using CAD Software for Application in Lab On Chip Biomedical Nanodiagnostics.</a> Advanced Materials Research. 795, 388-392 (2013).</li>
<li>Melin, J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Large+Scale+Integration+The+Evolution+of+Design+Rules+for+Biological+Automation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Large Scale Integration The Evolution of Design Rules for Biological Automation.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36 (1), 213-231 (2007).</li>
<li>Madou, M. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMadou%2C+MJ+%22Fundamentals+of+microfabrication%3A+the+science+of+miniaturization%22">Fundamentals of microfabrication: the science of miniaturization</a>. , CRC Press. Boca Raton. (2002).</li>
<li>Krulevitch, P., Benett, W., Hamilton, J., Maghribi, M., Rose, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+based+packaging+platform+for+hybrid+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Polymer based packaging platform for hybrid microfluidic systems.</a> Biomedical Microdevices. 4 (4), 301-308 (2002).</li>
<li>Leslie, D. C., Easley, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+specific+flow+control+in+microfluidic+circuits+with+passive+elastomeric+features%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Physics%22%5BJournal%5D)">Frequency specific flow control in microfluidic circuits with passive elastomeric features.</a> Nature Physics. 5 (3), 231-235 (2009).</li>
<li>Oh, K. W., Lee, K., Ahn, B., Furlani, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+pressure+driven+microfluidic+networks+using+electric+circuit+analogy%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Design of pressure driven microfluidic networks using electric circuit analogy.</a> Lab on a Chip. 12 (3), 515-545 (2012).</li>
<li>Mittelbrunn, M., Gutiérrez Vázquez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unidirectional+transfer+of+microRNA+loaded+exosomes+from+T+cells+to+antigen+presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Unidirectional transfer of microRNA loaded exosomes from T cells to antigen presenting cells.</a> Nature Communications. 2, 282(2011).</li>
<li>Acosta, E. G., Castilla, V., Damonte, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+entry+of+dengue+virus+into+Aedes+albopictus+mosquito+cells+is+dependent+on+clathrin+mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Functional entry of dengue virus into Aedes albopictus mosquito cells is dependent on clathrin mediated endocytosis.</a> Journal of General Virology. 89 (2), 474-484 (2008).</li>
<li>Stenglein, M. D., Sanders, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+Characterization+and+In+Vitro+Culture+of+Highly+Divergent+Arenaviruses+from+Boa+Constrictors+and+Annulated+Tree+Boas+Candidate+Etiological+Agents+for+Snake+Inclusion+Body+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Identification Characterization and In Vitro Culture of Highly Divergent Arenaviruses from Boa Constrictors and Annulated Tree Boas Candidate Etiological Agents for Snake Inclusion Body Disease.</a> 3 (4), e00180 12(2012).</li>
<li>Arenaviridae Viral Hemorrhagic Fevers (VHFs). , CDC. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.cdc.gov/vhf/virus-families/arenaviridae.html">http://www.cdc.gov/vhf/virus-families/arenaviridae.html</a> (2013).</li>
<li>Packard, M., Wheeler, E., Alocilja, E., Shusteff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+Evaluation+of+Fast+Microfluidic+Thermal+Lysis+of+Bacteria+for+Diagnostic+Sample+Preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Performance Evaluation of Fast Microfluidic Thermal Lysis of Bacteria for Diagnostic Sample Preparation.</a> Diagnostics. 3 (1), 105-116 (2013).</li>
<li>Lion, N., Reymond, F., Girault, H. H., Rossier, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+the+move+to+microfluidics+for+protein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Why the move to microfluidics for protein analysis.</a> Current Opinion in Biotechnology. 15 (1), 31-37 (2004).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol geeft de system-level integratie van microfluïdische apparaten op macroschaal apparatuur om geautomatiseerde verwerking van biologisch monster uit te voeren. De modulariteit van dit platform maakt het mogelijk om aanpasbaar aan elke continue stroom apparaat, en, als voorbeeld, de gepresenteerde protocol is gericht op het karakteriseren en optimaliseren van de prestaties van een acoustofluidic deeltjes- scheidingsinrichting. Drie grote voordelen van dit protocol zijn gemarkeerd: (i) modulariteit en chip-to-wereld interfacing, (ii) uitgebreide karakterisering van de prestaties van het apparaat, en (iii) automatische verwerking van nauwkeurig gedoseerde monster volumes voor deeltjesfysica scheiding. ik. Modulariteit en chip-to-wereld interfacing Zoals getoond in figuur 2, wordt de microfluïdische chip gemonteerd op een aangepaste breadboard om gemakkelijk op een microscoop podium voor directe waarneming. De broodplank bevat # 6-40 UNF schroefgaten op een 5 mm-pitch raster, enabling de chip te beveiligen en fluïdumverbindingen worden gemaakt. De vloeistofaansluitingen worden PEEK buis met gedraaide einden, waarbij afdichting tegen vloeibare chip met een rubber-face pakking en een roestvrij stalen kraag. Deze interface regeling zorgt voor een gemakkelijke en snelle vervanging chip apparaat redesign, waarvoor weinig of geen wijzigingen in andere onderdelen van het systeem, mits chip voetafdrukken voldoen aan het raster formaat. Zo hebben we dit platform met microfluïdische chips voor de continue stroming elektroforese thermische cellysis, 29 snel mengen van reagentia voor chemische synthese en eencellige capture en ondervraging. ik ik. Robuuste karakterisering van prestaties van het apparaat Om de prestatie van elke microfluïdische scheidingsinrichting optimaliseren de werkzaamheden eerst grondig gekarakteriseerd. De hier beschreven systeem ondersteunt de ontwikkeling van snelle en geautomatiseerde protocollen om dit te doen. Voor de specifieke example akoestische focusseerinrichtingen, de focusserende kwaliteit, werkfrequentie en de positie van de gerichte deeltjes in de microfluïdische kanaal worden gemeten voor elk apparaat. Deze metingen vereisen vegen door een reeks van piezoceramic rijden frequenties, spanningen en debieten, om de optimale parameter combinaties voor hoogwaardige scheiding identificeren. Het gepresenteerde protocol verschilt automatisch deze instelbare parameters en vangt de betreffende data- dwz fluorescentiebeelden deeltjes stroomt in het kanaal dat nabewerkt tot de vereiste afmetingen van deeltjes concentreren, het aantal keren, en de positie (figuur 3) genereren. Volledige karakterisering van akoestische prestaties van het apparaat moet herhalen van de stappen 4.4 en 4.5 als nodig is onder verschillende experimentele omstandigheden. Zo wordt de absolute scherpstelpositie van een chip gevonden door uitvoering van de