Een microfluïdische platform voor Precision Small-volume monster verwerking en het gebruik ervan te Grootte Aparte Biologische Deeltjes met een akoestische microdevice
23 november 2015
Dit protocol beschrijft een systeemarchitectuur voor het uitvoeren van geautomatiseerde scheidingen van kleine volumes (0,15–1,5 ml) deeltjes met behulp van een microfluïdisch apparaat, en bespreekt methoden om de prestaties en werking van acoustofluïdische apparaten te optimaliseren.
Het algemene doel van deze procedure is om geautomatiseerde kleine volume deeltjesscheidingen uit te voeren met behulp van een microfluïdisch fotonisch apparaat. Deze methode kan belangrijke procedures in het veld van biomedische techniek mogelijk maken, inclusief robuuste verwerking en scheiding van monsters voor biodetectie en klinische onderzoekstoepassingen. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn modulariteit, precisie, robuustheid en automatisering, waardoor het aanpasbaar en flexibel is, niet alleen voor retic-scheiding, maar ook voor een grote verscheidenheid aan doorstromende microfluïdische scheidingsapparaten.
We herkenden als eerste de behoefte aan deze mogelijkheid om routinematig en betrouwbaar scheidingen uit te voeren op sub-millimeter biologische monstervolumes zonder significante verdunning of verlies van analyt. De integratie van monstermeting en geautomatiseerde routering van bron naar verzamelbestanden samen met standaard spuitpompbewerkingen is essentieel om succesvol op deze schaal te werken. Om te beginnen met het ontwerpen van het akoestische retic-apparaat en het lay-out voor de twee fotomaskers zoals beschreven in sectie een van het bijbehorende tekstprotocol.
Patroon vervolgens de vloeistofpoorten aan de achterkant op een dubbelzijdig gepolijste 1 0 0 siliciumwafer. Gebruik standaard positieve resist fotolithografie om deze geometrie te etsen met behulp van diep reactieve ionen etsen tot een diepte van 350 tot 400 micrometer. Draai vervolgens de wafer om en patroon de geometrie van de vloeistofkanaal aan de voorkant.
Gebruik opnieuw standaard positieve resist fotolithografie, monteer vervolgens de gepatroneerde wafer op een tweede lege siliciumdragerwafer. Gebruik fotoresist om nu de blootgestelde kanalen te etsen tot een diepte van 200 micrometer. Gebruik diep react ion etsen en week vervolgens de apparaatwafer in een resiststripoplossing om deze van de lege siliciumwafer te verwijderen.
Reinig vervolgens de apparaatwafer en een 0,5 millimeter dikke borosilicaatglaswafer zonder functies met behulp van piranha-oplossing. Eenmaal schoon, verzegel de vloeistofkanalen door de glas- en siliciumwafer ionisch te verbinden met behulp van de hier getoonde omstandigheden. Snijd ten slotte de afzonderlijke chips uit met een diamantzaad op een snijwiel vanuit een tweecomponenten laagviscositeits epoxykit.
Weeg het aanbevolen verhouding van beide componenten af en meng ze grondig. Plaats vervolgens de lead Zirkin acht titanaat of PCT piezo keramiek in een geschikte jig en gebruik een pipet om ongeveer 10 microliters van het epoxymengsel gelijkmatig erover te verspreiden om een dunne gelijkmatige laag te creëren. Plaats vervolgens de chip in de jig en lijn de epoxykant van de pizo keramiek uit met de microfluïdische chip.
Het kan nodig zijn om de chip met tape vast te zetten om hem op zijn plaats te houden tijdens het uitlijnen. Klem de assemblage in een vice en zorg ervoor dat geen van de componenten barst en laat de temperatuur en duur rijpen die worden aanbevolen door de epoxyfabrikant. Nadat de epoxy is uitgehard, gebruik een fijne punt soldeerbout om fijne draadleidingen aan elke kant van de pizo keramiek te bevestigen.
Gebruik indien nodig het juiste flux om het pizo-oppervlak voor te bereiden. Zorg ervoor dat u de kortst mogelijke contacttijd met de pizo maakt om thermische depolarisatie te voorkomen. Bevestig de chip aan een fluidische breadboard met behulp van klemvoorzieningen.
