Een microfluïdische platform voor Precision Small-volume monster verwerking en het gebruik ervan te Grootte Aparte Biologische Deeltjes met een akoestische microdevice

Het algemene doel van deze procedure is het uitvoeren van geautomatiseerde scheidingen van kleine volumes partikels met behulp van een microfluïdisch fotisch apparaat. Deze methode kan cruciale procedures in het veld van de biomedische techniek mogelijk maken, waaronder robuuste verwerking en scheiding van monsters voor bio-detectie en klinische onderzoeksapplicaties. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn modulariteit, precisie, robuustheid en automatisering, waardoor deze niet alleen aanpasbaar en flexibel is voor reticulocytenscheiding, maar voor een breed scala aan flow-through microfluïdische scheidingsapparaten.

We erkenden eerst de noodzaak van deze mogelijkheid om routinematig en betrouwbaar scheidingen uit te voeren op biologische monstervolumes van minder dan een millimeter, zonder significante verdunning of verlies van de analyt. De integratie van monstermeting en geautomatiseerde routering van de bron naar de opvangbestanden, samen met standaard operaties van de spuitpomp, is cruciaal om op deze schaal succesvol te kunnen werken. Begin met het ontwerpen van het akoestische reticulatieapparaat en de lay-out voor de twee fotomaskers, zoals beschreven in sectie één van het bijbehorende tekstprotocol.

Breng vervolgens het patroon van de vloeistofpoorten aan op de achterzijde van een dubbelzijdig gepolijste 1 0 0 siliciumwafer. Gebruik standaard positieve resist-fotolithografie en ets deze geometrie met behulp van deep reactive ion etching tot een diepte van 350 tot 400 micrometer. Draai daarna de wafer om en breng het patroon van de vloeistofkanaalgeometrie aan op de voorzijde.

Pas opnieuw standaard fotolithografie met een positieve resist toe en bevestig de gepatroonde wafer vervolgens aan een tweede blanco siliconen dragerwafer. Ets nu met behulp van fotolak de blootgestelde kanalen tot een diepte van 200 micrometers. Gebruik hiervoor deep reactive ion etching en week de device-wafer vervolgens in een resist-striploesing om deze van de blanco siliconen wafer te scheiden.

Reinig vervolgens de device-wafer en een kenmerkloze borosilicaatglas-wafer van 0,5 millimeter dik met piranha-oplossing. Nadat deze gereinigd zijn, worden de vloeistofkanalen afgedicht door de glas- en siliciumwafer ionisch te binden volgens de hier getoonde condities. Snijd tot slot de individuele chips uit elkaar met een diamantzaagblad op een dicing-zaag met een twee-componenten epoxykit met lage viscositeit.

Weeg de aanbevolen verhouding van beide componenten af en meng ze grondig. Plaats vervolgens het loodzirkonaattitanaat of PCT-piëzokeramiek in een geschikte mal en gebruik een pipet om ongeveer 10 µL van het epoxymengsel gelijkmatig over het oppervlak te verspreiden om een dunne, egale laag te creëren. Plaats daarna de chip in de mal en lijn de epoxyzijde van het piëzokeramiek uit met de microfluïdische chip.

Het kan nodig zijn om de chip met tape vast te zetten om deze op zijn plaats te houden tijdens het uitlijnen. Klem de assemblage in een bankschroef, waarbij u er op let dat er geen componenten barsten, en hanteer de temperatuur en duur die door de fabrikant van de epoxy worden aanbevolen. Nadat de epoxy is uitgehard, gebruikt u een soldeerbout met een fijne punt om dunne draden aan elke zijde van de piëzokeramiek te bevestigen.

Gebruik indien nodig het geschikte vloeimiddel om het pizo-oppervlak voor te bereiden. Zorg voor het kortst mogelijke contact met de pizo om thermische depolarisatie te voorkomen. Bevestig de chip aan een fluidisch breadboard met behulp van klembeugels.

Bevestig daarnaast een koelventilator aan het breadboard om de temperatuur tijdens akoestische experimenten te reguleren. Schroef vervolgens de chip vast aan de world-connectoren. Monteer het breadboard op de microscooptafel en verbind de world-to-chip-connectoren met aanvullende slangen bij de in- en uitlaten.

Gebruik standaard 1/4"-28draadkoppelingen. Verbind de microfluïdische chip via 1/16" buisjes met de spuitpomp, door de computer aangestuurde multiport-selectieventielen, de op de pc aangesloten debietmeters en de buisjes zoals hier getoond en beschreven in figuur vier van het bijbehorende tekstprotocol. Vul vóór het uitvoeren van de scheiding de reservoirs met reinigingsreagens en spoel de bijbehorende vloeistoflijnen door.

Stel daarnaast kleppen drie en vier bij de uitgangen van de chip zo in dat de stroom aanvankelijk naar de afvalreservoirs loopt. Zet vervolgens de koelventilator aan. Verbind de leidingen van de piëzokeramiek met de vermogensversterker en stel de functiegenerator in op de resonantiefrequentie van de gebruikte akoestische chip.

Stel het spanningssetpunt op de functiegenerator zo in dat de RF-versterker tussen de 12 en 25 volt piek-tot-piek uitstoot, afhankelijk van de gewenste scheiding. Sluit vervolgens de juiste opvangbuisjes en het buffer-inlaatbuisje aan op het systeem. Gebruik de monsterbuffer die geschikt is voor de te scheiden cellen of partikels, of zoals vereist door de analyse-assay die na de scheiding zal worden gebruikt.