frequentiescan relatief lage stroomsnelheden en hoogspannings volledige migratie naar de knooppuntlocatie waarborgen. Bovendien kunnen dergelijke frequentiescans de kwaliteit van inrichtingsamenstel (indien uitgevoerd met polystyreen kralen van bekende grootte) beoordelen of om te bepalen hoe een eerder onbekend soort deeltje gedragen in het systeem (nadat een chip is gekarakteriseerd met kralen). Een chip met goede energieoverdracht van de piezoceramic de microfluïdische kanaal resulteert in strakke focus bij hoge stroomsnelheden (&gt; 1 ml / min) en de lage spanning (V pp 12-15), terwijl die met slechte energieoverdracht niet eens richten bij lage stroomsnelheden (&lt;100 pl / min) en hoge spanningen (&gt; 20 V pp). Wij hebben gevonden dat innig contact tussen de microfluïdische chip en de piëzokeramische is essentieel voor efficiënte energieoverdracht in de vloeistof. Verder onderzoek van de optimale methode van hechten van de microfluïdische chip en de piëzokeramische zal betrouwbare productie van hoogwaardige apparaten. Tenslotte volledigbeeld van de werking van een acoustophoretic apparaat kan worden verkregen door het combineren van de beeldgebaseerde frequentie scanmetingen van Stap 4 (en figuur 3) met deeltjesaantallen vanuit het SPO LPO als functies van de relevante bedrijfsparameters vanuit scheidingsexperimenten met microbolletjes uitgevoerd zoals beschreven in Stap 5. Zoals getoond in figuur 6, kan een dergelijke reeks geautomatiseerde experimenten snel karakteriseren van de prestaties van een individu apparaat en tunability informeren van de gebruiker van de optimale parameter speelt de inrichting voor deeltjesscheiding bedienen. iii. Geautomatiseerde kleine steekproef verwerking voor deeltjesscheiding Voor een succesvolle en nauwkeurige microfluïdische chip-gebaseerde monster verwerking, is het essentieel om betrouwbaar en nauwkeurig meter, belasting, leveren, en het verzamelen van de hoeveelheden vloeistof als ze door. Deze nauwkeurigheid is vooral belangrijk wanneer het monster volume is klein(~ 0,1-1 ml), die gebruikelijk is in klinische of onderzoekslaboratorium instellingen. 30 Precise sample handling is een uitdaging in traditionele microfluïdische experimenten die manuele terugtrekking van het monster in een spuit en infusie in een apparaat gebruiken zonder feedback van wanneer het monster heeft gescheiden en wanneer deze moet worden verzameld. De gepresenteerde protocol wendt geautomatiseerde monster spoel het laden en het afgeven in combinatie met real-time feedback van stroom sensoren om reproduceerbare scheidingen van kleine steekproef volumes mogelijk te maken. Figuur 5 toont de stroom profielen gemeten op de SPO LPO van een typische scheiding experiment. Ten eerste leidt buffer van ten minste 35 gl geladen in een stabiele stroom voordat het monster akoestische chip bereikt. Monstervolumes minder dan 100 gl worden niet aanbevolen voor deze systeemconfiguratie, omdat monsterverdunning vanwege de leidende buffer excessief. Een plug van lucht wordt gebruikt bij het begin van the injectie voordat de leidende buffer om het monster stekker scheiden van de vloeistof die volgt voorkomen menging en verdunning van monster en dient als indicator voor de flowsensoren. Na een voorbijgaande als vloeistof begint te bewegen door het systeem scherpe piek signalen in beide uitstroomopeningen geven de doorgang van de eerste luchtbel. Deze transiënten worden gevolgd door een langdurige stabiele stroom wanneer het monster stroomt door het systeem, een piek wanneer de tweede luchtbel passeert, en tenslotte een eventuele afname van de stroomsnelheid tot nul na de injectiepomp stopt. De passage van de lucht door de pluggen flow sensoren wordt gebruikt als triggerpoints de ventielen schakelen starten en stoppen monstername, de gemaskeerde monster en verdunning minimaliseren van niet-monstervloeistof volumes. Closed-loop dosering van verwerkte monstervolumina hoeft te herprogrammeren deze waarden voor de aanvang van het experiment telkens de input sample veranderd. Deze functie isvooral belangrijk wanneer monstervolume beperkt is, bijvoorbeeld bij vele klinische monsters. Real-time stroom bewaking helpt ook bij het oplossen van problemen; een slechte run (bijvoorbeeld een belemmering vormen in een van de uitlaten) is onmiddellijk duidelijk uit de resultante stromingsprofielen, zoals in figuur 5b. Om de flexibiliteit en doelmatigheid van acoustofluidic scheiding met gebruikmaking van de systeemarchitectuur, gezuiverd DENV en GGV virusvoorraden demonstreren werden ingespoten in cel voorraden en gescheiden door verwerking via de microfluïdische chip. Figuur 7a toont dat Raji-cellen werden goed gescheiden van virussen, zoals 97 % van Raji cellen verlaten de chip bleken in het LPO, waardoor een sterk verrijkt monster van DENV in de SPO verlaten. In vergelijking, de efficiëntie van DENV scheiding was lager, met 70% van DENV verlaten van de chip in de SPO. Dit kan worden toegeschreven aan de geringe convectieve menging geïnduceerd door de windingen van de separatiop kanaal, maar meer waarschijnlijk enige DENV deeltjes migreert samen met de Raji cellen in de LPO. Cellen migreren lateraal over stroomlijnt slepen wat vocht met hen, zelfs bij lage Reynolds getal. Door dit mechanisme, en niet-specifieke adsorptie oppervlak, virusdeeltjes over in het LPO. Toch is de sterk verrijkt monster DENV in het SPO is een belangrijk voordeel, bijvoorbeeld wanneer de novo sequentie wordt gebruikt voor het opsporen en virussen te identificeren. Figuur 7b toont dat in een experimentele run, slechts ongeveer 70% van de cellen Boa verlaten de chip werden gevonden in het LPO, tegen bijna 100% scheidingsrendement van Raji-cellen. Het verschil in scheidingsprestatie tussen de twee celtypen kan worden toegeschreven aan een kleinere gemiddelde grootte of een lagere dichtheid van Boa cellen in vergelijking met Raji-cellen, dus resulteert in kleinere akoestische krachten. Om te bevestigen of weerleggen deze veronderstellingen, de grootte, dichtheid en morfologie van Boacellen in suspensie (die normaal hechtende kweken) van Boa cellen moeten nauwkeurig worden gemeten, een poging voor verder onderzoek. In dezelfde experimenten vergelijkbaar met de experimenten met DENV het grootste deel van het gewonnen GGV verlaten van de SPO, wijst op een verrijking van de virale fractie. De gepresenteerde gegevens benadrukken de inherente problemen van techniek breed toepasbare platforms voor het verwerken van een verscheidenheid van biologische monsters. Belangrijk is, kan de biologische interacties gaan even grote rol spelen als de fysische en mechanische effecten. Echter, deze voorlopige experimenten de kracht en de belofte van het gebruik van dit systeem architectuur voor monster verwerking in de klinische en wetenschappelijke toepassingen tonen ook aan. Als een robuuste, goed gekarakteriseerd ontworpen systeem, dit platform biedt de mogelijkheid om antwoorden op nieuwe wetenschappelijke vragen te zoeken.