Bevestig ook een koelventilator aan het breadboard om de temperatuur tijdens akoestische experimenten te regelen. Schroef vervolgens de chip op wereldconnectors. Monteer het breadboard op de microscoopstandaard en sluit de wereld-chipconnectoren aan op extra buizen bij de in- en uitlaten.
Gebruik standaard kwart 28 draadverbindingen. Voor één 16e inch buis, verbind de microfluïdische chip met de spuitpomp, computergestuurde multipoort selectiekleppen, PC-interface stroomsnelheidmeters en buizen zoals hier getoond en beschreven in figuur vier van het bijbehorende tekstprotocol. Vul vóór het uitvoeren van de scheiding de reservoirs met reinigingsreagens en prime hun overeenkomstige vloeistoflijnen.
Stel ook kleppen drie en vier bij de chipuitlaten in om in eerste instantie naar de afvalreservoirs te stromen. Schakel vervolgens de koelventilator in. Verbind de pizo keramiekleidingen met de versterker en stel de functiegenerator in op de resonantiefrequentie voor de akoestische chip die wordt gebruikt.
Pas het spanningssetpunt op de functiegenerator aan zodat de RF-versterker uitgangen tussen 12 en 25 volt piek-piek produceert, zoals geschikt voor de gewenste scheiding. Verbind vervolgens de geschikte verzamelbuisjes en de bufferinvoerbuis met het systeem. Gebruik de monsterbuffer die geschikt is voor de cellen of deeltjes die moeten worden gescheiden of zoals vereist door de analysemethode die na de scheiding moet worden gebruikt.
Laad vervolgens de besturingssoftware en gebruik deze om de kleppen, stroomsnelheidssensoren en pomp te bedienen om de volledig automatische prime- en scheidingsroutine uit te voeren. Vlak voor het starten van de scheidingsprocedure, draai de monsterbuis even door elkaar om eventuele deeltjes die zijn bezonken opnieuw te suspenderen. Pipet alternatief het monster 10 keer op en neer om biologische monsters te mengen die vatbaarder zijn voor schade of clumping door draaien.
Bevestig vervolgens de monsterbuis aan de invoerlijn en start de prime- en scheidingsroutine zonder vertraging. Begin door de software te gebruiken om de luchtinlaat van kleppen een en twee te primen om ervoor te zorgen dat de buizen geen vloeistof bevatten. Prime tegelijkertijd de buizen die de bufferinvoerbuis met klep twee en de monsterinvoerbuis met klep een verbinden.
Laat de spuitpomp ongeveer 15 microliters uit beide flesjes trekken om de buizen volledig te vullen en ze met de kleppen te verbinden. Schakel vervolgens kleppen een en twee over naar afval om eventueel overtollig vocht of lucht dat in de laadspiraal is gekomen te verdrijven. Stel vervolgens het programma in om de monsterspiraal te laden door eerst 25 microliters lucht af te trekken bij 50 microliters per minuut.
Laad vervolgens 250 microliters monster bij 200 microliters per minuut, gevolgd
Overzicht
Dit protocol beschrijft een systeemarchitectuur voor geautomatiseerde deeltjesscheiding in kleine volumes met behulp van een microfluïdisch apparaat. Het benadrukt methoden om de prestaties en werking van acoustofluidische apparaten te verbeteren.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Biomedische techniek
- Microfluidica
- Technieken voor deeltjesscheiding
Achtergrond
- De noodzaak van betrouwbare scheiding van submillimeter biologische monsters.
- Belang van minimalisering van verdunning en verlies van analyt.
- Integratie van monstermeting en geautomatiseerde routing.
- Gebruik van standaard spuitpompbewerkingen voor efficiëntie.
Doel van de studie
- Om een methode voor geautomatiseerde deeltjesscheiding te ontwikkelen.
- Om de robuustheid en precisie van microfluïdische apparaten te verbeteren.
- Om klinische onderzoekstoepassingen te vergemakkelijken door verbeterde monsterverwerking.
Gebruikte methoden
- Ontwerp en fabricage van een akoestisch retic-apparaat.
- Fotolithografie voor kanaalgeometrie-patronering.
- Integratie van piëzo-keramiek voor akoestische manipulatie.
