Het beoordelen van veranderingen in synaptische plasticiteit met behulp van een wakker gesloten-hoofdletselmodel van mild traumatisch hersenletsel

Dit protocol biedt een duidelijke methode om hoogwaardige transversale hippocampusplakken te produceren van r-mTBI-toegediende dieren met het AIA-model. Het ACHI-model veroorzaakt lichte verwondingen. Het gaat niet om schedelbreuken of bloedingen, craniotomieën of het gebruik van verdovingsmiddel.

Bovendien zorgt het voor stabiele elektrofysiologische opnames. Deze technieken maken het mogelijk om de veranderingen in synaptische plasticiteit na herhaalde MTBI te onderzoeken, waarvan de etiologie enorm onbekend is, met het potentieel om therapeutische wegen te informeren. De procedure wordt gedemonstreerd door Allyson Gross, een masterstudent voor mijn laboratorium, en Dr. Eric Eyolfson, een postdoctoraal fellow.

Begin met het plaatsen van de rat in een fixatiekegel, zorg ervoor dat de snuit en neusgaten zich dicht bij de kleine opening van de kegels bevinden om voldoende ventilatie mogelijk te maken. Voorkom de beweging van de rat door de kegel aan het caudale uiteinde gesloten te houden met een plastic haarclip. Plaats de helm handmatig over de middellijn van de ingehouden rat met de richtschijf over de linker pariëtale kwab.

Plaats vervolgens de rat op het schuimkussen voordat u het botslichaam handmatig in de uitschuifpositie zet. Laat de punt van het botslichaam handmatig zakken om contact te maken met de doelschijf op de helm. Stel vervolgens het botslichaam in de intrekpositie in om het botslichaam 10 millimeter boven de helm te laten terugtrekken.

Gebruik de draaiknop op de stereotaxische arm om de impactpunt met 10 millimeter te verlagen om de richtschijf op de helm opnieuw aan te raken. Draai vervolgens de impactschakelaar om zodat het hoofd van het dier snel wordt versneld met zes meter per seconde gedurende 10 millimeter. Zodra het apparaat is geactiveerd, verwijdert u het dier onmiddellijk uit de fixatiekegel om een onmiddellijk neurologisch beoordelingsprotocol of NAP uit te voeren.

Na het euthanaseren van de muis, ontleed je de hersenen en plaats je deze op een bevochtigd filterpapier op een omgekeerde petrischaal. Verwijder met behulp van een scherp scalpel het cerebellum en de prefrontale cortex om de hersenen te bevuilen. Scheid de twee hemisferen door de middellijn van de hersenen af te snijden.

Om dwarse hippocampussegmenten te maken, plaatst u één halve bol op het mediale oppervlak, kantelt u het scalpel ongeveer 30 graden naar binnen en verwijdert u een dun plakje van het dorsale oppervlak van de hersenen om een plat oppervlak te bieden voor montage op de zuiger. Draai de hersenen op het dorsale oppervlak en dep het hersenweefsel voorzichtig op droog filterpapier om overtollige ACSF te verwijderen. Bevestig vervolgens het dorsale oppervlak van de hersenen aan de zuiger met behulp van cyanoacrylaatlijm, waardoor het ventrale oppervlak rechtop blijft staan.

Strek de buitenste buis van de zuiger uit over de hersenen en giet de vloeibare agarose in de buis totdat de hersenen volledig bedekt zijn. Stollen de agarose snel door een koelblok over de zuigerbuis te klemmen. Plaats de zuiger in de kamer van de snijmachine en zet de kamer vast met een schroef.

Nadat u het mes hebt vastgezet, voegt u ijskoude zuurstofrijke ACSF toe aan de snijkamer. Stel op de snijmachine de snijsnelheid in op vier, oscillatie op zes en zet de continue enkele snijschakelaar op Continu. Druk vervolgens op Start om te beginnen met het segmenteren van de hersenen op 400 micrometer.

Terwijl de snijmachine de hersenen doorsnijdt, gebruikt u een Pasteur-pipet met een grote diameter om elke plak over te brengen naar het herstelbad van zuurstofrijke ACSF. Laat de plakjes 30 minuten herstellen bij 32 graden Celsius en laat ze dan nog eens 30 minuten herstellen bij kamertemperatuur. Herhaal deze stappen om segmenten van de tweede hemisfeer te maken.

Gebruik een in de handel verkrijgbare micropipettrekker om opname-elektroden van één tot twee megaohm te trekken uit 10 centimeter borosilicaatglazen haarvaten met een buitendiameter van 1,5 millimeter en een binnendiameter van 1,1 millimeter. Gebruik een Pasteur-pipet en breng een hippocampusschijf over van het herstelbad naar de kamer die wordt doordrenkt met gecarbodaneerde ACSF en op 30 graden Celsius wordt gehouden. Oriënteer de hersenschijf zo dat de gyrus dentate en de korrelcellaag zichtbaar zijn in het gezichtsveld.