Sample scheiding en fractionering is een van de meest veelbelovende toepassingsgebieden van microfluïdische technologie. Dergelijke sample handling stappen zijn integraal voor een effectieve klinische diagnostiek, therapeutische ontwikkeling, biosurveillance inspanningen, en de vooruitgang in het leven wetenschappelijk onderzoek en technologie. Talloze microfluïdische scheidingsstrategieën aangetoond voor vloeistof zwevende deeltjes en colloïden, alsmede voor chemische en biologische species; verschillende reviews bieden overzicht van de recente vorderingen en de ontwikkelingen op deze gebieden 1-9. Hoewel veel van deze microfluïdische scheidingstechnieken (hierna &quot;Core Devices&quot;) zijn uitgebreid gekarakteriseerd, zijn enkele rapporten als het monster scheiding probleem op systeemniveau. De Core apparaten zijn meestal individuele centimeter schaal chips, gekoppeld aan fluorpolymeren buizen, met vloeistof door een verplaatsing of druk pomp geleverd.Toch, als de belofte van microfluidics - waaronder meer automatisering, betrouwbaarheid en vermindering van monstervolumes - is werkelijkheid te laten worden, ten minste een gelijkwaardige inspanning moet worden besteed aan het ontwerp van een volledige scheiding systeem waarin de Core Device is geïntegreerd . Daarnaast is een grote uitdaging voor microfluïdische benaderingen BioDetection is de macro micro-interface. Dit betreft niet alleen de fysieke &quot;wereld naar chip&quot; verbindingen van een microfluïdische inrichting macroschaal componenten en de mismatch tussen typische klinische en analytische monstervolumes (~ 0,1-10 ml) en het inwendige volume van microfluïdische chips (~ 0,01-10 ui), maar ook voor de statistische steekproef beperkingen die voortvloeien uit het overbruggen van deze formaataanduidingen. Deze kwesties dragen bij aan de perceptie dat monster pre-processing en voorbereiding zijn de &#39;zwakke schakel&#39; van BioDetection. 10 De in dit werk ta beschreven platformkes belangrijke stappen in de richting van het aanpakken van deze uitdagingen. Het nemen van een system-level view, dit protocol worden de betrouwbare verwerking van nauwkeurig gedoseerde analytische schaal volumes (variërend 0,15-1,5 ml) op ~ 10 min tijdschalen. Dit is een &quot;one-button&quot; bediening: zodra de bron flacon met het monster en bestemming flesjes voor fractie collectie in het systeem worden geplaatst, de &quot;run&quot; commando initieert de procedure, en alle stappen zijn computergestuurd. Aan het einde van een run, kan de collectie flacons worden verwijderd uit het systeem voor de downstream-analyse van de gescheiden fracties. De Core-apparaat in dit systeem is een acoustophoresis chip die zoogdiercellen-formaat (5-20 pm) deeltjes uittreksels uit de steekproef. Acoustophoretic scheiding wordt hier gekozen voornamelijk omdat het high-throughput (tot 100s van pl / min), label-free en non-contact, en biedt dus voordelen bij het scheiden van levensvatbare viruses uit cellen die weinig andere microfluïdische technieken kan evenaren. De fysica van de akoestische deeltjes scherpstellen zijn uitvoerig beschreven, 11-13 en zijn niet de focus van dit protocol, maar een korte samenvatting van de onderliggende concepten volgt om te helpen bij het ​​begrijpen van de applicatie om microfluïdische scheiding. Ultrasone staande golven resoneert in met vloeistof gevulde microkanalen produceren drukvelden, die tot krachten die deeltjes drijven richting knopen van lagedruk geven. De kracht magnitude afhankelijk van het volume van het deeltje, en een akoestisch contrast factor afgeleid van de relatieve dichtheden en compressibilities van het deeltje en het suspenderende vloeistof. 14 Als zodanig akoestische gericht is ideaal voor het scheiden van cellen-sized (~ 7-15 pm) van virus-en kleinbedrijf (~ 50-200 nm) deeltjes. De grotere deeltjes migreren naar een druk knooppunt; Aangezien de kracht magnitude is zeer klein voordeeltjes kleiner dan 2-3 urn, deze kleine deeltjes of opgeloste species nauwelijks bewegen helemaal. De specifieke implementatie van dempingwaarde, zoals eerder beschreven, 15 bevat een dunne wand voor het vloeistofkanaal verdelen en maakt afstembare, asymmetrische plaatsing van de scherpstelpositie. Dit voegt flexibiliteit in het apparaat design en de prestaties voordelen, waaronder verhoogde afscheiding kwaliteit en snelheid zijn volledig elders beschreven. 16,17 Echter, een belangrijk voordeel van de in dit werk beschreven systeemniveau ontwerpbenadering is dat het kan worden aangepast aan een grote verscheidenheid van microfluïdische apparaten Core. Zo kunnen bijvoorbeeld de meeste andere doorstroom scheiding modes, waaronder inertie, stroom-veld fractionering, deterministische laterale verplaatsing (DLD), en diverse soorten elektrokinetische apparaten gemakkelijk worden opgenomen, met de nodige aanpassingen om rekening te houden met veranderingen in de inlaat / uitlaat configuratie , stroomsnelheden,en sample volumes. Apparaten met verschillende soorten on-chip velden (elektrisch, magnetisch) of gradiënten (thermisch, chemisch) kunnen aanvullende verbindingen met de chip of de integratie van extra hardware, waarbij dit platform herbergt nodig. Dit protocol voorziet in de stappen die nodig zijn om een ​​microfluïdische scheiding apparaat te ontwerpen, en silicium-glazen chips te fabriceren door diepe reactief ionen etsen (DRIE, een plasma-etsproces verkrijgbaar in vele microfabricage faciliteiten, die gebruik maakt van afwisselende cycli van etsen en passiveren tot diep te bereiken eigenschappen met verticale zijwanden 18). Vervolgens beschrijven we de karakterisering van het acoustofluidic apparaat om de optimale bedrijfsparameters voor de scheiding vast, en tenslotte detail de volledig geïntegreerde scheidingssysteem en de procedure voor het verwerken van biologische monsters. Typische apparaat karakterisering resultaten en monster verwerking van gegevens worden vervolgens gepresenteerd en besproken, en de belangrijkste voordelen van deze voorkomendach zijn gemarkeerd, zoals modulariteit, robuustheid, precisie en automatisering.