- Geautomatiseerde controle van vloeistofsystemen voor monsterscheiding.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle implementatie van geautomatiseerde deeltjesscheiding.
- Gedemonstreerde modulariteit en precisie in de werking van het apparaat.
- Effectieve verwerking van kleine monstervolumes zonder verlies.
- Validatie van de methode voor verschillende microfluïdische toepassingen.
Conclusies
- Het ontwikkelde protocol verbetert de efficiëntie van deeltjesscheidingen.
- Acoustofluidische apparaten kunnen worden geoptimaliseerd voor verschillende toepassingen.
- Deze methode ondersteunt vooruitgang in biomedisch onderzoek.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This microfluidic platform enables precise, automated processing of small-volume biological samples (0.15–1.5 mL), reducing reagent waste and preserving precious analytes in early discovery workflows. By integrating modular device design with closed-loop fluid handling, it supports robust, reproducible particle separation—critical for target validation and assay development where sample integrity directly impacts data quality. The system’s adaptability to various microfluidic devices, including acoustofluidic chips, allows seamless integration into discovery pipelines requiring high-confidence, low-input separations for mechanistic de-risking and lead identification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating specific biological particles (e.g., cells, viruses) from complex mixtures without significant dilution or loss.
- Operational Value: Supports functional target validation through precise size-based separation, clarifying pathway involvement and reducing mechanistic ambiguity in early-stage targets.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by generating reliable separation data that informs go/no-go decisions based on particle purity and yield.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological subsystems for downstream assays by concentrating target particles and removing interferents, improving signal-to-noise in detection assays.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via automated, closed-loop sample processing, priming, and cleaning cycles that minimize variability between runs.
- Scalability: Facilitates screening readiness through modular chip exchange and consistent world-to-chip connections, enabling platform reuse across multiple separation targets.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains sample integrity from discovery through preclinical validation by enabling concentration of rare biological particles (e.g., circulating cells, viral particles) for biomarker analysis.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports data-driven decisions by providing quantitative, reproducible separation outputs that correlate with biological relevance and reduce false positives in preclinical models.
- Mechanistic De-risking: When applied to disease-relevant systems, helps isolate pathogenic particles to clarify mechanism of action and de-risk translational candidates.
Pipeline & Workflow Integration
The platform integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical studies, particularly where low-volume, high-purity particle separation is required for downstream analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling precise isolation of biological particles (e.g., Raji cells, dengue virus) from heterogeneous samples.
- Screening: Delivers assay-ready samples through automated, reproducible fluid handling that ensures consistent particle separation and collection.
- Analytics: Generates quantitative outputs (e.g., flow rate spikes, particle fractionation) monitored via integrated flow sensors, enabling objective comparison of separation conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by concentrating low-abundance biological particles (e.g., viral particles spiked into cells) for subsequent validation via cell counting, Western blotting, or sequencing.
- Enterprise Reuse: Designed as a reusable capability—modular architecture allows rapid device exchange and standardized operation across teams and projects without re-optimization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through precise, size-based particle separation.
- Operational Value: Delivers standardization, reproducibility, and scalability via automated priming, separation, and cleaning routines that ensure consistent performance across runs.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling reliable, low-input separations that de-risk biological targets early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by generating high-fidelity separation data that informs advancement decisions based on particle purity and yield.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication, photolithography, and acoustic transducer integration.
- Depends on instrumentation including syringe pumps, multiport valves, flow sensors, function generators, power amplifiers, and temperature control (cooling fan).
- Necessitates cross-team standardization of world-to-chip connections, fluidic tubing, and valve programming for reproducible operation.
- Involves adaptation considerations when applying to different biological systems (e.g., cell types, particle sizes) due to varying acoustic properties and optimal driving voltages.
- Practical limitations include thermal management during prolonged acoustic operation and the need for careful handling of piezo ceramics to avoid depolarization.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:04
Cleanroom Fabrication of Microfluidic Chips for Acoustophoresis
2:32
Piezo Transducer Attachement
3:51
Separation Procedure
8:26
Automated Cleaning and Decontamination
9:08
Results: Size Separation of Biological Particles Using an Acoustic Microdevice
10:24
Conclusion