Laad vervolgens de aansturingssoftware en gebruik deze om de kleppen, debietsensoren en pomp te bedienen om de volledig automatische prime- en scheidingsroutine uit te voeren. Vortex het monsterbuisje kort vlak voor het starten van de scheidingsprocedure om eventuele bezonken deeltjes opnieuw te suspenderen. Pipetteer het monster alternatief 10 keer op en neer om biologische monsters te mengen die gevoeliger zijn voor beschadiging of klonteren door vortexen.

Bevestig vervolgens het monsterbuisje aan de invoerlijn en start onmiddellijk de routine voor het ontluchten en scheiden. Begin met het gebruiken van de software om de luchtinlaat van klep één en twee te ontluchten, zodat er geen vloeistof in de slang aanwezig is. Ontlucht gelijktijdig de slang die het buffer-invoerbuisje met klep twee verbindt en de slang die het monster-invoerbuisje met klep één verbindt.

Laat de spuitpomp ongeveer 15 µL uit beide vials opzuigen om de slang volledig te vullen en deze met de kleppen te verbinden. Zet vervolgens klep één en twee op afval om eventuele overtollige vloeistof of lucht die in de laadspiraal is gekomen, te verwijderen. Stel daarna het programma in om de monsterspiraal te laden door eerst 25 µL lucht op te zuigen met een snelheid van 50 µL per minuut.

Laad vervolgens 250 µL monster met een snelheid van 200 µL per minuut, gevolgd door 35 µL leidingsbuffer met 200 µL per minuut, en tot slot nogmaals 25 µL lucht met 50 µL per minuut. Stel daarna de spuitpompen zo in dat de geladen vloeistofpluggen met 100 µL per minuut worden geïnfuseerd en monitor de stroomsnelheden bij de uitlaten voor kleine en grote deeltjes met behulp van stroomsensoren. De juiste stroomverhouding kan worden bepaald zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol.

Wanneer de flowsensoren een piek in de stroomsnelheid detecteren die duidt op het passeren van de eerste luchtkloof, schakelt u de overeenkomstige uitgangsklep van het afvalbuisje naar een monsteropvangbuisje. Zorg ervoor dat de stroming stabiel is terwijl het monster door de chip beweegt en gescheiden wordt, door de oders van de flowsensoren te observeren. Terwijl het monster door de chip stroomt, worden de gescheiden fracties opgevangen bij de uitgangskleppen.

Observe aan het einde van de monsterplug de flowsensor en detecteer de tweede luchtspleet. Schakel op dit punt de uitgangskleppen terug naar afval. Nadat het volledige volume is gedispenseerd, stopt u de infusie van de spuitpomp en beëindigt u de automatiseringsroutine.

Nadat het scheidingsexperiment is voltooid, koppelt u de opvangflesjes voor de kleine en grote partikelmonsters los en bewaart u deze op de juiste wijze voor latere analyse. Plaats de monsteropnamebuis in lege flesjes om overtollige reinigingsoplossingen op te vangen die door de buisjes worden gespoeld. Start vervolgens de geautomatiseerde reinigingsprocedure van het systeem zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol.

Tijdens dit proces zal het programma de kleppen en de spuitpomp aansturen om de holdcoil opeenvolgend te vullen met reinigingsreagentia en deze door het systeem te spoelen. Zodra het geautomatiseerde reinigings- en decomcontaminatieproces is voltooid, moeten de overtollige spoeloplossingen en de vials waarin ze zijn opgevangen worden afgevoerd volgens de geldende procedures voor het hanteren van biologisch of chemisch afval. Hier wordt een representatieve frequentiescan getoond van een goed gekoppelde piezo en microfluidisch apparaat.

Wanneer de koppeling tussen de piëzo en het microfluïdische apparaat goed is, focussen de deeltjes strak bij de resonantiefrequentie, wat resulteert in een duidelijke piek in de fluorescentie-intensiteit en migratie naar de verwachte focuspositie. In contrast hiermee zullen deeltjes bij een slechte koppeling niet goed focussen, waardoor het apparaat ongeschikt is wanneer hoogwaardige focusing of een snelle stroming cruciaal zijn voor de vereiste toepassing. Elke lijn in deze grafiek vertegenwoordigt scheidingsresultaten met behulp van verschillende polystyreendeeltjesgroottes en piëzo-aansturingsspanningen.

In het algemeen zijn hogere voltages vereist om kleinere deeltjes te extraheren. Droge voltages kunnen echter niet onbeperkt worden verhoogd vanwege een grotere warmteafgifte en toenemende effecten van akoestische streaming. Om het nut van dit platform voor de scheiding van biologische deeltjes aan te tonen, werden menselijke Raji-cellen met een gemiddelde diameter van 8 tot 10 µm gespike met denguevirus met een geschatte diameter van 50 nm en vervolgens gescheiden met behulp van het akoestische microfluïdische apparaat.

Zodra een dergelijk systeem is geassembleerd en geprogrammeerd, kunnen scheidingen routinematig in ongeveer vijf minuten worden uitgevoerd. Er kunnen ongeveer drie monsters per uur worden verwerkt, inclusief volledige reiniging en decontamination tussen de monsters. Na deze procedure kunnen andere methoden worden uitgevoerd, zoals celtelling, western blotting of next generation sequencing, om de zuiverheid van de scheiding te bevestigen en de biologische betekenis te ontrafelen.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een typisch microfluïdisch scheidingsapparaat vervaardigt. Gebruik verbindingen tussen de buitenwereld en de chip om aan te sluiten op hardware en voer een geautomatiseerde scheidingsprocedure op een precieze en robuuste manier uit. Vergeet niet dat werken met infectieuze materialen uiterst gevaarlijk kan zijn en alleen mag worden uitgevoerd door adequaat getraind personeel dat gebruikmaakt van de juiste, institutioneel voorgeschreven apparatuur en procedures voor biologische veiligheid.