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Materials vereist voor Stappen 1-3: Apparaatontwerp, fabricage en assemblage</td></tr><tr><td>Dubbelzijdige gepolijste siliciumwafer</td><td>Silicon Quest International, Inc. San Jose, CA, USA</td><td>100 mm &lt;100>&nbsp; prime wafer</td><td>1-20 ohm-cm, 495 &#177; 25&#160;&micro;m Dubbelzijdig gepolijst</td></tr><tr><td>Glazen wafer</td><td>Bullen Ultrasonics, Eaton, OH, USA</td><td>100 mmx0.5 mm Boro</td><td></td></tr><tr><td>Fotoresist, AZ 1518</td><td>MicroChemicals GmbH, Ulm, Duitsland</td><td>AZ 1518</td><td>Fotoresist gebruikt om wafer aan lege wafer te hechten voor DRIE-etsen</td></tr><tr><td>Fotoresist, AZ 4620</td><td>MicroChemicals GmbH, Ulm, Duitsland</td><td>AZ 4620</td><td>Fotoresist om vloeistof- en via-maskerpatronen te definiëren</td></tr><tr><td>DRIE plasma-etser</td><td>STPS, Newport, NP, Verenigd Koninkrijk</td><td>Multiplex Advance Oxide Etch (AOE) ICP-systeem</td><td></td></tr><tr><td>Wafer Bonder</td><td>Electronic Visions Group,&nbsp; St.Florian am Inn, Oostenrijk</td><td>EVG 501</td><td></td></tr><tr><td>Schneidzaag</td><td>Kulicke &amp; Soffa Industries, Singapore</td><td>K&amp;S 982</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy kit</td><td>Epoxy Technology, Billerica, MA, USA</td><td>EPO-TEK 301</td><td>Epoxy gebruikt om piezo en microfluïdische chip te koppelen</td></tr><tr><td>PZT piezokeramisch&nbsp;</td><td>Piezo Systems, Woburn, MA, USA</td><td>PSI-5A4E</td><td>37.5 &times; 10 &times; 0.5 mm</td></tr><tr><td>28 AWG Kynar-geïsoleerde massieve draad</td><td>Squires Electronics, Cornelius, OR, USA</td><td>UL1422</td><td></td></tr><tr><td>2-delig zilveren epoxy&nbsp;</td><td>MG Chemicals, Surrey, BC, Canada</td><td>8331</td><td>Geleidend lijmmiddel voor het bevestigen van draadgeleiders aan PZT</td></tr><tr><td>L-edit</td><td>Tanner EDA, Monrovia, CA, USA</td><td>Ledit v15.1 64-bit</td><td>CAD-software voor maskerlay-out</td></tr><tr><td colspan="4">Materialen vereist voor Stap 4: Karakterisering van akoestische focusprestaties</td></tr><tr><td>Dual Pump</td><td>Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA</td><td>PHD ULTRA Series, 703007</td><td></td></tr><tr><td>5&#160;ml spuiten</td><td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Luer naar draadpoort-adapter</td><td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td><td>P-659</td><td>Verbindt spuit met slang</td></tr><tr><td>Verbinding</td><td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td><td>P-623</td><td>Verbindt wereld naar chip-verbindingen naar fluoropolymeerslang.&nbsp; Kan ook web gebruiken&nbsp;</td></tr><tr><td>Ferrule 1/4-28 platte bodem</td><td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td><td>P-200</td><td>Gebruikt met moer om verbindingen te maken tussen slang en spuit, flowsensoren en wereld naar chip-hardware</td></tr><tr><td>Moer&nbsp; 1/4-28 platte bodem</td><td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td><td>P-202</td><td>Gebruikt met ferrule om verbindingen te maken tussen slang en spuit, flowsensoren en wereld naar chip-hardware</td></tr><tr><td>1/16" OD Fluoropolymeerslang</td><td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td><td>1912L</td><td>Slang om spuitpompen te verbinden met wereld naar chip-verbindingen.&nbsp; Slangmaat is niet kritisch tijdens calibratie-stappen (.01-.03" ID typisch gebruikt, andere geschikte onderdeelnummers: 1907L, 1902L).</td></tr><tr><td>Klein ID fluoropolymeerslang</td><td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td><td>1476-20</td><td>Gebruikt voor Stroombegrenzers: 0.006" ID, 1/16" OD FEP&nbsp;</td></tr><tr><td>PEEK-slang</td><td></td><td></td><td>Verbindt van chip naar fluoropolymeerslang.</td></tr><tr><td>Koelventilator</td><td>Multicomp, Leeds, Engeland</td><td>MC19663</td><td></td></tr><tr><td>Functiegenerator</td><td>Agilent, Santa Clara, CA, USA</td><td>33220A</td><td></td></tr><tr><td>RF-versterker</td><td>ENI, Rochester, NY</td><td>325 LA</td><td>Moet signalen kunnen versterken van &lt;1&#160;V in het bereik van 1-2&#160;MHz tot 25&#160;Vpp naar de piezo.</td></tr><tr><td>CCD-camera</td><td>Photometrics, Tucscon, AZ, USA</td><td>CoolSnap HQ</td><td></td></tr><tr><td>Omgekeerde microscoop</td><td>Zeiss, Oberkochen, Duitsland</td><td>Axiovert S100</td><td></td></tr><tr><td>FITC-filterset</td><td>Chroma Tech, VT, USA</td><td>SP101</td><td></td></tr><tr><td>Objectief, 10X</td><td>Zeiss, Oberkochen, Duitsland</td><td>ACHROPLAN</td><td></td></tr><tr><td>Oscilloscoop</td><td>Tektronix, Beaverton, OR, USA</td><td>TDS3014B</td><td>Om spanningsuitgang door RF-versterker te bewaken</td></tr><tr><td>MatLab</td><td>Mathworks, Natick, MA, USA</td><td>R2014a</td><td></td></tr><tr><td>Driver-interfacesoftware om Photometrics-camera te integreren met LabVIEW</td><td>R Cubed Software, Lawrenceville, NJ, USA</td><td>SITK</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich, St. Lousi, MO, USA</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Dragon Green Fluorescent 5.76 of 7.32&#160;&micro;m Beads</td><td>Bangs Laboratory, IN, USA</td><td>FS06F</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Aanvullende materialen vereist voor Stap 5: Geautomatiseerde scheiding</td></tr><tr><td>Multiport kleppen</td><td>VICI, Houston, TX, USA</td><td>C25Z-3180EUHA</td><td>In de huidige configuratie zijn 4 kleppen nodig</td></tr><tr><td>Flow Sensors</td><td>Sensirion, Westlake Village, CA, USA</td><td>SLI-1000</td><td></td></tr><tr><td>Fluoropolymeerslang,.01 en.03" ID</td><td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td><td>1902L en 1912L</td><td>Hoge zuiverheid PFA bij voorkeur</td></tr><tr><td>Moer</td><td>VICI, Houston, TX, USA</td><td>ZN1PK-10</td><td>Gebruikt met ferrule om verbindingen te maken tussen slang en kleppen. Alternatieve onderdeelnummers: MZN1PK-10, LZN1PK-10</td></tr><tr><td>Ferrule</td><td>VICI, Houston, TX, USA</td><td>ZGF1PK-10</td><td>Gebruikt met moer om verbindingen te maken tussen slang en kleppen.&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National Instruments, Austin, TX, USA</td><td>LabVIEW Professional Development System</td><td>Laboratoriumautomatiseringssoftware</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Teknova, Hollister, CA,