Gebruik een rechtopstaande microscoop om de gyrus dentate met schuine optiek te visualiseren. Plaats een concentrische bipolaire stimulerende elektrode om het mediale perforente pad, of MPP-vezels, in het middelste derde deel van de moleculaire laag te activeren. Plaats vervolgens een glazen micropipet gevuld met ACSF in de MPP.

Begin met de elektroden verder uit elkaar, omdat het aanraken van het weefsel de vezels zal beschadigen. Zodra de stimulerende en opname-elektroden zijn geplaatst, visualiseert u de opgeroepen veldreacties met behulp van een versterker, een digitizer en opnamesoftware. Zoek een geschikte veld-exciterende postsynaptische potentiaal, of veld-EPSP, door het weefsel te stimuleren met stroompulsen en te zorgen voor een minimale amplitude van 0,7 millivolt met een heldere vezelvolley kleiner dan de veld-EPSP.

Verhoog en stel de simulerende intensiteit in totdat de veld-EPSP op 70% van de maximale amplitude staat. Stel vervolgens een stabiele voorconditioneringsbasislijn vast gedurende 20 minuten met pulsen van 0,12 milliseconde die worden afgeleverd bij 0,067 hertz. Voor een stabiele slice moet de initiële helling van de fEPSP minder dan 10% variabiliteit zijn en moet de helling van de lijn van de beste pasvorm door het uitgezette veld EPSP-hellingen minder dan 0,5 zijn.

Bepaal de veranderingen in synaptische basiseigenschappen met behulp van gepaarde pulsstimuli en construeer stimulus / respons input / output-curven. Pas voor de gepaarde pulstest een reeks gepaarde pulsen toe met een interpulsinterval van 50 milliseconden bij 0,033 hertz. Pas voor de input/outputcurven een reeks toenemende stimulusintensiteiten toe van 0,0 tot 0,24 milliseconden bij 0,033 hertz om de verandering van de EPSP-responsgrootte in het veld uit te zetten.

Om langdurige depressie te bestuderen die voornamelijk afhankelijk is van de activering van de CB1-receptor, gebruikt u 6.000 pulsen bij 10 hertz. Voor postconditioneringsopnamen hervat u nog eens 60 minuten met behulp van single-pulse stimulaties van 0,12 milliseconden met een frequentie van 0,067 hertz. Na de postconditioneringsopname dient u de gekoppelde pulsstimuli toe, gevolgd door een input / output-curve.

Vergelijk deze met basislijnopnamen met waargenomen veranderingen in presynaptische afgifte-eigenschappen en beoordeel de gezondheid van de slice voor langetermijnopnamen. Houd u tijdens de analyse aan de uitsluitingscriteria voor het bepalen van de gegevensretentie van afzonderlijke segmenten in de presynaptische plasticiteitsgegevensset. Sluit segmenten uit met een grote helling in een lijn met epsp-hellingen die het beste passen bij het veld tijdens de basislijn vóór de conditionering, instabiliteit in de basislijn vóór de conditionering en instabiliteit in de periode na de conditionering.

Bij baseline toonde het neurologische beoordelingsprotocol, of NAP-scores, geen verschil tussen schijn- en herhaalde mTBI-ratten. Na alle wakkere sessies met gesloten hoofdletsel vertoonden de herhaalde mTBI-ratten significante stoornissen binnen de NAP-taken in vergelijking met shams, wat aangeeft dat subtiele maar significante gedragstekorten werden geproduceerd. Een reeks gepaarde pulsen werd toegediend en de verhouding van de grootte van het tweede veld-EPSP werd berekend ten opzichte van het EPSP van het eerste veld.

De gepaarde pulsverhoudingen verschilden niet tussen schijn- en herhaalde mTBI-ratten, waaruit bleek dat herhaalde mTBI-ratten de basale synaptische fysiologie in de MPP-invoer naar de gyrus dentate niet veranderden. Wanneer een protocol van 10 hertz werd toegediend om een langdurige depressie te induceren, was er een tijdelijke maar significante afname van de capaciteit van de MPP-input aan de gyrus dentate om langdurige depressie te ondersteunen op de eerste dag na het letsel. Op dag zeven na de verwonding vertoonden plakjes van schijn- en herhaalde mTBI-dieren echter een equivalente langdurige depressie, hoewel er een indicatie was van een lichte trend voor herhaalde mTBI-dieren om een toename van langdurige depressie te vertonen.

Het vooraf plannen van het dissectie- en snijproces is van cruciaal belang voor het succesvol creëren van levensvatbare hippocampussegmenten en het verkrijgen van stabiele elektrofysiologische opnames. Deze procedure creëert een stabiel experimenteel platform dat kan worden gebruikt om TBI-pathofysiologie te onderzoeken en nieuwe therapeutische wegen te ontwikkelen. De beweging van het verwijderen van de hersenen naar het positioneren ervan om in de gecomprimeerde film te snijden voor transversale hippocampussegmenten is belangrijk, net als de nauwkeurige plaatsing van elektroden in de gyrus dentate.