een microfluïdische platform voor precision small-volume monster verwerking en het gebruik ervan te grootte aparte biologische deeltjes met een akoestische microdevice

A Microfluidic Platform for Precision Small-volume Sample Processing and Its Use to Size Separate Biological Particles with an Acoustic Microdevice

Een groot voordeel van microfluïdische apparaten is de mogelijkheid om kleine steekproef volumes manipuleren, waardoor reagens afval verminderen en het behoud van kostbare monster. Echter, robuuste sample manipulatie bereiken is het noodzakelijk device integratie richten de macroschaal omgeving. Om herhaalbare, gevoelige deeltje scheiding met microfluïdische apparaten te realiseren, dit protocol presenteert een compleet geautomatiseerde en geïntegreerde microfluïdische platform dat precieze verwerking van 0,15-1,5 ml monsters met behulp van microfluïdische apparaten mogelijk maakt. Belangrijke aspecten van dit systeem zijn onder modulaire apparaat lay-out en robuuste armaturen resulteert in betrouwbare en flexibele wereld om verbindingen chip, en volledig geautomatiseerde materiaalbehandeling die closed-loop monstername, systeem schoonmaken en priming stappen om herhaalbare werking volbrengt. Verschillende microfluïdische inrichtingen kunnen uitwisselbaar worden gebruikt met deze architectuur. Een acoustofluidic apparaat Hier nemen we, detail zijn characterizatie, performance optimalisatie, en demonstreren het gebruik ervan voor de grootte-scheiding van biologische monsters. Door het gebruik van real-time feedback tijdens de scheiding experimenten wordt monstername geoptimaliseerd om te besparen en zich te concentreren monster. Hoewel die de integratie van meerdere apparaten, voordeel van deze architectuur zijn de mogelijkheid om onbekende monsters te verwerken zonder extra systeemoptimalisatie, gemakkelijke vervangingsapparaat en nauwkeurige en robuuste monster verwerking.

Belangrijkste kenmerken van de akoestische-microfluïdische apparaat ontwerp zijn aangegeven in figuur 1, en ​​volledig elders beschreven. 15 In het kort, twee vloeistofstromen stroming side-by-side in een scheidingskanaal, gescheiden van een parallelle omloopkanaal een dunne silicium wand. Aangezien de primaire stralingskracht magnitudeschalen met deeltjesvolume, grote deeltjes migreren uit het gemengde monster invoerstroom naar de akoestische druk knooppunt in het aangrenzende stroom terugwinning vloeistof, terwijl kleine deeltjes blijven in de oorspronkelijke stroom (Figuur 1B, C). De onderverdeeld tweekanaals architectuur verbetert deeltjesscheiding 17 en maakt aanpassing van het knooppunt positie met behulp van verschillende bypass kanaal vloeistoffen. 16 van de vloeibare broodplank en armaturen levert een robuust platform voor de wereld om verbindingen chip, en het modulaire ontwerp maakt een snelle wisseling tussen vloeibare chips (Figuur 2). Deze configuration eveneens laat omkeerbaar vloeistofaansluitingen, welke afdichting tot 1000 psi, snel en betrouwbaar (figuur 2B, E) worden gemaakt. De resonantiefrequentie f res van een chip kan worden geschat met behulp van eenvoudige 1D analytische berekeningen (zie stap 1.1.1). Uit uitgebreider 2D eindige elementen model van ons apparaat dwarsdoorsnede 16 de verwachte focus positie 2-node resonantie 225 urn van de wand en de verwachte frequentie 1,68 MHz. Echter, kunnen f res van echte apparaten variëren met ± 100 kHz, afhankelijk van de temperatuur en de koppeling van longitudinale en laterale resonanties. Dus na inrichtingssamenstel, f res moeten empirisch geverifieerd relevant stroomsnelheden en piëzo-aanstuurspanningen, zoals beschreven in stap 4 van het protocol. Figuur 3 toont representatieve frequentie scans op 200 pl / min,<html> met water in de hoofd- en bypass-kanalen en 20 V pp geleverd aan de piëzo. Bij koppeling tussen de piezo en microfluïdische inrichting goed, zal deeltjes stevig gericht op de resonantiefrequentie, waardoor een duidelijke piek in de fluorescentie-intensiteit en migratie naar de verwachte focus positie (figuur 3A). Daarentegen, als er slechte koppeling deeltjes niet goed gericht en de resultaten frequentie scan overeenkomstig figuur 3B zijn. In dergelijke inrichtingen nodig de piezo transducer opnieuw worden gemonteerd als een reversibele lijm is gebruikt; anders is dit apparaat niet geschikt wanneer hoge kwaliteit scherpstellen of snelle doorstroming cruciaal zijn voor de gewenste toepassing. De gegevens in figuur 3 op de hoogte van de keuze van de operationele frequentie voor de volgende experimenten, en de spanning en debiet assortiment beschikbaar voor een efficiënte deeltjes scheiding. Bestanden / ftp_upload / 53.051 / 53051fig5.jpg &quot;/&gt; Figuur 5. Geautomatiseerde monster verwerking. (A) Schematische weergave van het monster in de steekproef spoel geladen. (B) Vertegenwoordiger stroom profiel van een succesvolle scheiding experiment. (C) Flow profiel van een scheiding te voeren waarin de SPO afvoer verstopt op circa 220 sec. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53051/53051fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> Na het identificeren van chips die effectief afscheiders, worden deze opgenomen in het systeem weergegeven in figuur 4. Totale systeem slagvolume wordt geminimaliseerd door slangen met een 0,01 &quot;binnendiameter langs de hoofdstroom pad (blauwe lijnen). Figuur 5A toont de make-up van een typisch monster plug toegediend via het systeem. Een kleine hoeveelheid &quot;leading buffer&quot; (~ 35 pi) moet Precede het monster in de stroom naar debietschommelingen elimineren terwijl het monster beweegt door de scheidingsinrichting chip. Figuur 5B toont stroom data verkregen door succesvolle geautomatiseerde dempingwaarde experiment. Belangrijkste kenmerken van een succesvolle run omvatten: (1) een tijdelijke verhoging van de stroomsnelheid in zowel de LPO en SPO als de druk bouwt en vloeistof begint te stromen door het systeem, (2) een scherpe piek met vermelding van de passage van een luchtbel (de bijvoegsel toont een geëxpandeerd profiel van een enkele bel), waarbij de SPO vóór de LPO zal bereiken als gevolg van de ongelijke stroming van de beide uitlaten (3) stabiele stroom door beide uitstroomopeningen tussen de twee luchtbellen wanneer het monster beweegt door het systeem, en (4) een geleidelijke afname van de stromingssnelheid in beide uitlaten nadat het volledige monstervolume wordt geleverd aan het systeem. Problematisch runs vallen direct uit stromingsprofielen vergelijkbaar met figuur 5C, wanneer blijkt dat de SPO raakte verstopt na ongeveer 220 seconden. In thi<html> s geval een schoonmaak werkwijze gelijk aan die beschreven in stap 5.3 beschreven worden uitgevoerd om het kanaal ontstoppen. <img alt="Figuur 6" src="/files/ftp_upload/53051/53051fig6.jpg" /> Figuur 6. Device tunability: deeltjesgrootte en Voltage Effects. Percentage polystyreen microbolletjes in het LPO gewonnen is afhankelijk van de deeltjesgrootte en spanning aan de piëzokeramische geleverd. Elke lijn correspondeert met een andere werkspanning bij de resonantiefrequentie bepaald zoals beschreven in stap 4. Totaal stroomsnelheid door de inrichting 200 pl / min, met toegepaste aandrijving frequenties tussen 1,62 en 1,64 MHz. Foutbalken geven de standaardafwijking van ten minste drie afzonderlijke experimenten. Gereproduceerd en gewijzigd met toestemming van de Royal Society of Chemistry van http://pubs.rsc.org / nl / Content / ArticleLanding / 2014 / AN / c4an00034j.target = &quot;_ blank&quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 6 toont opgesteld scheidingsresultaten behulp van polystyreen verschillende deeltjesgrootten en piezo stuurspanningen die de bedrijfsparameters die nodig zijn voor efficiënte scheiding te tonen. In het algemeen worden hogere spanningen (dwz meer akoestische krachten) nodig om kleinere deeltjes te extraheren, zoals verwacht. Stuurspanningen kan niet onbeperkt worden verhoogd, echter, vanwege een grotere warmteafvoer en toenemende effecten van akoestische streaming. 13 De plot dient als een algemene richtlijn voor deeltjesscheiding-deeltjesgrootte die significant verschillend herstel in een bepaalde stuurspanning (bijvoorbeeld 10- tonen en 2-um-deeltjes bij 8,8 V pp) zal goed scheiden. In het algemeen deeltjesgroepen met een groot verschil in grootte, zoals virussen (~ 100 nm) en cellen (~ 10 urn) kunnen snel en efficiënt worden gescheiden, evenals cellen van diffErent maten (bv 6-8 um schijfvormige erytrocyten en 8-15 um leukocyten). De specifieke omstandigheden moeten werken met andere celtypen moeten empirisch worden bepaald, zoals celvorm, dichtheid en samendrukbaarheid invloed op de akoestische contrast, naast celgrootte. Daartoe de procedures in stap 4 zijn nuttig voor het bepalen bruikbaar scheidingsomstandigheden voor nieuwe cel of deeltje soort, en niet alleen om de kwaliteit van een bepaald acoustophoresis inrichting. <img alt="Figuur 7" src="/files/ftp_upload/53051/53051fig7.jpg" /> Figuur 7. Scheiding Efficiency van Cell-Virus Spiked monsters. Scheiding resultaten van (A) Raji cellen die verrijkt met Dengue virus (DENV) en (B) Raji cellen en Boa niercellen verrijkt met Golden Gate Virus (GGV). Percentages verzameld worden gedefinieerd als de fractie van virussen of cellen verlaten van een specifiekeoutlet vergeleken met het totaal verlaten van de chip. De foutbalken voor (A) is de standaardafwijking van 3 proeven, terwijl de monsters in (B) slechts eenmaal verwerkt wegens de lage beschikbare hoeveelheden. 1x PBS werd gebruikt als het monsterbuffer en nuttige vloeistof, met water in het omloopkanaal voor alle experimenten. Chip operationele frequenties varieerden tussen 1,60 en 1,64 MHz, met drive spanningen tussen 16 en 20 V pp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53051/53051fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> Om het nut van dit platform voor biologisch deeltje scheiding aan te tonen, hebben we eerst gebruikt om goed gekarakteriseerd biologische monsters te verwerken: de menselijke Raji cellen (10 5 cellen / ml, de gemiddelde diameter van 8-10 um 25) verrijkt met dengue virus (DENV, 10 5 pfu / ml, ongeveer een diameter van 50 nm 26). Figuur 7A toont het percentage Raji cellen en DENV in zowel de SPO LPO verzameld (gedefinieerd als de fractie van elk deeltje vanuit elke uitlaat ten opzichte van de totale hoeveelheid van elk verzameld uit de chip deeltje). Het experiment werd herhaald in drievoud en Raji cellen werden gekwantificeerd onder toepassing van een Coulter teller, terwijl DENV werd gekwantificeerd met behulp van een reverse-transcriptie kwantitatieve polymerasekettingreactie (RT-qPCR). Vervolgens wordt de prestatie van het systeem werd getest in een scenario die realistischer voor het verwerken van klinische monsters, waarbij de exacte eigenschappen van de deeltjes bekend kan zijn en de beschikbare monsterhoeveelheden lager. Hier onderzochten we scheiding van de recent geïdentificeerde golden gate virus (GGV), een slang pathogeen infecteren boaconstrictor niercellen. 27 het formaat van GGV virusdeeltje nog niet gemeten, maar omdat GGV behoort tot de familie Arenaviridae het waarschijnlijk van eenvergelijkbare grootte, tussen 100 en 150 nm. 28 We verwerkte monsters met GGV spiked (10 4 pfu / ml) in de Raji menselijke cellen (niet een infectie doelstelling voor het virus), en boa niercellen (infectie doelwit voor GGV, geschatte grootte 10 pm 27), beide celtypen bij 10 4 cellen / ml. Als deze monsters beschikbaar waren in kleine hoeveelheden, zijn scheiding voortvloeit uit slechts één experimentele run gemeld in dit werk. Figuur 7B toont het percentage van Raji cellen, Boa cellen en GGV verzameld uit de SPO en de LPO. De cellen werden in deze experimenten gekwantificeerd door telling op een hemacytometer en virussen werden gekwantificeerd door RT-qPCR.

Dit protocol beschrijft een systeemarchitectuur voor het uitvoeren van geautomatiseerde scheidingen van kleine volumes (0,15–1,5 ml) deeltjes met behulp van een microfluïdisch apparaat, en bespreekt methoden om de prestaties en werking van acoustofluïdische apparaten te optimaliseren.

Een microfluïdische platform voor Precision Small-volume monster verwerking en het gebruik ervan te Grootte Aparte Biologische Deeltjes met een akoestische microdevice

A major advantage of microfluidic devices is the ability to manipulate small sample volumes, thus reducing reagent waste and preserving precious sample. ...

Het algemene doel van deze procedure is het uitvoeren van geautomatiseerde scheidingen van kleine volumes partikels met behulp van een microfluïdisch fotisch apparaat. Deze methode kan cruciale procedures in het veld van de biomedische techniek mogelijk maken, waaronder robuuste verwerking en scheiding van monsters voor bio-detectie en klinische onderzoeksapplicaties. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn modulariteit, precisie, robuustheid en automatisering, waardoor deze niet alleen aanpasbaar en flexibel is voor reticulocytenscheiding, maar voor een breed scala aan flow-through microfluïdische scheidingsapparaten.We erkenden eerst de noodzaak van deze mogelijkheid om routinematig en betrouwbaar scheidingen uit te voeren op biologische monstervolumes van minder dan een millimeter, zonder significante verdunning of verlies van de analyt. De integratie van monstermeting en geautomatiseerde routering van de bron naar de opvangbestanden, samen met standaard operaties van de spuitpomp, is cruciaal om op deze schaal succesvol te kunnen werken. Begin met het ontwerpen van het akoestische reticulatieapparaat en de lay-out voor de twee fotomaskers, zoals beschreven in sectie één van het bijbehorende tekstprotocol.Breng vervolgens het patroon van de vloeistofpoorten aan op de achterzijde van een dubbelzijdig gepolijste 1 0 0 siliciumwafer. Gebruik standaard positieve resist-fotolithografie en ets deze geometrie met behulp van deep reactive ion etching tot een diepte van 350 tot 400 micrometer. Draai daarna de wafer om en breng het patroon van de vloeistofkanaalgeometrie aan op de voorzijde.Pas opnieuw standaard fotolithografie met een positieve resist toe en bevestig de gepatroonde wafer vervolgens aan een tweede blanco siliconen dragerwafer. Ets nu met behulp van fotolak de blootgestelde kanalen tot een diepte van 200 micrometers. Gebruik hiervoor deep reactive ion etching en week de device-wafer vervolgens in een resist-striploesing om deze van de blanco siliconen wafer te scheiden.Reinig vervolgens de device-wafer en een kenmerkloze borosilicaatglas-wafer van 0,5 millimeter dik met piranha-oplossing. Nadat deze gereinigd zijn, worden de vloeistofkanalen afgedicht door de glas- en siliciumwafer ionisch te binden volgens de hier getoonde condities. Snijd tot slot de individuele chips uit elkaar met een diamantzaagblad op een dicing-zaag met een twee-componenten epoxykit met lage viscositeit.Weeg de aanbevolen verhouding van beide componenten af en meng ze grondig. Plaats vervolgens het loodzirkonaattitanaat of PCT-piëzokeramiek in een geschikte mal en gebruik een pipet om ongeveer 10 µL van het epoxymengsel gelijkmatig over het oppervlak te verspreiden om een dunne, egale laag te creëren. Plaats daarna de chip in de mal en lijn de epoxyzijde van het piëzokeramiek uit met de microfluïdische chip.Het kan nodig zijn om de chip met tape vast te zetten om deze op zijn plaats te houden tijdens het uitlijnen. Klem de assemblage in een bankschroef, waarbij u er op let dat er geen componenten barsten, en hanteer de temperatuur en duur die door de fabrikant van de epoxy worden aanbevolen. Nadat de epoxy is uitgehard, gebruikt u een soldeerbout met een fijne punt om dunne draden aan elke zijde van de piëzokeramiek te bevestigen.Gebruik indien nodig het geschikte vloeimiddel om het pizo-oppervlak voor te bereiden. Zorg voor het kortst mogelijke contact met de pizo om thermische depolarisatie te voorkomen. Bevestig de chip aan een fluidisch breadboard met behulp van klembeugels.Bevestig daarnaast een koelventilator aan het breadboard om de temperatuur tijdens akoestische experimenten te reguleren. Schroef vervolgens de chip vast aan de world-connectoren. Monteer het breadboard op de microscooptafel en verbind de world-to-chip-connectoren met aanvullende slangen bij de in- en uitlaten.Gebruik standaard 1/4"-28draadkoppelingen. Verbind de microfluïdische chip via 1/16" buisjes met de spuitpomp, door de computer aangestuurde multiport-selectieventielen, de op de pc aangesloten debietmeters en de buisjes zoals hier getoond en beschreven in figuur vier van het bijbehorende tekstprotocol. Vul vóór het uitvoeren van de scheiding de reservoirs met reinigingsreagens en spoel de bijbehorende vloeistoflijnen door.Stel daarnaast kleppen drie en vier bij de uitgangen van de chip zo in dat de stroom aanvankelijk naar de afvalreservoirs loopt. Zet vervolgens de koelventilator aan. Verbind de leidingen van de piëzokeramiek met de vermogensversterker en stel de functiegenerator in op de resonantiefrequentie van de gebruikte akoestische chip.Stel het spanningssetpunt op de functiegenerator zo in dat de RF-versterker tussen de 12 en 25 volt piek-tot-piek uitstoot, afhankelijk van de gewenste scheiding. Sluit vervolgens de juiste opvangbuisjes en het buffer-inlaatbuisje aan op het systeem. Gebruik de monsterbuffer die geschikt is voor de te scheiden cellen of partikels, of zoals vereist door de analyse-assay die na de scheiding zal worden gebruikt.Laad vervolgens de aansturingssoftware en gebruik deze om de kleppen, debietsensoren en pomp te bedienen om de volledig automatische prime- en scheidingsroutine uit te voeren. Vortex het monsterbuisje kort vlak voor het starten van de scheidingsprocedure om eventuele bezonken deeltjes opnieuw te suspenderen. Pipetteer het monster alternatief 10 keer op en neer om biologische monsters te mengen die gevoeliger zijn voor beschadiging of klonteren door vortexen.Bevestig vervolgens het monsterbuisje aan de invoerlijn en start onmiddellijk de routine voor het ontluchten en scheiden. Begin met het gebruiken van de software om de luchtinlaat van klep één en twee te ontluchten, zodat er geen vloeistof in de slang aanwezig is. Ontlucht gelijktijdig de slang die het buffer-invoerbuisje met klep twee verbindt en de slang die het monster-invoerbuisje met klep één verbindt.Laat de spuitpomp ongeveer 15 µL uit beide vials opzuigen om de slang volledig te vullen en deze met de kleppen te verbinden. Zet vervolgens klep één en twee op afval om eventuele overtollige vloeistof of lucht die in de laadspiraal is gekomen, te verwijderen. Stel daarna het programma in om de monsterspiraal te laden door eerst 25 µL lucht op te zuigen met een snelheid van 50 µL per minuut.Laad vervolgens 250 µL monster met een snelheid van 200 µL per minuut, gevolgd door 35 µL leidingsbuffer met 200 µL per minuut, en tot slot nogmaals 25 µL lucht met 50 µL per minuut. Stel daarna de spuitpompen zo in dat de geladen vloeistofpluggen met 100 µL per minuut worden geïnfuseerd en monitor de stroomsnelheden bij de uitlaten voor kleine en grote deeltjes met behulp van stroomsensoren. De juiste stroomverhouding kan worden bepaald zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol.Wanneer de flowsensoren een piek in de stroomsnelheid detecteren die duidt op het passeren van de eerste luchtkloof, schakelt u de overeenkomstige uitgangsklep van het afvalbuisje naar een monsteropvangbuisje. Zorg ervoor dat de stroming stabiel is terwijl het monster door de chip beweegt en gescheiden wordt, door de oders van de flowsensoren te observeren. Terwijl het monster door de chip stroomt, worden de gescheiden fracties opgevangen bij de uitgangskleppen.Observe aan het einde van de monsterplug de flowsensor en detecteer de tweede luchtspleet. Schakel op dit punt de uitgangskleppen terug naar afval. Nadat het volledige volume is gedispenseerd, stopt u de infusie van de spuitpomp en beëindigt u de automatiseringsroutine.Nadat het scheidingsexperiment is voltooid, koppelt u de opvangflesjes voor de kleine en grote partikelmonsters los en bewaart u deze op de juiste wijze voor latere analyse. Plaats de monsteropnamebuis in lege flesjes om overtollige reinigingsoplossingen op te vangen die door de buisjes worden gespoeld. Start vervolgens de geautomatiseerde reinigingsprocedure van het systeem zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol.Tijdens dit proces zal het programma de kleppen en de spuitpomp aansturen om de holdcoil opeenvolgend te vullen met reinigingsreagentia en deze door het systeem te spoelen. Zodra het geautomatiseerde reinigings- en decomcontaminatieproces is voltooid, moeten de overtollige spoeloplossingen en de vials waarin ze zijn opgevangen worden afgevoerd volgens de geldende procedures voor het hanteren van biologisch of chemisch afval. Hier wordt een representatieve frequentiescan getoond van een goed gekoppelde piezo en microfluidisch apparaat.Wanneer de koppeling tussen de piëzo en het microfluïdische apparaat goed is, focussen de deeltjes strak bij de resonantiefrequentie, wat resulteert in een duidelijke piek in de fluorescentie-intensiteit en migratie naar de verwachte focuspositie. In contrast hiermee zullen deeltjes bij een slechte koppeling niet goed focussen, waardoor het apparaat ongeschikt is wanneer hoogwaardige focusing of een snelle stroming cruciaal zijn voor de vereiste toepassing. Elke lijn in deze grafiek vertegenwoordigt scheidingsresultaten met behulp van verschillende polystyreendeeltjesgroottes en piëzo-aansturingsspanningen.In het algemeen zijn hogere voltages vereist om kleinere deeltjes te extraheren. Droge voltages kunnen echter niet onbeperkt worden verhoogd vanwege een grotere warmteafgifte en toenemende effecten van akoestische streaming. Om het nut van dit platform voor de scheiding van biologische deeltjes aan te tonen, werden menselijke Raji-cellen met een gemiddelde diameter van 8 tot 10 µm gespike met denguevirus met een geschatte diameter van 50 nm en vervolgens gescheiden met behulp van het akoestische microfluïdische apparaat.Zodra een dergelijk systeem is geassembleerd en geprogrammeerd, kunnen scheidingen routinematig in ongeveer vijf minuten worden uitgevoerd. Er kunnen ongeveer drie monsters per uur worden verwerkt, inclusief volledige reiniging en decontamination tussen de monsters. Na deze procedure kunnen andere methoden worden uitgevoerd, zoals celtelling, western blotting of next generation sequencing, om de zuiverheid van de scheiding te bevestigen en de biologische betekenis te ontrafelen.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een typisch microfluïdisch scheidingsapparaat vervaardigt. Gebruik verbindingen tussen de buitenwereld en de chip om aan te sluiten op hardware en voer een geautomatiseerde scheidingsprocedure op een precieze en robuuste manier uit. Vergeet niet dat werken met infectieuze materialen uiterst gevaarlijk kan zijn en alleen mag worden uitgevoerd door adequaat getraind personeel dat gebruikmaakt van de juiste, institutioneel voorgeschreven apparatuur en procedures voor biologische veiligheid.

a-microfluidic-platform-for-precision-small-volume-sample-processing

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Source: Choi, H. J., et al. Microfluidic Acoustophoresis for Flowthrough Separation of Gram-Negative Bacteria using Aptamer Affinity Beads. J. Vis. Exp. (2022)This video demonstrates the method of selectively separating Gram-negative bacteria from a mixed bacterial sample using aptamer-coated microbeads and acoustic forces within a microfluidic chip.

Aptamer-Assisted Acoustophoresis for Microfluidic Separation of Gram-Negative Bacteria

In deze video beschrijven we eerst de fabricage en de werking procedures van een surface acoustic wave (SAW) akoestische tegenstroom apparaat. Vervolgens tonen een experimentele situatie dat zowel stromingsvisualisatie kwalitatieve en kwantitatieve analyse van complexe stromen binnen de SAW pompinrichting.

Fabricage, bediening en Flow Visualization in Surface-akoestische-wave-driven Acoustic-tegenstroom Microfluidics

In dit artikel presenteren we een microfluïdische chip voor single cell analyse. Het maakt de kwantificering van intracellulaire eiwitten, enzymen, cofactoren, en tweede boodschappers via fluorescentie assays of immunoassays.

Een Microfluïdische Chip voor de Versatile chemische analyse van enkele cellen

Hier demonstreren we een eenvoudige productiemethode voor grootte-controleerbare, monodisperse, water-in-olie (W/O) microdruppeltjes met behulp van een capillair-gebaseerd centrifugaal microfluïdisch apparaat. Deze methode vereist slechts een klein monstervolume en maakt hoogwaardige productie mogelijk. We verwachten dat deze methode nuttig zal zijn voor snelle biochemische en cellulaire analyses.

-Capillaire gebaseerde centrifugale microfluïdische apparaat voor Grootte-controleerbare Vorming van Monodisperse microdruppels

Acoustofluidic apparaten maken gebruik van ultrasone golven binnen microfluïdische kanalen te manipuleren, te concentreren en te isoleren geschorst micro- en nanoscopische entiteiten. Dit protocol beschrijft de vervaardiging en werking van een dergelijk apparaat dat bulk akoestische staande golven deeltjes centrale stroomlijn richten zonder de hulp van de ommanteling vloeistoffen.

Fabricage en werking van Acoustofluidic Devices Ondersteunend Bulk Acoustic Staande golven voor Sheathless scherpstellen van Deeltjes

Hier presenteren we een protocol voor het isoleren en kweken van enkele cellen met een microfluïdische platform, dat een nieuw microwell-ontwerpconcept gebruikt om hoogwaardige isolatie van enkele cellen en langdurige klonale kweek mogelijk te maken.

Een microfluïdische platform voor High-throughput Single-cell Isolatie en Cultuur

We tonen een microfluïdische platform met een geïntegreerde oppervlakte-elektrode netwerk resistieve pulse sensing (RPS) met code division multiple access (CDMA) combineert, om detectie en afmeting van deeltjes in meerdere microkanalen multiplexen.

Microfluïdische Platform met multiplexverzending elektronische detectie voor ruimtelijke Tracking van Deeltjes

Een protocol voor het manipuleren van de deeltjes in een microfluidic-kanaal met de excitatie van een dual-frequentie wordt gepresenteerd.

Microparticle manipulatie door permanent oppervlakte akoestische golven met Dual-frequentie excitaties

Dit protocol beschrijft de assemblage en werking van een goedkoop acoustofluidisch apparaat voor snelle moleculaire levering aan cellen via sonoporatie geïnduceerd door ultrasone contrastmiddelen.

Assemblage en werking van een Acoustofluidic-apparaat voor verbeterde levering van moleculaire verbindingen aan cellen

Dit artikel beschrijft de fabricage en werking van microfluïdische acoustophoretische chips met behulp van de microfluïdische acoustophoresis-techniek en aptamer-gemodificeerde microbeads die kunnen worden gebruikt voor snelle, efficiënte isolatie van Gram-negatieve bacteriën uit een medium.

Microfluïdische Acoustophorese voor flowthrough scheiding van gramnegatieve bacteriën met behulp van Aptamer Affinity Beads

Het huidige protocol beschrijft een pneumatisch microfluïdisch platform dat kan worden gebruikt voor een efficiënte microdeeltjesconcentratie.

Pneumatisch aangedreven microfluïdisch platform voor microdeeltjesconcentratie

Leer geautomatiseerde deeltjesscheiding met een akoestisch microfluïdisch apparaat voor biomedische toepassingen. Deze methode biedt precisie, modulariteit en minimaliseert analyetverlies bij kleine volumes.

Een microfluïdische platform voor Precision Small-volume monster verwerking en het gebruik ervan te Grootte Aparte Biologische Deeltjes met een akoestische microdevice (Video) | JoVE Journal

Een microfluïdische platform voor Precision Small-volume monster verwerking en het gebruik ervan te Grootte Aparte Biologische Deeltjes met een akoestische microdevice

Meer video's verkennen